甘蔗野生種割手密雜交F1代SSR鑒定和遺傳分析

田春艷，邊 芯，董立華，吳才文，郎榮斌，俞華先，張 鈺，桃聯安，經艷芬*

甘蔗野生種割手密雜交F1代SSR鑒定和遺傳分析

田春艷1，邊 芯1，董立華1，吳才文2，郎榮斌1，俞華先1，張 鈺1，桃聯安1，經艷芬1*

1. 云南省農業科學院甘蔗研究所瑞麗育種站，云南瑞麗 678600；2. 云南省農業科學院甘蔗研究所/云南省甘蔗遺傳改良重點實驗室，云南開遠 661699

割手密具有宿根性好、抗逆性強和適應性廣等特性，是甘蔗育種中利用最多，育種成效最顯著的野生種。進一步發掘和利用割手密優良抗逆基因資源對現代甘蔗品種改良具有重要意義。為獲得更多優良割手密的真實雜交后代，本研究以2個地方種為母本、3個野生割手密為父本進行雜交，獲得3個F1群體，共359份雜交后代。并從21對SSR標記中篩選出在雙親中具有多態性且擴增條帶清晰的6對SSR標記，基于高通量的熒光毛細管電泳檢測平臺進行雜交后代真實性鑒定、親本指紋圖譜分析、遺傳相似性分析和特異性條帶的遺傳分析。結果表明：共篩選出的6對SSR標記對5個親本材料的分辨率較高，擴增多態性好，每個親本都具有其特異的SSR指紋，可有效鑒定其雜交后代血緣的真實性；其中，359份F1個體中共鑒定出真雜種262份，3個組合的真雜種率分別為67.77%、75.51%、75.66%，平均值為72.98%。遺傳相似性分析表明2個地方種的遺傳相似性系數為0.70，3個割手密兩兩間的遺傳相似性系數分別為0.53、0.60和0.70，地方種和割手密間為0.38～0.53，種間遺傳相似性系數小于種內。親本特異性SSR位點的遺傳分析結果表明，3個組合的母本特異性條帶遺傳率分別為68.47%、80.96%、73.39%，平均值為74.27%，而父本特異性條帶遺傳率分別為58.90%、76.60%、61.45%，平均值為65.65%，雜交后代具有偏母本遺傳傾向，因此，在甘蔗雜交育種中應選擇綜合農藝性狀較好的材料作為母本。本研究結果為今后割手密雜交后代的鑒定提供了高效、可靠的SSR標記選擇，同時鑒定出的真實割手密后代群體可為開展割手密優異性狀的遺傳研究提供種質材料，為選育超親遺傳株系提供科學依據。

甘蔗；割手密；SSR；雜種鑒定；遺傳

有性雜交育種是甘蔗育種上最常用、成效最顯著的方法，在我國育成的甘蔗品種中，通過有性雜交育成的甘蔗品種占98%以上[1]。而作物種質資源，尤其是優異種質的發掘和利用是作物育種取得突破的關鍵[2]。玉米和水稻的育種經驗表明，每一次糧食的重大增產皆得益于少數幾個關鍵種質的發掘和利用[3]。

早在20世紀初，印尼利用爪哇割手密（L）與熱帶種（）雜交選育出‘POJ2878’，成為風靡全球的蔗王。印度利用印度割手密與熱帶種、印度種（）雜交，選育出‘Co213’‘Co281’‘Co290’等全球性著名的親本或品種，現今絕大多數甘蔗商業品種均是含有‘POJ’‘Co’系列品種的血緣[4-5]。割手密成為了甘蔗育種史上最重要的種質資源之一，是甘蔗屬內利用最多，育種成效最顯著的野生種。然而，甘蔗是典型的中日照作物，只有在特定光照時間段（12～12.5 h）才能開花[6]。在我國，除海南島以外的大部分地區甘蔗都不能自然開花，或者雖有少量開花但親本花期不遇。甘蔗地方果蔗屬于難花親本，即使在人工光周期誘導下開花率也不高且花期較晚，而割手密自然條件下就可開花，且花期較早。地方種開花誘導難、晚花，與割手密雜交花期不遇、雜交結實率低等問題，使其獲得后代雜交群體的難度較大，進而影響了甘蔗遺傳圖譜構建、圖位克隆、重要性狀相關的QTL定位等工作的開展。因此，構建割手密雜交群體，鑒定出真實雜種可為開展甘蔗遺傳研究提供種質基礎。

傳統鑒定方法多是基于對甘蔗種質的形態特征描述，如根據莖形、芽形、曝光前后節間顏色、葉鞘、葉耳、蠟粉帶等性狀進行識別，為早期甘蔗種質的鑒定發揮了重要作用[7]。但傳統鑒定方法由于涉及的性狀眾多、受環境條件影響大，耗時耗力且鑒定結果不準確[8-9]。而分子標記因不受環境因素限制，更能客觀地反映DNA水平上的差異，已被廣泛應用于雜交后代的真實性鑒定和遺傳分析研究。其中，SSR（simple sequence repeat）標記因其具有共顯性遺傳、多態性豐富、分布廣泛、重復性好等優點，是目前用于甘蔗雜交后代真假雜種鑒定最有效的標記之一[10-12]。

本研究利用前期從云南本土收集的甘蔗種質資源，以2個地方種作母本，3個割手密作父本進行雜交，創制了3個F1群體，共計359份雜交后代。以此359份F1個體及其親本為研究材料，利用多態性SSR標記，并結合熒光毛細管電泳（fluorescence-capillary electrophoresis，CE）檢測平臺鑒定真假雜種，為后續甘蔗遺傳圖譜構建、重要性狀QTL定位等提供作圖群體材料，同時探討地方種和割手密的種間遺傳相似性、親本的SSR位點遺傳特性，為甘蔗開展分子標記輔助育種、選育超親遺傳種質奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

參試材料共364份，包括3個割手密F1群體后代及其親本。組合A：‘歪娥’ב云南82-114’，F1代有49個，組合B：‘南澗果蔗’ב云南2015-2’，F1代有121個，組合C：‘南澗果蔗’ב云南06-7-3’，共189個F1。其中，‘歪娥’和‘南澗果蔗’是地方種（‘南澗果蔗’也屬于甘蔗屬熱帶種資源），‘云南82-114’‘云南2015-2’和‘云南06-7-3’是前期采集的野生割手密。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA提取和質量檢測 取200 mg幼嫩葉片，采用天根植物基因組DNA提取試劑盒（DP320-02）提取甘蔗基因組DNA，具體操作步驟參考試劑盒說明書。提取完成后，取2 μL用Thermo微量紫外分光光度計NanoDrop（型號ND1000）檢測DNA濃度及質量。取4 μL在1%濃度的瓊脂糖凝膠上進行電泳，檢測DNA完整性，主帶清晰且不大量拖尾的DNA用于后續SSR分型。

1.2.2 SSR分型 根據PAN[13]建立的甘蔗分子身份證數據庫構建的方法，從中篩選出在父母本間具有特征性條帶的引物6對，用于本研究雜交后代群體的真實性鑒定（表1）。PCR反應體系總體積為15 μL，其中，DNA模板1 μL，10×PCR buffer 1.5 μL，25 mmol/L MgCl21.5 μL，10 mmol/L的dNTPs 0.3 μL，正反向引物各0.15 μL（濃度10 μmol/L），DNA聚合酶（5 U/μL）0.3 μL，ddH2O 10.1 μL。PCR擴增程序設置為：94℃預變性3 min；94℃變性15 s，55℃退火15 s，72℃延伸30 s，這3個階段循環35次；最后72℃延伸5 min，4℃保存。PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳，根據電泳結果估計PCR產物濃度，并將產物稀釋10倍后，與ROX 500內標（片段大小分別為50、75、100、139、150、160、200、300、350、400、450、490、500 bp）混勻，置于ABI3730XL基因測序儀樣本架上進行毛細管電泳檢測，完成后導出SSR基因分型文件。

表1 本研究所用SSR引物信息

1.2.3 位點統計和雜交后代真實性鑒定 利用GeneMarker 2.7（Soft Genetics LLC，State College，Pennsylvania，USA）軟件對毛細管電泳輸出圖譜進行擴增片段統計。首先設定每個SSR標記的等位基因panel，系統將根據所設定的panel進行條帶統計，某一位點上有條帶記為“1”，無條帶記為“0”，最后進行人工校對，剔除影子峰和不規則峰。利用NTSYSpc 2.10計算遺傳相似性系數。

雜交后代真實性判斷方法：根據桃聯安等[14]、陸鑫等[15]的方法進行真假雜種鑒定。即雜交后代擴增條帶均來自父本和母本，且具有父本特征帶的為真雜種；后代擴增條帶來自母本和父母本共有帶，而無父本特征帶的為自交種，需根據其他引物進一步判斷；后代出現新條帶，即父母本都沒有的條帶，為假雜種。

2 結果與分析

2.1 SSR標記對3個組合親本的鑒定效率

標記的選擇是雜交后代鑒定的重要環節。從圖1可看出，本研究所選用的6個SSR標記在親本上具有多個特征性條帶，可有效鑒別每一個親本材料。2個母本材料中，標記SMC334BS擴增出2個‘南澗果蔗’特征帶（位點17、位點18），SMC336BS擴增出3個‘歪娥’特征帶（位點9、位點10和位點11）和2個‘南澗果蔗’特征帶（位點4和位點12），mSSCIR74擴增出1個‘歪娥’特征帶，mSSCIR3擴增出1個‘歪娥’特征帶和3個‘南澗果蔗’特征帶，mSSCIR43擴增出3個‘南澗果蔗’特征帶，SMC31CUQ擴增出6個‘歪娥’特征帶和1個‘南澗果蔗’特征帶。每個標記都能較好地鑒定母本‘歪娥’和‘南澗果蔗’。

3個割手密在6對SSR引物上也擴增出了各自的特征帶。如‘云南82-114’在SMC334BS、SMC336BS、mSSCIR74、mSSCIR3、mSSCIR43、SMC31CUQ上分別具有特征帶6個、1個、3個、2個、2個、3個，可區別于‘云南2015-2’和‘云南06-7-3’的特征帶。‘云南2015-2’在標記SMC334BS和SMC31CUQ上具有1個可區別于‘云南82-114’和‘云南06-7-3’的特征帶。‘云南06-7-3’在標記SMC336BS、mSSCIR3、SMC31CUQ上分別有特征帶2個、4個和2個，可區別于‘云南82-114’和‘云南2015-2’的特征帶。此外，從圖1可看出，2個母本和3個父本間遺傳差異較大，特征帶較多，同時也表明本研究所選用的SSR引物可有效鑒定甘蔗地方種和割手密雜交后代的真實性。

黑色框表示該位點有條帶；白色框表示該位點無條帶。

2.2 雜交后代F1群體真假雜種鑒定

2.2.1 ‘歪娥’與云南82-114雜交后代鑒定結果 由圖2可知，6對引物均能擴增出組合A（‘歪娥’ב云南82-114’）父本‘云南82-114’（編號P2）特征帶。引物mSSCIR3在176、179、180、182 bp 處擴增出條帶，其中176 bp和179 bp為父本（編號P2）與母本（編號P1）共有，180 bp和182 bp為父本特有，無母本‘歪娥’特征帶。而其余5對引物均具有1個或多個雙親特征帶，如SMC334BS共擴增出14個條帶，其中4個為母本特有，10個為父本特有；mSSCIR74共擴增出8個條帶，其中3個為母本特有，3個為父本特有，2個為父母本共有。根據雜交后代血緣真實性判斷方法和6對SSR引物的擴增結果，組合A的49個F1中，37個為真雜種，12個為假雜種，無自交種，真雜種率為75.51%。

2.2.2 ‘南澗果蔗’與‘云南2015-2’雜交后代鑒定結果 由表2可知，6對SSR引物均能擴增出組合B雙親的特征帶。其中，SMC334BS在雙親上共擴增出10個條帶，包括5個母本特異帶（160、161、162、163、164 bp），4個父本特異帶（145、146、149、150 bp），1個父本和母本共有帶（159 bp）。SMC336BS在雙親上共擴增出6個條帶，3個母本特異帶，3個父本特異帶；mSSCIR74 擴增出5個條帶，3個母本特異帶，1個父本特異帶，1個父母本共有帶（219 bp）；mSSCIR3擴增出3個條帶，1個母本特異帶，1個父本特異帶，1個父母本共有帶；mSSCIR43擴增出9個條帶，5個母本特異帶，4個父本特異帶；SMC31CUQ擴增出4個條帶，1個母本特征帶，3個父本特征帶。根據雜種鑒定標準和6對SSR引物對組合B后代群體的擴增結果，121個F1中，82個為真雜種，39個為假雜種，無自交種，真雜種率為67.77%。

2.2.3 ‘南澗果蔗’與云南06-7-3雜交后代鑒定結果 組合C的母本為‘南澗果蔗’，父本為割手密‘云南06-7-3’，擴增結果表明，父本和母本的擴增條帶差異較大（表2），可有效鑒定其雜交后代血緣的真實性。根據6對SSR引物擴增結果和雜交后代真實性鑒定方法，組合C的189個F1中，143個為真雜種，46個為假雜種，無自交種，真雜種率為75.66%。

P1為母本‘歪娥’，P2為父本‘云南82-114’。

表2 3個組合親本的擴增條帶統計情況

2.3 母本和父本遺傳相似性分析

由表3可知，2個母本地方種間遺傳相似性系數為0.70，3個父本割手密間遺傳相似性系數為0.53～0.70，其中‘云南2015-2’和‘云南06-7-3’遺傳相似性系數最大為0.70，‘云南82-114’和‘云南06-7-3’間遺傳相似性系數最小，為0.53，‘云南82-114’和‘云南2015-2’間遺傳相似性系數為0.60。地方種和割手密種間遺傳相似性系數范圍為0.38～0.53，小于種內的遺傳相似性系數。表明本研究所選用的6個SSR標記對甘蔗地方種和割手密種的分辨率較高，可高效鑒定其雜交后代的血緣真實性。

表3 5個親本材料的遺傳相似性系數

2.4 親本的SSR位點遺傳分析

由表4可知，6對SSR 引物在組合A的37個真雜種中共擴增出52個條帶，其中18個為母本特有，29個為父本特有，其余為父母本共有帶。母本特異性條帶遺傳率為68.47%，父本特異性條帶遺傳率為58.90%。組合B有真雜種82個，共擴增出37個條帶，其中18個為母本特異性條帶，16個為父本特異性條帶，其余為父母本共有帶；母本特異性條帶遺傳率為80.96%，父本特異性條帶遺傳率為76.60%。6對SSR引物在組合C的真實后代群體中擴增出46個條帶，20個為母本特異性條帶，23個為父本特異性條帶，其余為父母本共有帶；雙親的特異性條帶中，母本條帶遺傳率為73.39%，父本條帶遺傳率為61.45%。3個組合的雜交后代中，母本條帶遺傳率均高于父本條帶的遺傳率，具有偏母本遺傳傾向。

表4 6個SSR標記的親本特異性條帶數目及遺傳率

3 討論

雜交是作物產生遺傳變異的重要途徑，是新品種選育、群體構建和重要性狀QTL定位的前提和基礎[16]。在甘蔗雜交過程中，由于人工操作不規范、母本未進行溫湯殺雄等導致的未知來源花粉混入和母本自交結實易造成后代的混雜。對雜交后代進行早期篩選，淘汰假雜種是種質創新工作中的重要環節。由于甘蔗是高度復雜的多倍體和非整倍體作物（2n=8x or 10x=100–130）[17-18]，雜交后代遺傳基礎復雜，性狀分離廣泛，從形態學上很難辨別雜種的真實性。SSR為共顯性標記，可區分純合和雜合，且重復性好、易操作，已被廣泛應用于雜種的真實性鑒定[19-20]。

在雜種鑒定中，SSR引物的選擇至關重要，不同的引物鑒定效率不同，理論上純合顯性標記只需一個即可鑒定出全部的雜種后代，而雜合的顯性標記至少要用5個父本特異標記才能鑒定出97%的真雜種[21-22]。如本研究中6對引物對組合A父母本的擴增結果所示，mSSCIR3擴增出2個父本特異帶而無母本特異帶，mSSCIR43擴增出1個母本特異帶和4個父本特異帶，相比其他4對在父母本上均擴增出多個特異帶的引物而言，鑒定效率較低。綜合6對SSR引物的擴增結果，3個F1群體的真雜種率分別為75.51%、67.77%、75.66%，平均真雜種率為72.98%，與陸鑫等[15]、郭育強等[23]和高軼靜等[24]報道的真雜種率為100%相差較大，這主要是由所選用的引物多態性及其數量造成的。周寧寧等[25]研究認為引物的多態性越高，后代擴增出現新條帶的幾率就越大。本研究選用的6個SSR標記，多態性較高，擴增出了多條父母本特征帶。因此，在后代擴增出父母本沒有的條帶即視為假雜種的情況下，假雜種出現的概率就會提高。然而，吳學蔚等[26]、韓國輝等[22]研究認為，雜交后代擴增出現新條帶，能否作為判斷雜種的依據，需要根據這些新條帶的確切來源判斷，并推測新條帶的出現可能是由于配子在形成過程中染色體的不等價交換產生。但是，基于甘蔗基因組的復雜程度和雜交后代染色體遺傳方式的多樣化，目前的技術還很難追蹤新條帶的確切來源。因此，在甘蔗雜種后代鑒定中，真假雜種的判斷和新條帶出現的原因還需開展更加深入的研究，這對了解甘蔗雜交后代的遺傳具有重要意義。

種質資源是作物遺傳育種的基礎，開發利用優異的種質資源是進行種質創新、選育突破性品種的關鍵。同時，親本間遺傳基礎的差異與后代群體的遺傳變異水平及后期能否獲得優良株系密切相關。本研究遺傳相似性分析結果表明，3個組合父本和母本的遺傳相似性分別為0.38、0.42和0.53，雙親間遺傳差異較大，雜交后代更有利于獲得廣泛的分離和變異。選用的3個父本割手密間遺傳相似性分別為0.53、0.60和0.70，也具有一定的多樣性和遺傳差異。據前人研究報道，甘蔗和割手密雜交，其染色體遺傳有2n+n和n+n 兩種方式[27]，親本間較大的遺傳差異和雜交后代染色體遺傳方式的多樣性進一步增加了后代的遺傳變異水平，提高獲得優良育種中間材料和優異株系的可能性，提高育種效應。此外，本研究的SSR位點遺傳分析表明，3個組合的后代群體中，其母本條帶的遺傳率均高于父本條帶的遺傳率，后代具有偏母本遺傳傾向。因此，在今后開展高產高糖新品種選育時，應注重選擇具有高產高糖的材料為母本，以提高雜交后代高產高糖性狀出現的頻率。

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Identification and Genetic Analysis of F1Hybrids from WildL. of Sugarcane Using SSR Markers

TIAN Chunyan1, BIAN Xin1, DONG Lihua1, WU Caiwen2, LANG Rongbin1, YU Huaxian1, ZHANG Yu1, TAO Lianan1, JING Yanfen1*

1. Ruili Breeding Station, Sugarcane Research Institute, Yunnan Academy of Agricultural Sciences, Ruili, Yunnan 678600, China; 2. Sugarcane Research Institute, Yunnan Academy of Agricultural Sciences / Yunnan Key Laboratory of Sugarcane Genetic Improvement, Kaiyuan, Yunnan 661699, China

is the most widely used and the most successful wild species in sugarcane breeding due to its good ratoon ability, strong stress resistance and wide adaptability. It has a great significance for sugarcane cultivars improvement by further exploring and using excellent stress resistance genes resources of widein modern sugarcane breeding programs. To obtain more true hybrids of, three segregation populations of three hundred and fifty-nine F1hybridswere developed from the inter-specific hybridization between two landrace (female) clones and three(male) genotypes in this study. Six SSR primer pairs with polymorphism and clear amplification fragments within parents were selected from twenty-one SSR primer pairs and the high-throughput fluorescence-capillary electrophoresis detection platform were used for SSR genotyping. Subsequently, hybrid identification, SSR fingerprints analysis of five parents, genetic similarity analysis within each two parents, and genetic analysis of parental-specific fragments were performed. The results showed that 6 SSR markers screened out in this study had high resolution and good amplification polymorphism within 5 parents. The map of five parents indicated that each parent had a unique SSR fingerprint, which could effectively identify the blood authenticity of their hybrid offspring. 262 of 359 progenies from three crosses were identified to be true hybrids, and the percentage of true hybrids were 67.77%, 75.51% and 75.66%, respectively, with a mean of 72.98%. Pairwise genetic similarity analysis showed that the coefficients of genetic similarity (SC) between two landraces was 0.70. The SC value of each twogenotypes were 0.53, 0.60 and 0.70, respectively. Whereas, the SC value between landrace andgenotypes ranged from 0.38 to 0.53, suggesting a smaller SC value was existed in inter-species than intra-species. Genetic analysis of SSR fragments revealed that heritability of female specific fragments from three crosses were 68.47%, 80.96% and 73.39%, respectively, with an average of 74.27%. While the heritability of male specific fragments was 58.90%, 76.60% and 61.45%, respectively, with a mean of 65.65%. Collectively, F1generations from inter-specific hybridization between landrace andgenotypes had the genetic tendency to female parent. Therefore, the clones with good comprehensive traits should be used as female preferentially in sugarcane crossing program. The results could provide effective and reliable SSR markers for hybrid identification ofprogenySimultaneously, the true hybrid populations identified of this study could offer good germplasm resources for genetic research of good agronomic traits and provide scientific basis for superparental clones selection.

sugarcane;n; SSR; hybrid identification; genetic

S566.1

A

10.3969/j.issn.1000-2561.2022.10.007

2021-10-27；

2022-03-15

國家自然科學基金項目（No. 31860406）；國家重點研發計劃項目子課題（No. 2018YFD1000503）；云南省基礎研究面上項目（No. 2019FB053）。

田春艷（1989—），女，碩士，助理研究員，研究方向：甘蔗分子育種。*通信作者（Corresponding author）：經艷芬（JING Yanfen)，E-mail：jyf@yaas.org.cn。