多功能層狀雙氫氧化物納米復(fù)合材料的制備及其體外抗腫瘤性能

葉玉函， 張紅梅， 陳 霞， 朱利民

(東華大學(xué) 化學(xué)化工與生物工程學(xué)院， 上海 201620)

長(zhǎng)期以來(lái)，化療一直是癌癥的首選治療方法。然而，傳統(tǒng)化學(xué)治療劑的靶向性差，容易從體內(nèi)被清除并且具有嚴(yán)重的毒副作用。為了解決這些困難，人們廣泛探索了納米載體在化療中的應(yīng)用，通過(guò)包封或者吸附等手段將藥物小分子整合于納米材料中形成新型藥物遞送系統(tǒng)(drug delivery systems, DDSs)，實(shí)現(xiàn)藥物的有效傳遞[1-2]。

在過(guò)去的幾十年里，二維納米材料由于其獨(dú)特的理化性質(zhì)在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域引起了極大的關(guān)注，如超薄結(jié)構(gòu)的氧化石墨烯[3]、黑磷[4]、過(guò)渡金屬二鹵化物[5]等都被用作藥物載體。然而這些二維納米材料通常存在制備難度大、負(fù)載能力有限或生物相容性差等問(wèn)題，在靶向DDSs中的應(yīng)用受到限制。因此，在二維材料合成和探索的基礎(chǔ)上，尋找一種生物相容性高、易于改性且具有高負(fù)載量的材料成為一種挑戰(zhàn)。

在上述研究的基礎(chǔ)上，擬采用水熱法制備層狀雙氫氧化物納米片(LDH NSs)，然后在LDH NSs的表面修飾改性聚乙二醇(PEG)，通過(guò)酰胺化反應(yīng)引入靶向肽B3int制備功能化層狀雙氫氧化物納米片(LDH-PEG-B3int NSs)。將不同質(zhì)量濃度的阿霉素(DOX)和光熱劑吲哚菁綠(ICG)與LDH-PEG-B3int NSs共混，通過(guò)物理吸附成功構(gòu)建載藥復(fù)合物(DOX-ICG@LDH-PEG-B3int)。期望通過(guò)以上安全、簡(jiǎn)便的方法合成具有良好生物相容性、化療與光熱治療相結(jié)合、主動(dòng)靶向腫瘤的多功能LDH納米復(fù)合材料。

1 試驗(yàn)部分

1.1 試驗(yàn)材料與儀器

六水合硝酸鎂Mg(NO3)2·6H2O、九水合硝酸鋁Al(NO3)3·9H2O、無(wú)水乙醇、氫氧化鈉(NaOH)，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；氨基化PEG，上海亞亦生物科技有限公司；1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)、N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)、二甲基亞砜(DMSO)、戊二醛，阿拉丁生化科技股份有限公司；DOX、ICG，上海麥克林生化科技股份有限公司；磷酸緩沖鹽(PBS)溶液、DMEM高糖培養(yǎng)基、1640不完全培養(yǎng)液、雙抗、胰蛋白酶、胎牛血清，美國(guó)Gibco公司；Calcein-AM/PI試劑盒、3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT)、4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)，江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司；小鼠黑色素瘤細(xì)胞(B16)、小鼠成纖維細(xì)胞(3T3)，中國(guó)科學(xué)院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所；其余藥品和透析袋均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。所用藥品均為分析純。所用水均為Milli-Q Plus 185凈水系統(tǒng)純化所得超純水。

高速離心機(jī)(TG16A型，離心半徑(R)為32.5 mm，上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司)；電子分析天平(GL124-1SCN型，上海精科儀器有限公司)；磁力攪拌器(C-MAGHS10 型，德國(guó) IKA 公司)；馬弗爐(上海慧泰儀器制造有限公司)；掃描電子顯微鏡(TM-1000型，日本日立公司)；超聲波清洗機(jī)(SCQ-5201C1型，上海聲彥超聲波儀器有限公司)；冷凍干燥機(jī)(FD-1D-50型，北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)試劑有限公司)；紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(UV3600 型，日本島津公司)；熱重分析儀(CLARUS SQ8-STA8000型，美國(guó)珀金埃爾默公司)；酶標(biāo)儀(MK3型，普朗醫(yī)療器械公司)；激光掃描共聚焦顯微鏡(FV1000 型，日本奧林巴斯有限公司)；倒置熒光顯微鏡(DM IL LED型，德國(guó)Leica公司)；Zeta電位分析儀(Zetasizer Nano ZS90型，英國(guó)馬爾文公司)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 LDH NSs的制備

采用水熱法制備LDH NSs。將0.544 g NaOH溶于60 mL超純水中，將1.538 g Mg(NO3)2·6H2O和0.75 g Al (NO3)3·9H2O的混合物溶于40 mL超純水中，然后將該溶液逐滴滴加到前述NaOH溶液中。在氮?dú)鈿夥障乱?00 r/min的轉(zhuǎn)速攪拌30 min，離心(轉(zhuǎn)速為11 000 r/min,R=32.5 mm)收集產(chǎn)物并用超純水洗滌3次，分散在70 mL超純水中。隨后在100 ℃的高壓釜中水熱放置16 h后獲得LDH NSs。

1.2.2 LDH-PEG NSs的制備

將10 mg H2N—PEG—NH2、2 mg LDH NSs分散在裝有10 mL水溶液的棕色試劑瓶中，超聲30 min使其分散均勻后再磁力攪拌12 h，得到的混合溶液在13 000 r/min的轉(zhuǎn)速下離心(R=32.5 mm)15 min收集沉淀，冷凍干燥得到LDH-PEG NSs。

1.2.3 LDH-PEG-B3int NSs的制備

稱(chēng)量20 mg LDH-PEG NSs溶解于裝有10 mL PBS溶液(pH=7.4)的小燒杯中，向其中加入11.4 mg EDC和6.9 mg NHS 并超聲15 min，然后向溶液中加入10 mg B3int，在室溫下攪拌12 h。反應(yīng)后的溶液在13 000 r/min的轉(zhuǎn)速下離心(R=32.5 mm)后收集沉淀，冷凍干燥，得到LDH-PEG-B3int NSs。

1.2.4 DOX-ICG@LDH-PEG-B3int的制備

取10 mg LDH-PEG-B3int NSs溶解于pH=7.4的PBS溶液中，再取10 mg DOX溶解于DMSO中，迅速將二者混合，避光條件下磁力攪拌24 h。然后用截留分子量為3.5 kDa的透析袋對(duì)混合溶液透析3 d以純化，收集產(chǎn)物DOX@LDH-PEG-B3int納米顆粒備用。同時(shí)制備DOX@LDH-PEG作為對(duì)照組。取10 mg ICG完全溶于DMSO后與10 mg DOX@LDH-PEG-B3int混合并攪拌24 h，然后將混合溶液倒入截留分子量為3.5 kDa的透析袋中透析以除去未負(fù)載的ICG，收集產(chǎn)物冷凍干燥得到DOX-ICG@LDH-PEG-B3int。DOX-ICG@LDH-PEG-B3int的合成示意圖如圖1所示。用同樣的方法制備ICG@LDH-PEG-B3int。

1.2.5 DOX-ICG@LDH-PEG-B3int的載藥性測(cè)定

用PBS溶液配制不同質(zhì)量濃度(2.5、4.0、5.0、7.5、10.0 μg/mL)的DOX溶液，用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定λ=490 nm處溶液的吸光度并繪制DOX溶液吸光度-質(zhì)量濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線(y=0.041 6x+0.035 8，R2=0.999 7)。

取DOX-ICG@LDH-PEG-B3int粉末充分溶解于超純水，以10 000 r/min離心(R=32.5 mm)20 min，收集上清液，用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定溶液的吸光度，再根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算復(fù)合材料中DOX的含量，并根據(jù)式(1)和(2)分別計(jì)算材料的載藥率(L)和包封率(E)。

(1)

(2)

式中：m0為DOX的投藥量，mg；m1為上清液中DOX的質(zhì)量，mg；m為載藥納米顆粒的總質(zhì)量，mg。

1.2.6 DOX-ICG@LDH-PEG-B3int的釋藥性測(cè)定

探索pH值和NIR對(duì)藥物體外釋放的影響。分別稱(chēng)取2 mg DOX-ICG@LDH-PEG-B3int凍干粉末溶于2 mL不同pH值(pH=5.0, 7.4)的PBS溶液中，將上述溶液分別裝入4個(gè)截留分子量為3.5 kDa的透析袋中，再準(zhǔn)備4個(gè)50 mL的離心管，將上述透析袋放入其中，分別標(biāo)記為pH=5.0、pH=5.0+NIR、pH=7.4、pH=7.4+NIR，每個(gè)離心管中加入18 mL相應(yīng)pH值的PBS溶液。在不同的時(shí)間點(diǎn)(0.5、1、2、4、8、12、24、36、48、72 h)取透析袋外部的溶液各1 mL，并補(bǔ)充相應(yīng)pH值的PBS溶液1 mL。用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定所取溶液的吸光度并代入DOX標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，計(jì)算不同時(shí)間點(diǎn)釋放的DOX量。所有試驗(yàn)均重復(fù)3次。

1.3 材料表征

1.3.1 表面形貌

分別配制質(zhì)量濃度為0.5 g/L的LDH NSs、LDH-PEG-B3int NSs、DOX-ICG@LDH-PEG-B3int溶液，將溶液滴在硅片上自然晾干，用掃描電子顯微鏡觀察其形貌。使用圖像分析軟件ImageJ采集100片不同納米片并測(cè)量納米片直徑，然后用Origin軟件對(duì)測(cè)得的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，以獲得納米片平均直徑及其分布。

1.3.2 熱重分析

在氮?dú)鈿夥障率褂?～5 mg樣品以10 ℃/min的速率從50 ℃加熱到500 ℃進(jìn)行熱重分析。

1.3.3 紫外-可見(jiàn)吸收光譜分析

分別取用PBS溶液溶解的質(zhì)量濃度為0.05 g/L的DOX、ICG、DOX-ICG@LDH-PEG-B3int溶液各800 μL，超聲10 min使其充分溶解，然后進(jìn)行紫外光譜掃描以確定DOX和ICG的成功加載。

1.3.4 Zeta電勢(shì)分析

分別配置質(zhì)量濃度為0.5 g/L的LDH NSs、LDH-PEG NSs、LDH-PEG-B3int NSs、DOX@LDH-PEG-B3int、DOX-ICG@LDH-PEG-B3int溶液，超聲10 min使其分散均勻后各取800 μL于比色皿中，用Zeta電位分析儀測(cè)量不同樣品的Zeta電位。

1.4 體外細(xì)胞攝取

將B16細(xì)胞和3T3細(xì)胞分別接種于共聚焦培養(yǎng)皿中(2×105個(gè))，在細(xì)胞培養(yǎng)箱(37 ℃，5% CO2)中培養(yǎng)24 h，棄去培養(yǎng)基，用PBS溶液清洗3次，分別加入一定體積含游離DOX、DOX@LDH-PEG、DOX@LDH-PEG-B3int溶液(DOX的最終質(zhì)量濃度為5 μg/mL)的新鮮培養(yǎng)液并且設(shè)置PBS溶液作為對(duì)照組。孵育4 h后棄去培養(yǎng)基，用PBS溶液清洗3次。最后，將細(xì)胞用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.5%的戊二醛水溶液在4 ℃固定15 min。用DAPI對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行染色后用PBS溶液多次洗滌(避光條件下)，隨后用激光掃描共聚焦顯微鏡(laser scanning confocal microscopy, LSCM)記錄圖像。

1.5 體外細(xì)胞毒性

使用MTT比色法檢測(cè)DOX-ICG@LDH-PEG-B3int藥物遞送系統(tǒng)對(duì)B16細(xì)胞的殺傷作用。將B16細(xì)胞以1×104個(gè)/孔的密度接種于含1640完全培養(yǎng)液(10%胎牛血清、1%雙抗、89% 1640不完全培養(yǎng)液)的96孔板中，培養(yǎng)24 h后棄去該培養(yǎng)基，用PBS溶液洗滌3次后每孔加入100 μL不同的樣品溶液，再補(bǔ)加100 μL 1640完全培養(yǎng)液。設(shè)置4組不同的治療組：(1)游離DOX；(2)ICG+NIR；(3)DOX-ICG@LDH-PEG-B3int；(4)DOX-ICG@LDH-PEG-B3int+NIR。對(duì)于NIR激光照射組，孵育12 h后，用激光功率密度為2.0 W/cm2的808 nm NIR激光照射5 min。繼續(xù)培養(yǎng)12 h后棄去培養(yǎng)基，用PBS溶液清洗3次，每孔加入20 μL質(zhì)量濃度為5 g/L的MTT溶液，在黑暗中孵育4 h后，向每個(gè)孔中添加200 μL DMSO，15 min后通過(guò)酶標(biāo)儀測(cè)定在570 nm下細(xì)胞吸光密度(optical density, OD)。每組樣品設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，每個(gè)樣品平行測(cè)定3次。細(xì)胞存活率計(jì)算如式(3)所示。

細(xì)胞存活率=(試驗(yàn)組OD-空白組OD)/(對(duì)照組OD-空白組OD)×100%

(3)

同樣采用MTT比色法來(lái)檢測(cè)DOX-ICG@LDH-PEG-B3int藥物遞送系統(tǒng)的生物相容性。將3T3細(xì)胞接種于含DMEM高糖培養(yǎng)基的96孔板中，每孔細(xì)胞為104個(gè)。用游離DOX、LDH-PEG-B3int NSs、DOX-ICG@LDH-PEG-B3int組處理3T3細(xì)胞。培養(yǎng)24 h后棄去培養(yǎng)基，用PBS溶液清洗3次，每孔加入20 μL質(zhì)量濃度為5 g/L的MTT溶液，在黑暗中孵育4 h后，向每個(gè)孔中添加200 μL DMSO，15 min后用酶標(biāo)儀記錄細(xì)胞在570 nm下的OD值并按照式(3)計(jì)算細(xì)胞存活率。每組樣品設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，每個(gè)樣品平行測(cè)定3次。

采用calcein-AM/PI雙染色法更直觀地評(píng)估各材料的體外抗腫瘤效果。將B16細(xì)胞接種于6孔板，每孔細(xì)胞為2×105個(gè)。培養(yǎng)24 h后棄去培養(yǎng)基并用PBS溶液沖洗3次，每孔分別加入1 mL不同材料(每種材料添加的質(zhì)量濃度根據(jù)最終DOX的半數(shù)致死量而定)，再補(bǔ)加1 mL 1640完全培養(yǎng)液。根據(jù)治療方式的不同設(shè)為6組：(1)PBS溶液對(duì)照組；(2)游離DOX；(3)ICG+NIR；(4)ICG@LDH-PEG-B3int+NIR；(5)DOX-ICG@LDH-PEG-B3int；(6)DOX-ICG@LDH-PEG-B3int+NIR。對(duì)于NIR激光照射組，孵育12 h后每孔用808 nm NIR激光(功率密度為2.0 W/cm2)照射10 min后繼續(xù)培養(yǎng)12 h。溫育后，將細(xì)胞用PBS溶液洗滌3次，加入500 μL calcein-AM(2 μmol/L)和PI(8 μmol/L)的混合溶液進(jìn)行染色。30 min后，將細(xì)胞用PBS溶液洗滌3次，然后用倒置熒光顯微鏡采集細(xì)胞圖像。

2 結(jié)果與討論

2.1 材料的制備與性質(zhì)

2.1.1 LDH NSs 及其復(fù)合物的表觀形貌

層狀雙氫氧化物及其納米復(fù)合物的SEM圖及納米片直徑分布如圖2所示。由圖2可知，LDH NSs、LDH-PEG-B3int NSs、DOX-ICG@LDH-PEG-B3int具有典型的層狀雙氫氧化物六邊形形貌，通過(guò)ImageJ和Origin軟件分析其平均直徑分別為69.64、74.53、77.68 nm，說(shuō)明B3int的修飾以及DOX和ICG的加載不會(huì)顯著影響LDH NSs的大小和形貌。

圖2 LDH NSs、LDH-PEG-B3int NSs、DOX-ICG@LDH-PEG-B3int的SEM和納米片直徑分布圖

2.1.2 熱重分析

LDH NSs、LDH-PEG NSs、LDH-PEG-B3int NSs的TGA熱分析結(jié)果如圖3所示。由圖3可知，LDH NSs的熱分解過(guò)程可分為以下3個(gè)階段：第一階段，溫度小于200 ℃時(shí)，LDH NSs失去層間水，層間距變小；第二階段，溫度在200～400 ℃時(shí)，繼續(xù)失去層間水，碳酸根離子此時(shí)開(kāi)始分解，LDH NSs結(jié)構(gòu)改變，形成復(fù)合金屬氧化物；第三階段，溫度在400～500 ℃時(shí)，大部分碳酸根轉(zhuǎn)化為CO2，完全失去水分，形成強(qiáng)堿性的金屬化合物。LDH NSs加熱到500 ℃時(shí)失重率為40.63%，而LDH-PEG NSs和LDH-PEG-B3int NSs的失重率分別為42.54%和77.23%，這主要?dú)w功于PEG和B3int在溫度50～500 ℃內(nèi)發(fā)生的熱解，從而證實(shí)PEG和B3int的成功連接。

圖3 LDH NSs、LDH-PEG NSs、LDH-PEG-B3int NSs的TGA熱分析圖

2.1.3 紫外-可見(jiàn)吸收光譜分析

DOX、ICG、DOX-ICG@LDH-PEG-B3int的紫外-可見(jiàn)吸收光譜圖如圖4所示。由圖4可以看出，DOX-ICG@LDH-PEG-B3int在λ=480 nm處顯示特征性DOX吸收峰，而在λ=795 nm處顯示特征性ICG峰，表明其已成功加載了DOX和ICG。

圖4 DOX、ICG和DOX-ICG@LDH-PEG-B3int的紫外-可見(jiàn)光吸收光譜

2.1.4 Zeta電勢(shì)分析

在藥物遞送系統(tǒng)制備過(guò)程中，可以通過(guò)分析各中間體的Zeta電勢(shì)變化判斷材料是否被成功修飾。DOX-ICG@LDH-PEG-B3int制備過(guò)程中各中間體和最終材料的Zeta電勢(shì)如圖5所示。由圖5可知，LDH NSs、LDH-PEG NSs、LDH-PEG-B3int NSs、DOX@LDH-PEG-B3int、DOX-ICG@LDH-PEG-B3int的Zeta電勢(shì)分別為 39.5、28.5、-12.7、24.1和12.6 mV。LDH NSs經(jīng)PEG修飾以后的Zeta電勢(shì)由39.5 mV降低為28.5 mV，表明LDH-PEG NSs的成功制備。LDH-PEG NSs接枝呈負(fù)電荷的B3int后，其Zeta電勢(shì)由28.5 mV變?yōu)樨?fù)值(-12.7 mV)，表明B3int成功連接。負(fù)載DOX以后的DOX@LDH-PEG-B3int的Zeta電勢(shì)由負(fù)值上升至24.1 mV，電勢(shì)的明顯變化證明DOX已成功吸附到LDH-PEG-B3int NSs上。負(fù)載ICG后的電勢(shì)較DOX@LDH-PEG-B3int降低了11.5 mV，進(jìn)一步表明DOX-ICG@LDH-PEG-B3int的成功制備。

圖5 LDH NSs、LDH-PEG NSs、LDH-PEG-B3int NSs、DOX@LDH-PEG-B3int、DOX-ICG@LDH-PEG-B3int的電勢(shì)分析圖

2.2 載藥率、包封率及藥物釋放測(cè)試

將載藥試驗(yàn)測(cè)得上清液中DOX的吸光度代入DOX的標(biāo)準(zhǔn)曲線中，并根據(jù)式(1)和(2)計(jì)算得出DOX-ICG@LDH-PEG-B3int的載藥率和包封率分別為18.62%和89.62%。

DOX-ICG@LDH-PEG-B3int在有、無(wú)NIR激光照射和不同pH值下的藥物釋放曲線如圖6所示。

圖6 DOX-ICG@LDH-PEG-B3int在不同pH值和有、無(wú)NIR激光照射下的DOX累計(jì)釋放曲線

由圖6可知，在72 h內(nèi)，沒(méi)有NIR激光存在時(shí)，pH=5.0和pH=7.4條件下DOX累計(jì)釋放率分別為53.9%和32.1%。酸性條件下釋藥量增大，這可能是因?yàn)镈OX中氨基質(zhì)子化增加，并且與LDH-PEG-B3int NSs的靜電相互作用減弱，促進(jìn)藥物的釋放，該特性有利于復(fù)合物在腫瘤內(nèi)環(huán)境靶向釋放藥物。在NIR激光存在下，DOX累計(jì)釋放率高于相同pH值條件下的藥物釋放率。這可能是因?yàn)镮CG產(chǎn)生的高溫使DOX與復(fù)合材料之間的結(jié)合變?nèi)踹M(jìn)而加速藥物的釋放。由此表明制備的DOX-ICG@LDH-PEG-B3int具有pH和NIR雙重響應(yīng)特性。

2.3 體外細(xì)胞攝取分析

通過(guò)激光掃描共聚焦顯微鏡記錄PBS溶液對(duì)照組、游離DOX組、DOX@LDH-PEG組和DOX@LDH-PEG-B3int組分別在B16(圖7(a))和3T3(圖7(b))細(xì)胞中的攝取情況。由圖7可知：用游離DOX處理過(guò)的B16細(xì)胞和3T3細(xì)胞都有DOX的紅色熒光，這是因?yàn)橛坞x的DOX不具備靶向性能，其能被兩種細(xì)胞攝取；而經(jīng)DOX@LDH-PEG處理過(guò)的B16細(xì)胞的紅色熒光強(qiáng)度大于3T3細(xì)胞，這是因?yàn)镈OX@LDH-PEG通過(guò)增強(qiáng)滲透滯留效應(yīng)更多地聚集在B16細(xì)胞中；DOX@LDH-PEG-B3int組處理過(guò)的B16細(xì)胞的紅色熒光強(qiáng)度大于3T3細(xì)胞，主要是因?yàn)榘邢螂腂3int與整合素αvβ3的特異性結(jié)合，導(dǎo)致B16細(xì)胞吸收的DOX@LDH-PEG-B3int遠(yuǎn)遠(yuǎn)多于3T3細(xì)胞。結(jié)果表明制備的納米復(fù)合材料DOX@LDH-PEG-B3int具有良好的靶向性。

Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ分別為PBS溶液對(duì)照組、游離DOX、DOX@LDH-PEG和DOX@LDH-PEG-B3int;藍(lán)色熒光：DAPI標(biāo)記的細(xì)胞核；紅色熒光：DOX。

2.4 體外細(xì)胞毒性及細(xì)胞相容性分析

B16細(xì)胞經(jīng)MTT處理后得到的細(xì)胞存活率如圖8所示。由圖8可知，經(jīng)DOX-ICG@LDH-PEG-B3int處理后細(xì)胞存活率顯著下降并且降幅大于游離DOX組，主要原因是B3int具有靶向性，能幫助抗癌藥物DOX到達(dá)腫瘤細(xì)胞。此外，在DOX質(zhì)量濃度為15 μg/mL時(shí)，經(jīng)DOX-ICG@LDH-PEG-B3in處理的細(xì)胞存活率為32.7%，而經(jīng)DOX-ICG@LDH-PEG-B3int+NIR協(xié)同治療組處理的細(xì)胞存活率僅為25.0%，且在各個(gè)DOX質(zhì)量濃度下協(xié)同治療組的細(xì)胞存活率均為最低，這主要?dú)w因于光熱治療/化療聯(lián)合治療提供的協(xié)同作用。

圖8 游離DOX、ICG+NIR、DOX-ICG@LDH-PEG-B3int、DOX-ICG@LDH-PEG-B3int+NIR對(duì)B16的細(xì)胞毒性分析圖

用正常細(xì)胞評(píng)價(jià)材料的生物相容性結(jié)果如圖9所示。由圖9可知，除了游離DOX組處理的3T3細(xì)胞存活率隨DOX質(zhì)量濃度的增大而顯著下降外，其他兩組的細(xì)胞存活率均大于90%。由此說(shuō)明，所制備的載藥納米復(fù)合物DOX-ICG@LDH-PEG-B3int對(duì)正常細(xì)胞的毒性很小，可忽略不計(jì)。

圖9 游離DOX、LDH-PEG-B3int NSs、DOX-ICG@ LDH-PEG-B3int對(duì)3T3細(xì)胞的毒性分析圖

采用Calcein-AM/PI雙染色法觀察各治療組的抗腫瘤效果，結(jié)果如圖10所示，其中，活細(xì)胞為綠色，死細(xì)胞為紅色。由圖10可知，化療聯(lián)合光熱治療組(DOX-ICG@LDH-PEG-B3int+NIR)的細(xì)胞死亡最多。這說(shuō)明LDH可以作為優(yōu)良的藥物載體，負(fù)載靶向肽B3int和化療藥物DOX的同時(shí)加載光熱劑ICG，在促進(jìn)腫瘤凋亡方面具有良好的治療效果。

圖10 不同配方治療細(xì)胞Calcein-AM/PI雙染色的熒光圖像

3 結(jié) 語(yǔ)

本文成功制備層狀雙氫氧化物藥物遞送系統(tǒng)DOX-ICG@LDH-PEG-B3int，具有規(guī)則的六邊形形貌，終產(chǎn)物平均直徑為77.68 nm，載藥率為18.62%，包封率為89.62%。體外藥物釋放試驗(yàn)表明制備的藥物遞送系統(tǒng)具有pH、NIR雙重刺激響應(yīng)性藥物釋放特性。通過(guò)LSCM證明DOX-ICG@LDH-PEG-B3int具有靶向癌細(xì)胞的能力且不會(huì)停留在正常細(xì)胞，能夠選擇性殺傷癌細(xì)胞。通過(guò)MTT和Calcein-AM/PI雙染色法表明DOX-ICG@LDH-PEG-B3int對(duì)癌細(xì)胞具有殺傷作用而對(duì)正常細(xì)胞幾乎無(wú)毒。ICG產(chǎn)生的熱量和DOX均能殺死癌細(xì)胞，二者聯(lián)合使用可提高殺傷效率，實(shí)現(xiàn)良好的協(xié)同治療效果，表明DOX-ICG@LDH-PEG-B3int有望進(jìn)一步用于體內(nèi)治療。