不同采后處理對冷藏‘南豐蜜桔’角質層形態結構及化學組成的影響

陳 晟，葛 帥，羅耀華，楊綠竹，何 雙，王蓉蓉，丁勝華,

（1.湖南大學研究生院隆平分院，湖南長沙 410125；

2.湖南省農業科學院農產品加工研究所，湖南長沙 410125；

3.湖南農業大學食品科學技術學院，湖南長沙 410128）

角質層作為植物與環境接觸的第一道外部屏障，已被證明在植物免受干旱脅迫、過度紫外線輻射、機械損傷以及微生物侵染等方面發揮重要生理作用[1]。除了保護作用外，角質層還參與調節植物的生長，保護根的分生組織和促進側根的發育[2]。角質層在結構上主要由角質和蠟質組成，角質是一種由羥基脂肪酸組成通過酯鍵連接的聚酯化合物[3]；蠟質可分為表皮外蠟和內蠟，表皮外蠟以晶體形式沉積在角質層外表面，主要是由不同比例的烷烴、脂肪酸、酯、初級醇等脂肪族化合物組成[4-5]；而由烷烴、環氧脂肪酸、萜類、甾醇等主要化合物組成的表皮內蠟則鑲嵌在角質聚合物基質中[6]。

角質層是采后果實的質量調控器，其形態結構、化學組成及含量受采后貯藏條件因素的影響[7]。Chen等[8]比較了‘紅富士’和‘金冠’兩種蘋果在貨架期內角質層成分的動態變化，證明貯藏期間烷烴對抑制蘋果采后失水具有重要作用。Wang等[9]探討了‘庫爾勒香梨’在常溫、冷藏和氣調貯藏條件下表皮蠟質與貯藏品質特性的關系，發現冷藏和氣調貯藏條件能通過調控果實角質層蠟質形態結構和組分來延緩果實成熟和衰老。張靜等[10]發現‘溫州蜜柑’在貯藏期間表皮外蠟和角質單體含量分別呈先增后降和持續下降的變化趨勢，體外實驗表明外蠟可以促進指狀青霉菌絲的生長，而角質則能抑制該菌分生孢子萌發。Zhu等[11]也通過活體和離體實驗證明，柑桔果實蠟質均能顯著抑制指狀青霉菌落的擴展。此外，徐呈祥等[12-13]發現常溫和低溫下‘貢柑’和‘砂糖桔’的理化品質與蠟質含量、化學組成存在密切關聯，冷藏不僅能顯著抑制果實的失重率、腐爛率及細胞質膜相對透性的降低，還能有效保護果皮蠟質的減少和表面微形態結構的改變。

柑桔是我國重要的水果之一，2020年我國柑桔年產量達5121.90萬噸。‘南豐蜜桔’是我國地方的重要名特柑桔之一，年均產量達150萬噸，具有皮薄核少、酸甜適口、營養豐富等特點，但由于采后耐貯藏性差，導致采后損失嚴重[14-15]。多種環保便捷的采后保鮮手段被應用到柑桔采后商品化處理，且多集中在采后貯藏品質特性評價和微生物防控等方面。如熱激（heat shock，HT）被證明能降低柑桔果實呼吸強度和丙二醛含量，提高防御酶活性，進而延長采后貯藏期[16]；殼聚糖（chitosan，CS）可在柑桔果實表面形成透明薄膜，能夠降低果實呼吸強度、減少水分蒸騰和抵御微生物侵染[17]；熱激和殼聚糖聯合處理也被證明可于防控茂谷柑采后綠霉病[18]。然而，目前這些柑桔保鮮研究鮮有報道果實角質層的變化，且采后處理如何影響角質層形態結構及其化學組成尚不明晰。因此，本研究以‘南豐蜜桔’為研究對象，采用熱激、殼聚糖以及熱激聯合殼聚糖處理3種保鮮方式，設置對照組對比探究4 ℃冷藏過程中不同處理對‘南豐蜜桔’角質層形態結構及其化學組成的影響，旨在揭示角質層的演變規律，以期為‘南豐蜜桔’的貯藏保鮮提供科學支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

南豐蜜桔 選取成熟期的‘南豐蜜桔’ ，于2020年11月采自湖南省郴州市臨武縣蓮塘村果園，果實采后立即運往實驗室冷庫在（4±0.5） ℃下預冷24 h。挑選果形端正、大小勻稱、表面顏色相近、外觀完整無損傷的‘南豐蜜桔’，用干布擦凈后隨機分為4組備用；殼聚糖（食品級） 濟南海得貝海洋生物工程有限公司；三氯甲烷、乙酸、碳酸氫鈉、無水硫酸鈉（均為分析純）、正二十四烷（色譜純） 國藥集團化學試劑有限公司；14%三氟化硼甲醇溶液 德國CNW 公司；N,O-雙（三甲基硅烷）三氟乙酰胺（N,O-bis（trimethylsilyl）trifluoroacetamid, BSTFA） Sigma-Aldrich上海貿易有限公司；纖維素酶（≥400 U/mg）、半纖維素酶（≥2 U/mg）、果膠酶（≥500 U/mg） 上海瑞永生物科技有限公司。

LGJ-25C型冷凍干燥機 北京四環科學儀器廠；7890A-5975C型氣相色譜-質譜聯用儀（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS） 安捷倫科技有限公司；RE-52AA型旋轉蒸發儀 上海亞榮生化儀器廠；EDT-2000型離子濺射儀、EVO/LS10型掃描電子顯微鏡（scanning electron microscopy，SEM）德國Zeiss公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 原料處理 挑選1200個新鮮‘南豐蜜桔’均分為對照組（CK）、熱激組（HT）、殼聚糖組（CS）和熱激聯合殼聚糖組（HT+CS），每組300個果實。對照組：新鮮蜜桔未經任何處理；熱激組：蜜桔在52 ℃水中完全浸泡3 min，在約20 ℃室溫下瀝干冷卻[19]；殼聚糖組：將蜜桔在1%的殼聚糖（W/V）中完全浸泡1 min，后于室溫風干至果實表面不粘手[20]；熱激聯合殼聚糖組：先將蜜桔在52 ℃水中完全浸泡3 min，在約20 ℃室溫下瀝干冷卻，再將其放入1%的殼聚糖（W/V）中完全浸泡1 min，于室溫風干至果實表面不粘手。4個處理完成后，全部分裝于穿孔塑封袋中，每袋 30 個果實，平鋪放置在（4±0.5） ℃，相對濕度為85%～90%的冷庫中貯藏，在冷藏的第 0、15、30、45、75 d取樣測定相關指標。

1.2.2 果皮表面外蠟形態結構的SEM觀察 每個處理分別取6個果面光潔、大小色澤均一的果實，用打孔器在表皮赤道部位取樣，將果皮薄片冷凍干燥后用 EDT-2000型離子濺射儀（2×10-4MPa, 25 mA，300 s）鍍金膜，最后用EVO/LS10 SEM觀察拍片。

1.2.3 果皮蠟質成分的提取和檢測 每個處理分別選取18個果實，一組重復6個果實，共3次重復。參考Liu等[21]的方法先后提取表皮外蠟和內蠟。提取外蠟時，用阿拉伯膠（1 g/mL）在果實表面涂抹均勻，室溫風干后收集阿拉伯膠層，重復2次。用蒸餾水溶解所得的阿拉伯膠，并在室溫下用3倍體積的三氯甲烷萃取3次，收集合并所得的有機相即為外蠟溶液，并用有機濾膜（0.22 μm）過濾，于30 ℃在旋轉蒸發儀上揮出有機溶劑后貯藏于-20 ℃待測。去除外蠟的果實在三氯甲烷中完全浸泡1 min得到內蠟溶液，重復2次，合并所得內蠟溶液于30 ℃旋轉蒸發干燥后貯藏于-20 ℃待測。

果實表皮蠟質成分測定：旋干的蠟質樣品復溶在5 mL三氯甲烷中，有機濾膜（0.22 μm）過濾后，在樣品中加入 40 μL 的內標正二十四烷（0.125 μg/μL）和等體積的衍生試劑 BSTFA（含 1%TMCS），在70 ℃的烘箱中衍生40 min，用于GC-MS分析。色譜條件：色譜柱為HP-5毛細管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；進樣口溫度 280 ℃，質譜源溫度 230 ℃，流量 2 mL/min；Aux-2 溫度 280 ℃，載氣為氦氣，無分流進樣，進樣量1 μL。質譜條件：電子轟電離方式，能量70 eV，質量掃描范圍50～600 u，全掃描方式，溶劑延遲7 min。升溫程序：70 ℃保持1 min，以3 ℃/min升溫至 200 ℃，保持2 min，再以8 ℃/min升溫至300 ℃，保持 5 min，最后以20 ℃/min升溫至320 ℃，保持2 min。各種蠟質成分經GC-MS檢測后依據質譜庫進行定性，并采用內標法進行定量分析，蠟質含量以μg/cm2表示。

1.2.4 果皮角質單體的提取和檢測 果皮角質單體的提取參考Wang等[22]的方法。用打孔器（內徑=1.5 cm）在去蠟后的果實赤道部位均勻打8個孔，收集果皮圓片加入混合酶液（0.5 g/L纖維素酶、0.5 g/L半纖維素酶、0.2 g/L果膠酶）進行酶解，隔天換1次酶液，酶解至圓片表面無碎片物質釋出。收集酶解后的角質膜層37 ℃烘干至恒重。取20.0 mg質膜層浸泡在14%三氟化硼甲醇溶液中于70 ℃的烘箱中轉酯解聚16 h，然后冷卻、過濾，加入3倍體積的飽和碳酸氫鈉水溶液終止反應，再用三氯甲烷萃取3次。合并3次的萃取液，用無水硫酸鈉干燥，最后旋轉蒸發揮出有機溶液，-20 ℃保存待測。

果皮角質單體成分測定：前處理和色譜的條件與蠟質層組分分析一致。質譜條件為：電子轟電離方式，能量70 eV，質量掃描范圍50～600 u，全掃描方式，溶劑延遲7 min。升溫程序：70 ℃保持1 min，以 3 ℃/min 升溫至 200 ℃，保持 2 min，再以 8 ℃/min升溫至 300 ℃，保持 5 min，最后以 10 ℃/min 升溫至310 ℃，保持1 min。角質單體組分經GC-MS檢測后依據質譜庫定性，并采用內標法進行定量分析，用單位面積所含重量表示角質單體的含量（μg/cm2）。

1.2.5 果實表面積測定 ‘南豐蜜桔’的表面積按下式計算：

式中：X表示每個平行處理果皮的總質量，g；D和Y分別表示為在每個平行處理中用打孔器（內徑=1.5 cm）獲得的48個小圓片的面積，cm2和質量，g。

1.3 數據處理

使用 Excel 統計數據，以平均值±標準差表示數據結果；借助 SPSS 26.0 進行顯著性分析，采用Duncan 檢驗，顯著水平設為P＜0.05；運用 GraphPad繪制角質層含量圖，Origin 2019 繪制角質層比例圖，Origin Pro 2021b Heat Map with Dendrogram 繪制聚類熱圖。

2 結果與分析

2.1 冷藏過程中‘南豐蜜桔’表皮外蠟形態結構變化

‘南豐蜜桔’冷藏過程中外觀顏色變化如圖1右上角所示。冷藏15 d時，所有處理組果實表皮顏色無明顯變化。冷藏30 d時，CK組果實基本轉為全黃，而其他處理組果實果皮還保留部分青綠色。冷藏45 d開始，保鮮處理組果實顏色轉黃，至75 d時CK組出現明顯黑斑，HT組和HT+CS組果實表面也伴有泛黑現象，推測為熱激產生的應激反應，而CS組果實外觀在冷藏期間未出現黑斑，色澤均勻明亮。

‘南豐蜜桔’經不同處理后，各處理的果實表皮外蠟形態結構已發生變化，用淺藍色箭頭在圖1中標出了外蠟晶體的位置。0 d時，CK組果皮外蠟層分布了大量的蠟質晶體，為不規則血小板狀，與報道的柑桔表皮蠟質晶體形狀一致，還能觀察到皮孔的存在[23]；CS組和HT+CS組表面被殼聚糖膜覆蓋，可見明顯的蠟質晶體輪廓；HT組蠟質層較為光滑平整，無明顯的外蠟晶體分布。隨著冷藏時間的延長，表皮外蠟在不同處理中呈現不同的變化趨勢（圖1）。冷藏0～45 d時，CK組的果皮外蠟晶體數量呈先減后增的趨勢，且出現明顯裂紋；CS組和HT+CS組果皮外蠟晶體數量持續減少，逐漸趨于光滑平整。直到75 d時，觀察到4個處理的果皮表面均無明顯外蠟晶體。從不同處理間的差異分析，同時期CK組的外蠟晶體數量比其他組更多，表面也更為粗糙。前人[24]研究表明熱激能使果實外蠟晶體結構特征消失，本研究發現HT組果實表皮在冷藏期間基本保持光滑平整狀態，推測52 ℃的熱激處理導致表皮外蠟熔融重分布形成更光滑的表皮外觀。涂膜處理的CS組和HT+CS組，冷藏開始后表皮蠟層完好無損，均被致密完整的聚合膜覆蓋。Xu等[25]也發現殼聚糖涂膜處理對果實表皮外蠟可起到有效的防護。所有處理在貯藏結束時均形成了較完整的表皮表面。表皮蠟質作為‘南豐蜜桔’最外層的保護屏障，較完整的蠟質層和較少的裂縫助于阻止水分散失并有效地抵御外界微生物侵染，進而維持果實品質[26]。

圖1 冷藏過程中‘南豐蜜桔’外觀及表皮外蠟形態結構變化（400×）Fig.1 Changes in appearance and epicuticular wax crystal structure of 'Nanfeng' mandarins during cold storage (400×)

2.2 ‘南豐蜜桔’表皮蠟質組分及含量變化

2.2.1 ‘南豐蜜桔’表皮外蠟組分及含量變化 不同處理對冷藏‘南豐蜜桔’表皮外蠟主要化學組成及含量的影響如表1所示。主要檢出烷烴、酸類、酯類及萜類4類化學成分，包括16種烷烴、14種酸、3種酯、3種萜和2種醇共38種成分。烷烴種類在外蠟成分中最為豐富，其被認為是形成柑桔表皮血小板狀蠟質晶體的必需物質[27]。王敏力等[28]也在‘南豐蜜桔’中檢出了烷烴、脂肪酸和醇類物質，本研究多檢出的酯類可能是由于栽培環境或采后貯藏方式的不同所導致。所有處理的各個冷藏階段均被檢出的成分包括十一烷烴、十二烷酸、十四烷酸、十六烷酸、油酸、十八烷酸、脫氫樅酸、28-Nor-17.α.（H）-霍烷、豆甾醇和β-谷甾醇。Liu等[29]發現十六烷酸是‘紐荷爾’臍橙發育期間外蠟組分中的主要脂肪酸，其次是十八烷酸。本研究檢出的外蠟成分中十六烷酸含量同樣最高，各處理在15、45和75 d存在顯著差異（P＜0.05）。冷藏0 d時，HT組十六烷酸含量最高為2.62 μg/cm2，比最低的CK組高24.76%；至75 d發生了顯著變化（P＜0.05），HT 組降為最低的 1.77 μg/cm2，比含量最高的CK組低29.48%。在十八烷酸的變化中，HT組含量在冷藏結束為1.20 μg/cm2，相比開始時下降了32.58%。而CK組含量在30～75 d從最低升到最高，推測CK組未做任何保鮮處理，到了冷藏后期合成更多的酸類成分來對抗逆境以維持果體自身狀態，因為脂肪酸被證明具有潛在的抗真菌特性[30]。

表1 不同處理對‘南豐蜜桔’冷藏過程表皮外蠟主要成分含量的影響Table 1 Effects of different treatments on content of the main components in epicuticular wax of 'Nanfeng' mandarin during cold storage

續表 1

圖2展示了不同處理果實表皮的外蠟總含量變化。冷藏15～45 d，CK 組含量從10.12 μg/cm2下降到5.88 μg/cm2，HT 組從 6.25 μg/cm2上升到 8.19 μg/cm2，而CS和HT+CS組含量隨時間變化差異較小。冷藏45 d時，3種保鮮方式均能有效延緩外蠟含量的降低，其中熱激效果最為明顯。外蠟含量不僅隨著冷藏時間產生變化，也在不同處理間存在差異。除第45 d外，CK組冷藏過程中的外蠟含量均比同期處理組更高，這與圖1表皮外蠟形態結構現象一致，因為觀察到CK組表皮外蠟晶體數量也比同期其他處理組更多。反之，HT組在冷藏過程中，總體來看其外蠟總量相比同期其他處理組更低，也與圖1展現的表面光滑無外蠟晶體的現象相佐證。

圖2 不同處理對‘南豐蜜桔’冷藏過程中表皮外蠟組分含量的影響Fig.2 Effects of different treatments on the content of epicuticular wax components of 'Nanfeng' mandarins during cold storage

冷藏‘南豐蜜桔’表皮外蠟4類主要成分的含量和比例變化分別如圖2和圖3所示。從整體上看酸類含量最為豐富且變化較大，第15 d的CK組含量最高為7.25 μg/cm2，是第45 d的2.30倍。酸類所占比例均在50%以上，CK組和CS組的變化趨勢為先降后升，HT組表現為持續下降，而HT+CS組則為上升下降交替變化。王敏力[28]也發現脂肪酸是不同柑桔中最豐富的蠟質成分，其中‘南豐蜜桔’脂肪酸占比最大達到69.47%。各處理的烷烴整體含量從冷藏開始到后期表現為上升趨勢，尤其是HT+CS組，從0.24 μg/cm2增至 1.32 μg/cm2，增長了 4.50 倍。其在不同處理中所占比例也呈現上升的現象（圖3）。‘南豐蜜桔’隨冷藏時間延長失水率變大，為抑制果實失水烷烴含量也隨之升高，表明蠟質中烷烴組分在抑制果實采后失水方面發揮重要作用，這與前人報道一致[8,31]。外蠟中萜類的含量在不同處理間無顯著變化。Trivedi等[32]發現越橘在發育過程中，三萜類比例隨著脂肪族化合物比例升高而降低。所有處理組的萜類比例降低的同時，也伴隨著其他3類成分占比的升高的現象，這可能是由于萜類化合物一般在角質層內蠟中被檢測到，而在外蠟晶體的形成中其作用還尚不明晰。此外，有研究者[33]報道了酯類的積累會影響蘋果表皮的油膩化程度。但酯類在柑桔蠟質中的作用未見報道，推測可能與柑桔揮發性香氣有關，因為果實采后成熟衰老的過程伴有表皮香氣成分的變化[34]。本研究中CK組前期含量遠高于其他組，而保鮮處理組含量后期增長較大，可能是經熱激和殼聚糖處理后的果實響應較慢的緣故。

圖3 不同處理后‘南豐蜜桔’冷藏過程中表皮外蠟各組分比例Fig.3 Proportion of epicuticular wax components of 'Nanfeng'mandarins from different treatments during cold storage

2.2.2 ‘南豐蜜桔’表皮內蠟組分及含量變化 ‘南豐蜜桔’去除外蠟后制得內蠟，不同處理對表皮內蠟主要化學組成及含量的影響如表2所示。表皮內蠟同樣檢出烷烴、酸類、酯類及萜類4類主要化學成分，包括19種烷烴、16種酸、8種酯、5種萜、2種醇共50種成分，比外蠟要多12種。其中，所有處理組不同冷藏期果實都能檢出12種內蠟組分，含量最多的內蠟成分仍然是十六烷酸。特別注意的是，與果實外蠟萜類成分相比，內蠟還檢出了角鯊烯、菜油甾醇和β-香樹精3種萜類物質，可能是由于三萜類物質呈環狀二維結構多填充于聚酯結構的角質中，因此在內蠟中相對較多而外蠟中相對較少[35]。前人在探究‘溫州蜜柑’和‘冰糖橙’貯藏中的角質層組分差異時，發現內蠟能顯著抑制指狀青霉菌的菌絲生長和孢子萌發[10,36]，其中萜類物質起到關鍵作用。角鯊烯也被證明可參與清除自由基和提高氧負荷[37]。本研究發現角鯊烯成分僅在 CK組第15 d和HT組第0、15、45 d檢測到，推測HT處理能更好地保持果實品質。

圖4展示了檢出的表皮內蠟總量的變化，所有處理的內蠟總量整體趨勢為先減后增。在冷藏15～75 d，各處理之間的含量變化差異明顯。這期間HT組和HT+CS組保持較高的含量，而CK組和CS組在冷藏過程中都保持著先減后增的變化趨勢。冷藏45 d時3種保鮮方式均能有效抑制外蠟和內蠟含量的降低，其中熱激效果最為明顯。整個冷藏階段含量最高的是第75 d的 CK組，達到5.46 μg/cm2，最低為第30 d的CS組為1.91 μg/cm2。4類主要成分的含量和比例變化與外蠟相比有所不同。酸類同樣是表皮內蠟中含量最高的成分（圖4）。在酸類的變化中，第15 d HT組含量最高為3.44 μg/cm2，是同期CK組的1.88倍；HT+CS在冷藏結束時達到了3.27 μg/cm2，是同期CK組的1.60倍。Belge等[38]采用熱激和CO2沖擊處理成熟的桃果實，在0 ℃下貯藏2周后在20 ℃下貯藏5 d，發現熱激組的蠟質含量和百分比都為最高。與圖3不同的是，酸類比例不再占據領先優勢，烷烴和萜類占比明顯提高。分析圖4中烷烴含量的變化，發現冷藏過程中除30～45 d的HT+CS組和第75 d的CK和CS組外，其他時間點的處理組之間差異不顯著，表明表皮內蠟對蜜桔果實保水無作用[4]。與外蠟萜類相反的是內蠟萜類含量隨貯藏時間延長而逐漸升高，尤其到了冷藏第75 d，CS組和CK組含量達到最高的1.35和1.23 μg/cm2，分別是冷藏前的 2.08倍和 2.17倍，可能是冷藏后期為了合成更多的萜類成分以抵御微生物的侵染。針對表皮內蠟各組分的比例變化（圖5），觀察發現CK組、HT組及CS組3個處理組中的萜類比例存在相同的變化趨勢，均為先增后減，而HT+CS組在酯類和萜類中占比分別為持續下降和持續上升。所有處理的酸類比例在冷藏中的趨勢一致，為“上升-下降-上升”，所有處理的烷烴比例在冷藏前期也均存在先減后增的現象，表明貯藏期間果實角質層的成分代謝處于動態變化之中。

圖5 不同處理后‘南豐蜜桔’冷藏過程中表皮內蠟各組分比例Fig.5 Proportion of intracuticular wax components of 'Nanfeng' mandarins from different treatments during cold storage

續表 2

2.3 ‘南豐蜜桔’表皮角質組分及含量變化

表3列出了不同處理的表皮角質單體組成及含量變化。‘南豐蜜桔’果實角質單體共檢出7種，分別為1,4苯二甲酸、十六烷酸、十八烷酸、辛酸、壬酸、α-亞麻酸、亞油酸。不同處理組檢出的角質單體數量有所不同，CK組共檢出4種，HT組和CS組共檢出5種，而7種角質單體均能在HT+CS組檢出。冷藏第45 d，CK組角質單體僅為十六烷酸，CS組和HT+CS組角質單體種類均減少到2種，冷藏結束時檢出種類又增多；而HT組檢出的種類在第45 d增多到4種，75 d時減少到2種。Riikka等[39]發現漿果角質單體主要物質是含有官能團的C16和C18羥基酸。Marga等[40]發現角質層的機械性能受C16單體含量的影響，其含量越高表皮韌性越強。隨著冷藏時間的延長，各處理組的十六烷酸含量逐漸減少，因此‘南豐蜜桔’果實表皮也逐漸變軟。十六烷酸是唯一在所有處理不同時間點都能檢出的成分，發現冷藏15～45 d，CK組的含量較其他處理組更低，但冷藏結束時又有所回升，推測是由于逆境脅迫而合成了比其他處理更高的含量，以抵御采后病原菌的侵染[41]。不同處理檢出的表皮角質單體總量如圖6所示。冷藏30～45 d，各處理之間存在顯著差異（P＜0.05）。冷藏期間HT組角質單體總量始終高于其他處理組，最高為冷藏開始的2.73 μg/cm2；而CK組則與之相反，在冷藏 0～45 d 從 2.00 μg/cm2顯著下降到 0.38 μg/cm2（P＜0.05），第 75 d 回升到 0.50 μg/cm2。分析不同處理檢出的角質單體的比例變化（圖7），發現十六烷酸是冷藏45～75 d的主要角質單體，各處理中所占比例均超過50%。圖6中，CK組因未做任何保鮮處理在冷藏過程中角質單體含量較其他處理組更少，而HT組、CS組和HT+CS組明顯含量更高，尤其是HT組，表明熱激可以抑制角質單體含量的下降，具有更優的保鮮優勢。

圖6 不同處理對‘南豐蜜桔’冷藏過程中表皮角質單體總量的影響Fig.6 Effects of different treatments on the total amount of epidermal cutin monomer of 'Nanfeng' mandarins during cold storage

圖7 不同處理后‘南豐蜜桔’冷藏過程中表皮角質單體組分比例Fig.7 Proportion of epidermal cutin monomer of 'Nanfeng' mandarins from different treatments during cold storage

表3 不同處理對‘南豐蜜桔’冷藏過程表皮角質單體含量的影響Table 3 Effects of different treatments on compositions in epidermal cutin monomer of 'Nanfeng' mandarins during cold storage

續表 3

2.4 ‘南豐蜜桔’表皮角質層組分的聚類分析

采用Ward最小方差和歐式距離法對檢出的角質層組分數據進行聚類分析，結果以熱圖形式顯示在圖8。圖例表示紅色越深值越大，物質含量就越高；而藍色越深值越低，含量則越低。左邊是樣品的聚集區，上邊是角質層成分的聚集區。左邊分支和上邊分支軸歐式距離越長，相關性就越弱。如紅線所示樣本可以大致分為三大類，為0 d、15～75 d以及CK組第75 d三個貯藏階段。進一步細分為6類，同一類的樣本之間存在較強的相關性。0 d樣本進一步分為CK組和其他處理組，表明果實經不同處理后，在冷藏開始時就已經有了成分代謝的響應變化。分類Ⅲ都是15 d樣品。而30 d和45 d的樣本被歸為Ⅳ類，說明該時期各處理之間差異較小，熱圖也由大面積紅色轉為臨界色，含量明顯下降。值得注意的是，HT+CS組第45 d和其他組75 d樣本被分到了Ⅴ類，該類樣本含量顯著升高，說明HT+CS組后期合成角質層成分較其他組更快。而CK組的第75 d樣品紅色區域較多較深單獨歸為一類，和前期分析一致，可能是由于冷藏后期CK組以抵御微生物侵染而提前合成更多的角質層成分。表皮外蠟、內蠟和角質單體的聚集可分為3類。幾乎所有的第一類物質都是內蠟組分，第二類物質也幾乎是外蠟組分，第三類則幾乎包括內蠟和絕大多數的角質單體組分，表明外蠟、內蠟以及角質成分之間存在聚類差異。隨著冷藏時間的延長，Ⅰ類物質含量總體上呈現先下降后上升的趨勢，與圖4內蠟總量變化一致；II類物質顏色差異較小，冷藏前后含量變化不明顯，也與圖2外蠟總量無明顯變化規律相吻合；最后一類物質貯藏前后期顏色變化顯著，整體上物質含量隨著貯藏時間延長而降低。

圖8 不同處理后‘南豐蜜桔’冷藏過程中角質層組分的熱圖和聚類分析Fig.8 Heatmap and clustering of cuticle components of 'Nanfeng' mandarins from different treatments during cold storage

3 結論

角質層對果實采后貯藏保鮮至關重要，本研究采用不同保鮮方式（熱激、殼聚糖、熱激聯合殼聚糖）處理新鮮‘南豐蜜桔’，探究了其外蠟晶體結構和角質層成分代謝的變化規律。‘南豐蜜桔’外蠟晶體為不規則的血小板狀，熱激能使外蠟熔融重分布產生更光滑的表皮外觀，外蠟晶體隨著冷藏時間的延長而逐漸消失。GC-MS分析表明，外蠟一共檢出38種成分，包括16種烷烴、14種酸、3種酯、3種萜和2種醇，內蠟共檢出50種化學成分，包括19種烷烴、16種酸、8種酯、5種萜、2種醇。蠟質的主要成分均為烷烴、酸類、酯類和萜類，其中酸類含量最為豐富。不管是蠟質還是角質，十六烷酸都是最主要的組分。外蠟含量整體上無明顯的變化規律，內蠟含量則隨時間延長呈先減后增的變化趨勢，冷藏45 d時3種保鮮方式均能有效延緩外蠟和內蠟含量的下降，其中熱激處理的效果最為明顯。角質單體主要檢出1,4苯二甲酸、十六烷酸、十八烷酸、辛酸、壬酸、α-亞麻酸、亞油酸7種成分。角質單體含量隨貯藏時間延長而下降，3種保鮮方式都能明顯抑制其含量的降低，其中以熱激處理的效果最為顯著。綜上所述，熱激作為一種有效的保鮮方式，可通過改變柑桔果實外蠟晶體的結構，以及調控角質層的代謝變化來保持采后貯藏品質。這些結果對開發‘南豐蜜桔’的綠色保鮮方法提供了新視角。