超高壓均質制備大豆多肽納米乳及其粒徑和穩定性分析

呂沛宣，廖永紅，周曉宏,

（1.北京理工大學化學與化工學院，北京 100081；

2.北京工商大學輕工科學技術學院，北京 100048）

納米乳液是一種熱力學不穩定的膠體分散體系，由互不相溶的兩相液體組成，其中一相在乳化劑的作用下形成小液滴分散到另一種液體中，液滴直徑通常小于200 nm[1-2]。乳液的許多特性，如穩定性、流變性、外觀、顏色、質地和保質期等都取決于粒徑和分布[3]。液滴的布朗運動速率與其粒徑呈負相關，納米乳由于粒徑較小，布朗運動的增強可使納米乳液的小液滴克服重力實現均勻分布[4]，因此，納米乳液較常規乳液有著穩定性好、光學透明度高及被包封物質生物利用度高等優點[5]。許多最新的研究致力于納米乳液的制備、表征和利用作為親脂性物質的包封和遞送系統[6-7]。

乳化劑對于納米乳的形成和穩定至關重要，人們對飲食健康的關注使食品行業強調食品添加劑的“天然、營養、多功能”[8]，以天然成分代替合成成分和植物來源代替動物來源成為趨勢。在天然植物乳化劑中，大豆蛋白因其營養價值高、成本低已被廣泛報道，但作為乳化劑主要應用于高稠度乳劑如肉糜食品，在稀乳液中的應用非常有限[9-10]，主要原因之一是許多商業大豆蛋白產品的溶解性和分散性差，從而降低了乳化能力[11]。與大豆蛋白相比，大豆多肽分子量更低，分子延展性更強，對油水界面的吸附更快，具有更好的溶解性和乳化性[12-13]，此外，大豆蛋白經酶解后可釋放一些具有特殊生理活性的肽，如抗氧化肽[14]、抗高血壓肽[15]和降膽固醇肽[16]等，因此，可以應用于功能食品。然而大豆多肽乳化劑研究鮮有報道，更未見市場應用。

納米乳的形成需要外加能量，根據能量的多少分為低能乳化法和高能乳化法。相變溫度法、相變組分法等低能法多依賴于乳化劑和乳液組分的性質，一般不適合工業化生產。高壓均質化、高壓微射流和超聲破碎等高能法為制備納米級液滴提供了克服界面能壘所需的機械能，可用于大規模的商業食品加工。其中超高壓均質是一種應用于流體處理的新技術，可有效減小液滴尺寸，增強乳液的物理和氧化穩定性[17-18]，并且對營養價值和感官特性的影響最小[19]，然而尚未有關于超高壓均質技術用于制備大豆多肽納米乳的報道。

因此，本研究的主要目的集中在兩個方面：超高壓均質技術制備大豆多肽納米乳液的影響因素分析并通過正交試驗優化工藝條件以制備穩定的小粒徑乳液；納米乳的儲存穩定性和微觀形貌表征。研究為多肽乳化劑在食品中的應用及多肽納米乳的開發提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大豆分離蛋白（純度≥90%） 山東禹王生態食業有限公司；Alcalase 2.4 L堿性蛋白酶（6.4×105U/mL）諾維信（中國）生物技術有限公司；酪蛋白 北京博奧拓達科技有限公司；金龍魚大豆油 益海嘉里食品營銷有限公司；ProClean 950抑菌防腐劑 上海碧云天生物技術有限公司。

HR-6B高速勻漿機 上海滬析實業有限公司；UV-9600紫外/可見分光光度計 北京北分瑞利分析儀器（集團）有限責任公司；EmulsiFlexC3超高壓納米均質機 加拿大Avestin公司；納米粒度及zeta電位分析儀 ZS90英國馬爾文公司；Cypher VRS多功能單分子力譜儀 英國牛津儀器集團。

1.2 實驗方法

1.2.1 大豆多肽乳化劑的酶法制備 大豆分離蛋白按11%（w/v）分散于去離子水中，1 mol/L Na2CO3溶液調節pH至7.5，添加2%（v/w）底物濃度的堿性蛋白酶酶解8 h后100 ℃水浴加熱滅酶10 min獲得大豆多肽分散液，凱氏定氮法[20]確定多肽質量濃度為90 mg/mL，甲醛滴定法[21]測得水解度為17%，4 ℃儲存。

1.2.2 納米乳液制備 使用高速勻漿機將稀釋到所需質量濃度的多肽分散液和大豆油以97:3（v/v）的比例在23000 r/min下預混2 min得到粗乳液，然后將粗乳液立即轉移到超高壓均質機中，在不同的均質壓力和循環次數下制備大豆多肽納米乳液。

1.2.3 乳液粒徑和分布測試 使用納米粒度分析儀測定大豆多肽納米乳液的平均粒徑和分布，用去離子水將大豆多肽納米乳液稀釋100倍，以避免多重光散射效應。參數設定：分散相折射率設置為RI-1.450，連續相折射率設置為RI-1.330，測定乳液平均粒徑和多分散性指數（particle distribution index，PDI）。

1.2.4 物理穩定性測定 離心穩定性常數（Ke）是確定納米乳液物理穩定性的最常用指標之一，Ke值越低，納米乳液的物理穩定性越好。按照Li等[22]的方法，將納米乳液用去離子水稀釋100倍，在離心機中以2000 g離心20 min，從離心管底部取5 mL樣品并用渦旋混合器混合5 s，利用分光光度計測定每個樣品在500 nm波長處的吸光度。Ke值計算公式如下：

式中：A0和A分別為稀釋的納米乳離心前后的吸光度值。

1.2.5 單因素實驗

1.2.5.1 多肽質量濃度對納米乳粒徑和穩定性的影響 取 194 mL質量濃度分別為 5、10、30、60和90 mg/mL的大豆多肽分散液與6 mL豆油制備粗乳液，然后以60 MPa的壓力均質3次，測定乳液粒徑、PDI和Ke值。

1.2.5.2 均質壓力對納米乳粒徑和穩定性的影響取194 mL稀釋到10 mg/mL的大豆多肽分散液與6 mL豆油制備粗乳液，分別以0、60、120和180 MPa的壓力循環均質3次，測定乳液粒徑、PDI和Ke值。

1.2.5.3 循環次數對納米乳粒徑和穩定性的影響取194 mL稀釋到10 mg/mL的大豆多肽分散液與6 mL豆油制備粗乳液，以60 MPa的壓力分別循環均質1、3、5、7和9次，測定乳液粒徑、PDI和Ke值。

1.2.6 正交試驗 為優化大豆多肽納米乳的制備工藝，以納米乳的平均粒徑和Ke為評價指標，設計了3因素3水平的正交試驗，如表1所示。

表1 大豆多肽納米乳超高壓制備工藝正交試驗因素水平Table 1 Factors and levels of orthogonal array design for optimization of SPIH nanoemulsion prepared by UHPH

1.2.7 原子力顯微鏡（atomic force microscopy，AFM）表征納米乳形貌 通過Cypher VRS多功能單分子力譜儀觀察樣品的形貌，使用Gwyddion軟件對圖像進行處理和分析。樣品用蒸餾水稀釋100倍，在云母片上滴加5 μL至自然干燥，將樣品固定在金屬板上并以輕敲模式觀察，驅動頻率設置為300 kHz，掃描頻率設置為1.0 Hz。

1.2.8 儲存穩定性測試 通過測定納米乳在4 ℃下儲存0～56 d（每7 d測一次）的粒徑變化，考察其儲存穩定性，設置不添加防腐劑和添加0.1% ProClean 950抑菌防腐劑兩組實驗。

1.3 數據處理

每組實驗重復三次，圖表由Origin 2021軟件生成，使用SPSS 26軟件進行單因素方差分析，確定數據之間具有顯著性差異（P＜0.05）。

2 結果與分析

2.1 大豆多肽質量濃度對納米乳粒徑和穩定性的影響

納米乳液滴的形成與穩定需要多肽吸附在油水界面并形成界面膜，多肽質量濃度對乳液粒徑和分布的影響如圖1a所示，粒徑隨其濃度增加而逐漸增大，PDI則先降后升。多肽在油水界面上不同于傳統乳化劑的單層排布，而是由于分子間相互作用在“油核”外層形成網狀的“肽殼”結構[23]，多肽濃度增加使得殼層增厚及液滴間的聚集，從而導致粒徑增大和分布變寬。同樣的也可以解釋Ke值隨多肽濃度增加而減小（圖1b），因為界面的層狀肽有利于維持乳液穩定性[24]，多肽濃度低時形成的界面膜抗性差導致離心時發生破乳，難以維持乳液穩定，而高多肽濃度形成的液滴則可承受較大離心力。因此，對于多肽乳化劑濃度的選擇要兼顧粒徑和穩定性兩個指標。

圖1 多肽質量濃度對納米乳粒徑和分布（a）及穩定性（b）的影響Fig.1 Effects of SPIH concentration on nanoemulsion particle size, distribution (a) and stability (b)

2.2 均質壓力對納米乳粒徑和穩定性的影響

均質壓力是納米乳液制備的重要加工參數，如圖2所示，納米乳粒徑、PDI和Ke值均隨均質壓力升高而先減小后增大。壓力由0到60 MPa，粒徑由672 nm降至 236 nm、PDI由 0.600降至 0.242、Ke值由66%降至22%，變化極顯著（P＜0.01），說明超高壓均質處理是減小大豆多肽乳液粒徑、促使液滴均勻分布和提高穩定性的有效手段。隨著壓力增大，均質機產生的撞擊、剪切和空化效應增強，油相被破碎成更小的液滴并增強表面活性劑在液滴表面的吸附[25]，小粒徑乳液通常有著較好的穩定性，在120 MPa下粒徑和Ke值均出現最低點。然而當壓力升至180 MPa，粒徑反而增大同時穩定性降低（P＜0.05），在Wang等[26]的報道中也提到這一現象，推測是過度的均質壓力造成小顆粒相互吸引和聚集。如果液滴碰撞速度較表面活性劑吸附速率更快，則新界面不會被完全覆蓋，從而導致聚結[27]。這意味著雖然乳化過程中的能量輸入增加了，但得到的乳狀液具有更大的粒徑，并非預期的更小的尺寸。

圖2 均質壓力對納米乳粒徑和分布（a）及穩定性（b）的影響Fig.2 Effects of homogenization pressure on nanoemulsion particle size, distribution (a) and stability (b)

2.3 循環次數對納米乳粒徑和穩定性的影響

循環次數與加工耗時密切相關，確定合理的循環次數有利于在最短時間內獲得產品。由圖3可看出，大豆多肽納米乳的粒徑、PDI和Ke值在1～3次循環內減小極顯著（P＜0.01），5次循環出現各項最小值，但隨后波動性增加。少數循環時的粒徑減小、分布變均勻和穩定性增強是由于超高壓均質持續向乳液輸出克服表面張力形成小液滴的能量，但循環次數增加，液滴在較大壓力下持續碰撞和接觸可能發生聚集，造成粒徑增大和分布不均，同時對乳液穩定也無益，這與耿宏慶等[28]采用高壓微射流制備乳液的結果一致。9次循環時各指標較7次明顯下降推測是聚集體再次被分散，這可能是多肽乳化劑區別于傳統乳化劑的納米乳加工過程，王玙璇等[29]以卵磷脂為乳化劑采用高壓均質法制備神經酰胺納米乳，7次循環后粒徑無明顯變化。

圖3 循環次數對納米乳粒徑和分布（a）及穩定性（b）的影響Fig.3 Effects of cycle number on nanoemulsion particle size,distribution (a) and stability (b)

2.4 大豆多肽納米乳超高壓制備工藝參數優化

大豆多肽納米乳超高壓制備工藝正交試驗結果如表2所示，根據極差（R）分析得到各因素對納米乳粒徑影響主次順序為A＞C＞B，即多肽質量濃度＞循環次數＞均質壓力，最優組合為A1B3C2；各因素對納米乳物理穩定性影響主次順序為A＞B＞C，即多肽質量濃度＞均質壓力＞循環次數，最優組合為A3B3C2。兩指標結果差異集中在多肽質量濃度上，同時該因素也是最主要影響因素，為制備穩定的小粒徑納米乳，運用綜合平衡法確定綜合最佳工藝條件為A2B3C2，即多肽質量濃度 20 mg/mL，均質壓力 140 MPa，循環次數5次。按該方案進行實驗，納米乳粒徑為178.8 nm，Ke值為7.37%。

表2 大豆多肽納米乳超高壓制備工藝正交試驗結果Table 2 Results of orthogonal test of SPIH nanoemulsion prepared by UHPH

2.5 大豆多肽納米乳液的表面形貌

在正交試驗中多肽濃度是最主要的影響因素，為觀察納米乳微觀形貌并進一步探究多肽濃度對納米乳粒徑的影響，采用AFM表征納米乳液的形貌和液滴分布，根據正交試驗結果設置多肽濃度不同的兩組實驗：在140 MPa和5次循環下分別制備了多肽質量濃度為20和30 mg/mL的乳液，圖像如圖4所示。圖4a可以觀察到稀釋100倍的乳液液滴呈規整球狀均勻分布在云母片表面，偶有少量聚集，不算聚集體在內，每測量面積（1×1 μm）的顆粒數為 67，Nano Measurer軟件計算的平均直徑僅為46.80 nm。根據瑞麗散射定律，團聚體對小液滴有光強掩蔽作用，因此，推測SPIH納米乳液的實際液滴尺寸可能小于激光粒度儀測算值，Cheng等[23]也有同樣的猜測。圖4b中可明顯看到聚集現象多于圖4a，驗證了多肽質量濃度的增加導致液滴聚結的推測。此外，還發現液滴直徑遠大于其高度，其原因可能是多肽構成彈性界面膜，干燥后液滴在重力作用下從球形變成了“餅狀”。AFM圖像表明正交優化條件制備的大豆多肽納米乳具有較小粒徑和均勻分布。

圖4 納米乳稀釋100倍的AFM相位圖和形貌圖Fig.4 Phase image and morphology image of the nanoemulsion diluted 100 times

2.6 納米乳儲存穩定性

儲存穩定性關乎乳液的保質期，記錄了正交最優組合條件下制備的納米乳液在無防腐劑和有防腐劑兩種情況下，4 ℃下儲存56 d內液滴尺寸的變化。圖5顯示添加防腐劑后，粒徑在56 d內無顯著變化（P＞0.05），未添加防腐劑組乳液粒徑則不斷增大。乳液外觀可表征其宏觀穩定性，添加防腐劑組在儲存過程中外觀無變化，對照組在變質情況下僅底部出現一薄層乳析層（圖6）。相較于大豆蛋白納米乳在儲存期間粒徑不斷增大[30]，以及超聲制備的大豆多肽納米乳在28 d時粒徑發生顯著變化[13]，超高壓均質制備的大豆多肽納米乳表現出更好的儲存穩定性，多肽在界面上形成的彈性膜可有效阻止油滴的橋接絮凝和聚結[31]。對照組液滴大小增加可能是多肽被微生物分解成氨基酸或短肽，其乳化性能較差[32]，且微生物活動也對激光粒度測量產生影響，推測實際粒度小于測量值，可對應其乳析層較薄現象。

圖5 儲存時間對納米乳粒徑的影響Fig.5 Effect of storage time on nanoemulsion particle size

圖6 儲存時間對納米乳液外觀的影響Fig.6 Effect of storage time on appearance of nanoemulsions

3 結論

為開發大豆多肽作為食品乳化劑的應用潛力，本研究以超高壓均質技術為加工手段制備大豆多肽納米乳。探究了多肽質量濃度、均質壓力和循環次數單因素條件對納米乳平均粒徑、粒度分布和物理穩定性的影響，實驗結果表明：多肽濃度增加導致粒徑增大和分布不均，但有利于乳液穩定，這是因為多肽分子間存在相互作用，濃度增加時界面膜增厚同時發生聚集；各指標隨均質壓力增大先降低后升高，120 MPa時乳液粒徑最小最穩定；少數循環可顯著降低粒徑、PDI和Ke值，5次循環最佳，多次循環后指標波動性變化。在單因素實驗基礎上進行正交試驗，各因素對粒徑影響順序為多肽質量濃度＞循環次數＞均質壓力，對乳液穩定性影響順序為多肽質量濃度＞均質壓力＞循環次數，由于多肽質量濃度對粒徑和穩定性的影響相反，最終綜合平衡確定超高壓均質技術制備大豆多肽納米乳的最佳工藝條件：20 mg/mL多肽質量濃度，140 MPa均質壓力和5次循環，在此條件下制備的納米乳液粒徑為178.8 nm，Ke=7.37%，可維持56 d的穩定，AFM圖像顯示乳液液滴分布均勻，多肽界面為彈性膜結構，同時驗證了多肽質量濃度增加會導致液滴聚集。因此，大豆多肽是一種有潛力的食品乳化劑，超高壓均質技術制備的大豆多肽納米乳也有望作為包封系統應用于食品工業。