響應面法優化β-半乳糖苷酶法制備低聚半乳糖工藝

孫聰聰，龐道睿，黎爾納，李 倩，鄒宇曉，廖森泰，劉 凡,

（1.廣東省農業科學院蠶業與農產品加工研究所，農業農村部功能食品重點實驗室，廣東省農產品加工重點實驗室，廣東廣州 510600；2.江蘇科技大學生物技術學院，江蘇鎮江 212018）

低聚半乳糖（Galactooligosaccharides，GOS）是一種具有天然益生元屬性的功能性低聚糖[1]，其分子結構一般是在葡萄糖或半乳糖分子上連接1～7個半乳糖基，即 Gal-（Gal）n-Glc/Gal（n 為 0～6）。研究表明，低聚半乳糖具有調節腸道菌群結構[2-3]、促進礦物質吸收[4-5]、提高免疫調節[6-7]、預防癌癥[8-9]及改善炎癥性腸病[10-11]等功能，因其具有優越的生理功能和理化性質而成為近年來國內外關注的熱點。

低聚半乳糖的制備方法主要有如下幾種：一是從自然界中提取，其成本高、產量低且分離困難；二是酸法水解天然多糖，但副反應較多，增大了后續純化的難度；三是化學合成，步驟繁瑣、得率低，且存在環境污染的風險，僅限于實驗室研究；四是酶法合成，其操作簡便、成本低，是目前生產GOS最理想的方法[12-15]。但目前GOS的商品化生產旨在生產更純凈和更高效的產品[16]，多以GOS的產率及純度作為衡量標準，對GOS的具體組成及特定健康效應沒有太多關注[17-18]。本實驗室前期研究表明，聚合度較高的GOS（如聚合度為4的低聚半乳四糖，Degree of Polymerization is 4，DP4），其體外抗炎活性也更強。因此，在保證GOS總產率情況下，提高高聚合度GOS產率成為本文研究的重點。

本研究以乳糖為原料，研究β-半乳糖苷酶的不同來源及酶催化反應的不同條件（底物濃度、酶添加量、反應溫度、反應時間和反應pH）對GOS總產率及低聚半乳四糖（DP4）產率的影響，通過Box-Behnken響應面分析法對β-半乳糖苷酶法合成GOS工藝進行優化，以期在保證GOS總產率的前提下，選擇性地提高低聚半乳四糖產率，為低聚半乳糖的功能性應用和特醫食品的研究開發提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

β-半乳糖苷酶（黑曲霉、大腸桿菌、米曲霉來源）上海瑞永生物科技有限公司；乳糖、鄰硝基苯β-D-半乳吡喃糖苷（ONPG）、鄰硝基苯酚、碳酸鈉、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉 均為分析純；實驗用水 均為超純水。

LC1200高效液相色譜儀 美國Agilent；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器 鞏義市孝義合眾儀器供應站；FE28 pH計 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；SHA-8水浴恒溫振蕩器 金壇區水北科普實驗儀器廠；CR22GⅢ高速冷凍離心機 日本HITACHI。

1.2 實驗方法

1.2.1 不同來源的β-半乳糖苷酶對合成GOS的影響首先參考GB/T 33409-2016β-半乳糖苷酶活性檢測方法[19]，對黑曲霉來源、大腸桿菌來源、米曲霉來源的β-半乳糖苷酶的水解活性進行測定。然后以0.1 mol/L、pH6.5的磷酸二氫鈉-磷酸氫二鈉緩沖液溶解乳糖，配制100 mL濃度為300 g/L乳糖底物置于250 mL酶反應容器中，以6 U/g乳糖的加酶量分別加入黑曲霉來源、大腸桿菌來源、米曲霉來源的β-半乳糖苷酶，置于50 ℃的水浴搖床120 r/min反應12 h，反應液于沸水浴滅酶20 min，8000 r/min離心10 min，取上清液過0.22 μm水相濾膜，利用高效液相色譜法分析產物中糖類物質的組成，考察不同來源的β-半乳糖苷酶對GOS產率、DP4產率的影響。

1.2.2 單因素實驗

1.2.2.1 起始乳糖濃度對合成GOS的影響 以0.1 mol/L、pH6.5的磷酸二氫鈉-磷酸氫二鈉緩沖液溶解乳糖，分別配制成100 mL不同濃度（200、300、400、500、600 g/L）的乳糖底物置于250 mL酶反應容器中，在加酶量6 U/g乳糖的條件下，置于50 ℃的水浴搖床120 r/min反應12 h，反應液于沸水浴滅酶20 min，8000 r/min離心10 min，取上清液過0.22 μm水相濾膜，利用高效液相色譜法分析產物中糖類物質的組成，考察不同起始乳糖濃度對GOS產率、DP4產率的影響。

1.2.2.2 加酶量對合成GOS的影響 以0.1 mol/L、pH6.5的磷酸二氫鈉-磷酸氫二鈉緩沖液配制100 mL濃度為300 g/L乳糖底物置于250 mL酶反應容器中，分別加入 2、4、6、8、10 U/g 的β-半乳糖苷酶，置于50 ℃的水浴搖床120 r/min反應12 h，反應液于沸水浴滅酶20 min，8000 r/min離心10 min，取上清液過0.22 μm水相濾膜，利用高效液相色譜法分析產物中糖類物質的組成，考察不同的β-半乳糖苷酶添加量對GOS產率、DP4產率的影響。

1.2.2.3 反應溫度對合成GOS的影響 以0.1 mol/L、pH6.5的磷酸二氫鈉-磷酸氫二鈉緩沖液配制100 mL濃度為300 g/L乳糖底物置于250 mL酶反應容器中，各加入8 U/g的β-半乳糖苷酶，置于不同反應溫度（30、40、50、60、70 ℃）的水浴搖床 120 r/min反應12 h，反應液于沸水浴滅酶20 min，8000 r/min離心10 min，取上清液過0.22 μm水相濾膜，利用高效液相色譜法分析產物中糖類物質的組成，考察不同的反應溫度對GOS產率、DP4產率的影響。

1.2.2.4 反應時間對合成GOS的影響 以0.1 mol/L、pH6.5的磷酸二氫鈉-磷酸氫二鈉緩沖液配制100 mL濃度為300 g/L乳糖底物置于250 mL酶反應容器中，各加入8 U/g的β-半乳糖苷酶，置于50 ℃的水浴搖床 120 r/min分別反應（4、8、12、16、20 h），反應液于沸水浴滅酶20 min，8000 r/min離心10 min，取上清液過0.22 μm水相濾膜，利用高效液相色譜法分析產物中糖類物質的組成，考察不同的反應時間對GOS產率、DP4產率的影響。

1.2.2.5 反應pH對合成GOS的影響 以0.1 mol/L、不同 pH（4.5、5.5、6.5、7.5、8.5）的磷酸二氫鈉-磷酸氫二鈉緩沖液配制100 mL濃度為300 g/L乳糖底物置于250 mL酶反應容器中，各加入8 U/g的β-半乳糖苷酶，置于50 ℃的水浴搖床120 r/min反應16 h，反應液于沸水浴滅酶20 min，8000 r/min離心10 min，取上清液過0.22 μm水相濾膜，利用高效液相色譜法分析產物中糖類物質的組成，考察不同的反應pH對GOS產率、DP4產率的影響。

1.2.3 響應面試驗 綜合單因素實驗的結果，以加酶量（A）、反應溫度（B）、反應時間（C）、反應 pH（D）為自變量，以 GOS 產率（Y1）、DP4 產率（Y2）為響應值，采用Box-Behnken響應面設計法對合成條件在四因素三水平上進行工藝參數的優化。試驗因素與水平設計見表1。

表1 響應面試驗因素水平設計Table 1 Factors and levels of response surface methodology

1.2.4β-半乳糖苷酶的活性檢測 參考GB/T 33409-2016β-半乳糖苷酶活性檢測方法[19]。pH7.3的磷酸緩沖液適用大腸桿菌來源的β-半乳糖苷酶，pH4.5的磷酸緩沖液適用黑曲霉、米曲霉來源的β-半乳糖苷酶。精確稱取酶粉1.0 mg，用相應的反應緩沖液溶解后，定容至100 mL，利用分光光度計法測定β-半乳糖苷酶活性。以鄰硝基苯酚為標準品繪制標準曲線，得到線性回歸方程：YpH7.3=4.0549x+0.0085，R2pH7.3=0.9998；YpH4.5=1.8251x+0.0074，R2pH4.5=0.9992。

酶活力計算公式如下：

式中：c表示測定液中鄰硝基苯酚的濃度，從對應的標準曲線中得出，mmol/L；8為反應試劑的總體積，mL；D表示稀釋倍數；1表示參與反應酶液的體積，mL；10為反應時間，min；V表示溶解酶粉的液體體積，mL；m表示稱取酶粉的質量，g。

1.2.5 GOS產率的測定和DP4產率的測定 測定方法采用高效液相色譜法（HPLC）。色譜條件：Agilent 1200型高效液相色譜，蒸發光散射檢測器（霧化溫度30 ℃，蒸發溫度30 ℃，氣體流速1.6 SLM），色譜柱為 Agilent Hi-Plex（300 mm×7.7 mm，8 μm），柱溫80 ℃，流動相為超純水，流速0.6 mL/min，進樣量10 μL。按照以上色譜條件對反應樣品進行測定分析。

根據反應產物中各糖類物質在HPLC上的峰面積，用外標法對GOS與DP4產率進行絕對定量計算。其計算公式如下：

式中：cGOS表示反應產物中GOS的濃度，從標準曲線中得出，μg/mL；V表示反應終止時反應液的體積，mL；D表示稀釋倍數；mLac表示乳糖初始添加的質量，mg；cDP4表示反應產物中DP4的濃度，從標準曲線中得出，μg/mL。

1.3 數據處理

實驗數據為3次重復平均值，采用SPSS 21.0軟件進行單因素方差分析（One-way ANOVA）和Duncan's多重差異顯著分析，顯著性水平P＜0.05，不同字母代表組間顯著性差異。采用GraphPad Prism 7軟件做圖，Design Expert 12.0進行響應面試驗設計。

2 結果與分析

2.1 GOS和DP4標準曲線的繪制

各標準品HPLC色譜圖見圖1，以標準品峰面積的自然對數值為縱坐標，以標準品濃度（μg/mL）的自然對數值為橫坐標，進行線性回歸，得到標準曲線（圖2，以低聚半乳三糖和低聚半乳四糖的峰面積之和為總GOS峰面積）。經回歸處理得線性回歸方 程 ：YGOS=1.523x-1.8329，R2GOS=0.9996；YDP4=1.5172x-1.7069，R2DP4=0.9993。

圖1 糖標準品的HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of sugar standard

圖2 標準曲線Fig.2 Standard curve

2.2 不同酶來源對合成GOS的影響

GOS的合成與β-半乳糖苷酶的反應機制密切相關，GOS合成過程中發生兩類反應：一是乳糖的水解反應，二是轉半乳糖基反應，而GOS正是轉糖基反應的產物，因此GOS產率取決于這兩種反應的平衡[18]。不同來源的酶具有不同的特性，對于水和糖具有不同的選擇性，不同酶之間的結構特征或其反應機制也有所差異，從而導致GOS產率和高聚合度GOS（如DP4）的產率有所不同[20-21]。通過酶水解活力測定發現三種β-半乳糖苷酶的水解活性強弱：米曲霉來源（酶Ⅲ）＞黑曲霉來源（酶Ⅰ）＞大腸桿菌來源（酶Ⅱ）（圖3A）；在酶添加量、底物濃度、反應溫度、反應pH、反應時間完全相同的條件下，測定比較GOS總產率及DP4產率，分析得出三種β-半乳糖苷酶的轉糖基活性強弱：大腸桿菌來源（酶Ⅱ）＞米曲霉來源（酶Ⅲ）＞黑曲霉來源（酶Ⅰ）（圖3B）。綜上可知，相同酶添加量（U/g乳糖）的條件下，雖然大腸桿菌來源的β-半乳糖苷酶的轉糖基活性更強，但因其單位質量的酶活力很低，故需消耗的酶量大，成本較高，因此兼顧到GOS產率以及經濟成本，選用米曲霉來源的β-半乳糖苷酶進行接下來的實驗。

圖3 不同酶來源對合成GOS的影響Fig.3 Effect of enzymes from different sources on the synthesis of GOS

2.3 不同反應條件對GOS合成的影響

2.3.1 起始乳糖濃度對合成GOS的影響 在一定的加酶量、反應溫度、反應時間、反應pH條件下，以不同起始濃度的乳糖合成GOS，其結果如圖4所示。隨著乳糖起始濃度的增加，GOS產率逐漸增加，于300 g/L時達到最大值10.74%，這可能是隨著乳糖起始濃度的提高，一方面增加了半乳糖受體的量，另一方面降低了水活度，從而更容易發生轉糖基反應，生成GOS[22]；當乳糖初始濃度從300 g/L繼續增加到600 g/L時，其GOS產率逐漸下降，這可能是由于在高乳糖濃度下，β-半乳糖苷酶催化活性受到抑制，致使其水解和轉苷作用同時降低[23]。同時，隨著乳糖濃度的增加，DP4產率逐漸降低。綜合考慮原料的充分利用以及GOS產率等因素，選用300 g/L的乳糖起始濃度進行后續的實驗。

圖4 不同起始乳糖濃度對合成GOS的影響Fig.4 Effect of different concentrations of galactose on the synthesis of GOS

2.3.2 加酶量對合成GOS的影響 在乳糖起始濃度、反應溫度、反應時間、反應pH一定的條件下，以不同加酶量合成GOS，其結果如圖5所示。當加酶量為8 U/g時，GOS產率為 11.09%±0.19%，DP4產率為1.53%±0.02%；繼續提高酶添加量，GOS產率與DP4產率沒有明顯增加。總體而言，在一定的加酶量范圍內，隨著β-半乳糖苷酶添加量的增多，GOS產率、DP4產率也隨之提高。這可能是因為在反應體系中，酶與底物絡合，使得GOS產率增加；而當加酶量過高時，不能充分利用β-半乳糖苷酶，同時產生的副產物影響GOS的合成[24]。綜合考慮酶的利用效率、GOS產率及DP4產率，選用加酶量8 U/g進行后續實驗。

圖5 不同加酶量對合成GOS的影響Fig.5 Effect of different enzyme addition on the synthesis of GOS

2.3.3 反應溫度對合成GOS的影響 在乳糖濃度、加酶量、反應時間和反應pH固定的條件下，以不同的反應溫度合成GOS，結果如圖6所示。當反應溫度低于50 ℃時，GOS產率及DP4產率隨反應溫度的升高而增加，這是因為適當升高溫度不僅可以增加乳糖的溶解度，而且促進反應體系中分子間相互作用，從而促進GOS的合成，使得GOS產率及DP4產率提高。而當溫度高于50 ℃時，高溫使得β-半乳糖苷酶變性失活，不利于GOS合成[25]。因此，考慮到酶的熱穩定性，選取最適溫度為50 ℃進行后續實驗。

圖6 不同反應溫度對合成GOS的影響Fig.6 Effect of different reaction temperature on the synthesis of GOS

2.3.4 反應時間對合成GOS的影響 如圖7所示，在乳糖濃度、加酶量、反應溫度和反應pH一定時，隨著反應時間的增加，其GOS合成產率呈現出先升高后下降的趨勢，這可能是反應時間過長，底物濃度降低，導致轉糖苷作用減弱，而合成的GOS可能又會發生水解，最終使得GOS總產率下降[26]。隨著反應時間的增加，DP4產率卻逐漸升高，可能是反應時間的延長有利于高聚合度GOS的合成。綜合考慮GOS產率及DP4產率，選取反應16 h進行后續實驗。2.3.5 反應pH對合成GOS的影響 由圖8可知，反應pH為4.5～5.5時，GOS合成產率增加，在反應pH5.5時，GOS產率為 12.03%±0.53%，達到最高；當pH高于5.5時，GOS產率隨著pH的升高而下降，造成這種現象的原因可能是：米曲霉來源的β-半乳糖苷酶在酸性條件下，酶的催化活性更強，具有最適反應pH。而當反應pH提高，DP4產率逐漸下降，可能是高聚合度的GOS發生了水解的緣故。綜上所述，確定該反應體系的最適pH為5.5。

圖7 不同反應時間對合成GOS的影響Fig.7 Effect of different reaction time on the synthesis of GOS

圖8 不同反應pH對合成GOS的影響Fig.8 Effect of different reaction pH on the synthesis of GOS

2.4 響應面試驗結果

在單因素實驗的基礎上，選定加酶量8 U/g、反應溫度50 ℃、反應時間16 h、反應pH5.5為響應面Box-Behnken試驗的中心點，GOS產率（Y1）與DP4產率（Y2）為響應值，對Box-Behnken試驗結果進行方差分析和多元線性回歸二項式擬合，響應面試驗設計及結果如表2。

2.4.1 GOS產率的回歸模型及方差分析 對表2中GOS產率（Y1）相關數據進行多元二次回歸擬合及方差分析，分析結果見表3。

表2 Box-Behnken試驗設計及響應值Table 2 Design and response value of Box-Behnken experiment

根據表3試驗結果，得到回歸方程（1）為：

由表3的方差分析結果可知，模型的P＜0.0001，極顯著；失擬項P=0.1198＞0.05，不顯著，說明該模型成立。模型的決定系數R2=0.9909，校正決定系數R2Adj=0.9807，變異系數為2.42%，說明擬合度較好，置信度較高，實驗操作可行，可以用此模型來預測低聚半乳糖合成工藝。

表3 Y1回歸模型方差分析結果Table 3 Variance analysis of regression model of Y1

該回歸模型中的一次項A、B、D，二次項A2、B2、C2、D2的P值均小于0.01，具極顯著性，由F值可知，四個因素對GOS產率的影響大小依次為B（反應溫度）＞A（加酶量）＞D（反應 pH）＞C（反應時間）。交互項中 AD、BC的P值小于 0.01，BD的P值小于0.05，說明加酶量和反應pH、反應溫度和反應時間及反應溫度和反應pH交互作用顯著。

2.4.2 GOS產率的響應面分析 利用Design-Expert 12.0軟件對四個因素的交互作用進行分析，選取了AD、BC、BD這三組響應面圖和等高線圖，直觀表示這四個因素對Y1（GOS產率）的交互作用[27-28]。其中響應面坡度越陡峭，表示該因素對于其他因素的改變越敏感，對GOS產率的影響越大。等高線可以直觀地反應兩因素交互作用的顯著程度，其中橢圓形表示兩因素之間作用顯著，而接近圓形則表示不顯著[27,29]。利用軟件做出的響應面與等高線圖如圖9所示，顯示四個變量中任取兩個變量為0水平時，其余兩個變量同時變化對GOS產率的影響。

由圖9可知，當反應溫度為50 ℃、反應時間16 h時，從響應面坡度可以看出，A和D的交互作用對GOS產率有顯著影響；而當加酶量為8 U/g、反應pH5.5固定不變時，B小于50 ℃，C小于16 h時，等高線較密集，表明在此范圍內B和C的交互作用對GOS產率的影響顯著；當固定加酶量8 U/g、反應時間16 h時，B小于50 ℃，D小于5.5時，等高線較密集，表明在此范圍內B和D的交互作用對GOS產率的影響顯著。以上結果與方差分析的結果一致。2.4.3 DP4產率的回歸模型及方差分析 對表2中DP4產率（Y2）相關數據進行多元二次回歸擬合及方差分析，分析結果見表4。

圖9 加酶量和反應pH、反應溫度和反應時間、反應溫度和反應pH的交互作用對GOS產率的響應面圖和等高線圖Fig.9 Response surface and contour plots of the interaction effect between enzyme addition and reaction pH values, reaction temperature and reaction time, reaction temperature and reaction pH values on the yield of GOS

根據表4實驗結果，得到回歸方程（2）為：

由表4的方差分析結果可知，模型的P＜0.0001，極顯著；失擬項P=0.2043＞0.05，不顯著，說明該模型成立。模型的決定系數R2=0.9586，校正決定系數R2Adj=0.9172，變異系數為8.04%，說明擬合度較好，置信度較高，實驗操作可行，可以用此模型來預測低聚半乳糖合成工藝。

表4 Y2回歸模型方差分析結果Table 4 Variance analysis of regression model of Y2

該回歸模型中的一次項A、D的P值均小于0.05，具有顯著性；二次項 A2、B2、C2、D2的P值均小于0.01，具極顯著性。由F值可知，四個因素對DP4產率的影響大小依次為A（加酶量）＞D（反應pH）＞B（反應溫度）＞C（反應時間）。交互項中 AD、BC的P值小于0.01，BD的P值小于0.05，說明加酶量和反應pH、反應溫度和反應時間及反應溫度和反應pH交互作用顯著。

2.4.4 DP4產率的響應面分析 利用Design-Expert 12.0軟件對四個因素的交互作用進行分析，選取了AD、BC、BD這三組響應面圖和等高線圖，直觀表示這四個因素對Y2（DP4產率）的交互作用[27-28]。其中響應面坡度越陡峭，表示該因素對于其他因素的改變越敏感，對DP4產率的影響越大。等高線可以直觀地反應兩因素交互作用的顯著程度，其中橢圓形表示兩因素之間作用顯著，而接近圓形則表示不顯著[27,29]。利用軟件做出的響應面與等高線圖如圖10所示，顯示四個變量中任取兩個變量為0水平時，其余兩個變量同時變化對DP4產率的影響。

由圖10可知，當反應溫度為50 ℃、反應時間16 h時，從響應面坡度可以看出，A和D的交互作用對DP4產率有顯著影響；而當加酶量為8 U/g、反應pH5.5固定不變時，B小于50 ℃，C小于16 h時，等高線較密集，表明在此范圍內B和C的交互作用對DP4產率的影響顯著；當固定加酶量8 U/g、反應時間16 h時，B小于50 ℃，D小于5.5時，等高線較密集，表明在此范圍內B和D的交互作用對DP4產率的影響顯著。以上結果與方差分析的結果一致。

圖10 加酶量和反應pH、反應溫度和反應時間、反應溫度和反應pH的交互作用對DP4產率的響應面圖和等高線圖Fig.10 Response surface and contour plots of the interaction effect between enzyme addition and reaction pH values, reaction temperature and reaction time, reaction temperature and reaction pH values on the yield of DP4

2.4.5 驗證試驗 通過響應面試驗所獲得的GOS產率和DP4產率的二次回歸數學模型進行分析，其結果顯示，低聚半乳糖合成最佳工藝為：加酶量8.253 U/g、反應溫度 49.244 ℃、反應時間 16.011 h、反應pH5.616。在此工藝下，GOS產率預測值為14.692%，DP4產率預測值為3.334%。為了驗證響應面結果的準確性，采用上述低聚半乳糖合成工藝進行實驗，為方便實際操作，將條件調整為加酶量8.25 U/g、反應溫度49 ℃、反應時間16 h、反應pH5.6，測定GOS產率及DP4產率，實驗重復三次，結果表明GOS產率為14.61%±0.19%，DP4產率為3.31%±0.15%，與理論值相差不大，實驗結果與模型切合度較好。因此，此響應面所獲得的低聚半乳糖合成工藝準確可靠。

3 結論

本研究在單因素實驗的基礎上，以GOS產率和DP4產率為響應值，對低聚半乳糖合成工藝進行響應面試驗，并建立了響應值和各個因素之間的數學模型。此模型能夠較好地預測GOS產率及DP4產率，通過實驗與模型驗證，很好地證明了模型的可靠性，并得到低聚半乳糖合成最佳工藝：加酶量8.25 U/g、反應溫度49 ℃、反應時間16 h、反應pH5.6。在此條件下，GOS產率達到14.61%±0.19%，DP4產率為3.31%±0.15%。結果表明，優化后的工藝參數具有可行性，能夠在提高GOS總產率的前提下，有效地選擇性提高了DP4產率，這可為高聚合度低聚半乳糖的定向合成及功能性應用提供一定的理論依據，有望為功能性低聚糖類特醫食品的研發提供一定的數據參考。

本研究僅在實驗室水平考察了選擇性提高高聚合度GOS的工藝參數優化，而對β-半乳糖苷酶的高效利用尚缺乏深入研究，導致反應過程中酶及底物的利用率不高。因此，后續將進一步開展β-半乳糖苷酶活性強化研究及酶固定化工藝研究[30-32]，提高酶及底物利用率，以期達到更高的生產效率。