膠體金免疫層析試紙條同時檢測生乳中吡蟲啉、吡唑醚菌酯、氟蟲腈殘留的研究

陳發(fā)榮，金洪偉，韓琰旭，吳月皓，齊 瑜

1 北京艾旗斯德科技有限公司，北京101102

2 深圳市光明區(qū)疾病預(yù)防控制中心，廣東深圳 518106

0 引言

農(nóng)藥是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中重要的因素，牧場草或植物飼料生長過程中有可能使用過農(nóng)藥，但如果控制不好，奶牛通過攝取牧場草或植物飼料生長發(fā)育，部分農(nóng)藥可能會被奶牛攝入，通過牛體代謝進(jìn)入牛乳，從而進(jìn)入人體代謝，危害人體健康。農(nóng)藥殘留是影響乳制品安全的因素之一。國內(nèi)外毒理學(xué)專家通過大量試驗證明，生乳中殘留的農(nóng)藥進(jìn)入人體后，對人體健康的危害，為長時期、微劑量、慢性細(xì)微毒性效應(yīng)。會在人體生理、生化或自身免疫功能等方面表現(xiàn)出來，致畸、致癌、致突變[1]。因此，控制生乳中農(nóng)藥殘留，嚴(yán)禁具有農(nóng)藥殘留風(fēng)險的生乳進(jìn)入市場，確保乳品安全，受到日益關(guān)注。

《GB2763—2021 食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中農(nóng)藥最大殘留限量》中對生乳中的農(nóng)藥殘留做出明確限量規(guī)定，具體數(shù)據(jù)見表1。目前檢測農(nóng)藥殘留的方法大致有氣相色譜[2～4]、液相色譜[5，6]、氣相色譜-質(zhì)譜法[7，8]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[9～11]和酶聯(lián)免疫吸附法[12]等。但是這些方法均需要進(jìn)入實驗室操作，且操作時間過長，但生乳是新鮮易腐的農(nóng)產(chǎn)品，如果等實驗室的檢測數(shù)據(jù)出來后再判斷是否合格，為時已晚，因此收奶員需要用最短的時間判斷其是否合格，所以開發(fā)快速檢測生乳中農(nóng)藥殘留的方法在基層使用很有必要；另外由于農(nóng)藥的種類較多，多種農(nóng)藥殘留的風(fēng)險也較大，所以需要開發(fā)盡可能多合一的檢測方法，以方便快速、全面的排查生乳的農(nóng)藥殘留風(fēng)險。

表1 GB2763—2021中對生乳中農(nóng)藥殘留的明確限量規(guī)定（部分）

膠體金免疫層析方法在果蔬中的農(nóng)藥殘留檢測應(yīng)用很廣泛[13～16]，但其在生乳中的農(nóng)藥殘留檢測鮮少報道。本文利用膠體金免疫層析法開發(fā)了多合一的檢測試紙條，實現(xiàn)了同時、快速測定生乳中吡蟲啉、吡唑醚菌酯、氟蟲腈的殘留。

1 材料與方法

1.1 儀器設(shè)備和材料

1.1.1 儀器

Lab-1A-50E冷凍干燥機(jī)，北京博醫(yī)康技術(shù)有限責(zé)任公司；HM3030-XYZ三維噴金劃膜一體機(jī)，上海金標(biāo)生物技術(shù)有限公司；Electron冷凍離心機(jī)，Thermo公司；SHZ-82氣浴恒溫振蕩器，金壇市榮華儀器制造有限公司；WH-3漩渦混勻儀，上海滬西分析儀器廠有限公司；SHZ-82氣浴恒溫振蕩器，榮華儀器設(shè)備有限公司；DU640紫外光譜掃描儀，BECKMAN公司。

1.1.2 試劑

氯金酸（AuCl3·HCl·4H2O）、牛血清白蛋白（BSA）、卵清蛋白（OVA），美國sigma公司分裝；檸檬酸三鈉，上海試劑一廠；聚乙二醇PEG 20000，羊抗鼠IgG（二抗），上海生工生物工程有限公司；吐溫（Tween-20），上海精析化工科技有限公司；蔗糖，廣東汕頭西隴化工試劑廠；海藻糖，上海KAYON公司；PVP底板、結(jié)合墊、樣品墊、吸水紙，上海金標(biāo)生物科技有限公司；硝酸纖維（NC）膜，美國Millipore公司；吡蟲啉、吡唑醚菌酯、氟蟲腈3 種單克隆抗體，北京艾旗斯德科技有限公司實驗室自制；吡蟲啉、吡唑醚菌酯、氟蟲腈、噠螨靈、咪鮮胺、嘧霉胺、嘧菌環(huán)胺、克百威、毒死蜱、阿苯達(dá)唑、烯酰嗎啉、百菌清、腐霉利（純度均大于99%），中國藥品生物制品檢定所提供；生乳樣品，中國藥品生物制品檢定所提供。

1.2 膠體金試紙條制備[17，18]

煮金：采用檸檬酸三鈉還原法制備膠體金溶液，往蒸餾燒瓶中加入100 mL雙蒸水，再加入1%氯金酸溶液1 mL，電熱套加熱至沸騰；迅速加入還原劑（1%檸檬酸三鈉溶液）1.7 mL，開始攪拌，待溶液呈酒紅色加熱穩(wěn)定5 min，冷卻至室溫備用。

標(biāo)記抗體：加入5 μL0.02 mol/L 碳酸鉀（K2CO3）溶液調(diào)節(jié)pH至最佳，加入5 μL 1.0 mg/mL 抗吡蟲啉單克隆抗體，震蕩混勻，避光2 h，離心7 500 r/min、35 min，棄上清，加入重懸液，得金標(biāo)抗體噴涂液，待用；吡唑醚菌酯、氟蟲腈單克隆抗體標(biāo)記同法。

混合抗體標(biāo)記物制備：將三種金標(biāo)抗體噴涂液按1∶1∶1比例混合，制備出混合抗體標(biāo)記物，待用。

金標(biāo)結(jié)合墊的制備：將混合抗體標(biāo)記物均勻噴涂于結(jié)合墊上，噴涂量為：10 μL/cm2。

檢測線和質(zhì)控線制備：0.02 mol/L 磷酸緩沖液（PBS，pH 7.4）將羊抗兔抗體稀釋至1.0 mg/mL，劃線于硝酸纖維素膜（NC膜）上，作為質(zhì)控線（C線），用0.02 mol/L 磷酸緩沖液（PBS，pH 7.4）分別稀釋吡蟲啉、吡唑醚菌酯、氟蟲腈三種全抗原至1.0 mg/mL，形成T1線為氟蟲腈結(jié)果顯示線；T2為吡唑醚菌酯結(jié)果顯示線；T3為吡蟲啉結(jié)果顯示線，三條檢測線，37 ℃烘2 h，待用。

組裝試紙條：將樣品墊、金標(biāo)墊（已噴涂抗體）和吸水紙依次組裝到附有NC膜的支持底板上，然后用切條機(jī)切割成寬度為3.5 mm的試紙條。

1.3 膠體金試紙條性能測試

1.3.1 檢測下限測試

首先用PBS稀釋標(biāo)準(zhǔn)品以確定初始試紙條檢測濃度，濃度見表2。

表2 檢測下限測試濃度梯度對照表

各取100 μL標(biāo)樣分別置于微孔杯里，室溫孵育5 min，將全部反應(yīng)液點(diǎn)樣于試紙條樣品墊上，5 min觀察反應(yīng)情況，每份樣品2 個平行。

1.3.2 加標(biāo)回收測試

取經(jīng)確定為陰性的生乳加標(biāo)，濃度見表3。

表3 加標(biāo)回收測試濃度梯度對照表

各取100 μL生乳分別置于微孔杯里，室溫孵育5 min，將全部反應(yīng)液點(diǎn)樣于試紙條樣品墊上，5 min觀察反應(yīng)情況，每份樣品2 個平行。

1.3.3 與定量檢測方法結(jié)果對比試驗

取25 批次生乳樣本，分別用高效液相色譜法測定吡蟲啉濃度[20]，用超高效液相色譜串聯(lián)-質(zhì)譜法檢測吡唑醚菌酯[21]，用氣相色譜-質(zhì)譜法檢測氟蟲腈[22，23]，同時用膠體金試紙條檢測50 批次生乳樣本。

1.3.4 穩(wěn)定性測試

將同一批次試紙條室溫置于45 ℃恒溫器中保存，每隔1 周檢查一次活性，每批重復(fù)8組，共計5 周，觀察線條的穩(wěn)定性和保質(zhì)期，考察其穩(wěn)定性。

1.3.5 交叉反應(yīng)測試

確定噠螨靈、咪鮮胺、嘧霉胺、嘧菌環(huán)胺、克百威、毒死蜱、阿苯達(dá)唑、百菌清、腐霉利、烯酰嗎啉共10 種農(nóng)藥開展交叉反應(yīng)測試[19]，濃度配制表4。

表4 穩(wěn)定性測試濃度梯度對照表

2 結(jié)果

2.1 試紙條制備結(jié)果

膠體金試紙條采用3 條檢測線，分別是吡蟲啉、吡唑醚菌酯、氟蟲腈，1 條質(zhì)控線組成。同時檢測3 種生乳中農(nóng)藥殘留[19，20]。

從圖1效果看出凍干粉均勻，圖2看出試紙條整齊，適合試驗，取100 μLPBS緩沖液置于微孔杯里，室溫孵育5 min，將全部反應(yīng)液點(diǎn)樣于試紙條樣品墊上，5 min反應(yīng)結(jié)果如圖3。

圖1 金標(biāo)抗體凍干粉效果

圖2 切割后試紙條狀態(tài)

圖3 試紙條顯色示意圖

2.2 膠體金試紙條性能測試結(jié)果

2.2.1 檢測下限測試結(jié)果

圖4中從左到右對照表1中濃度，結(jié)果發(fā)現(xiàn)當(dāng)表1濃度3 種農(nóng)藥的濃度為吡蟲啉0.05 mg/kg；吡唑醚菌酯0.025 mg/kg；氟蟲腈0.01 mg/kg時，即第7條試紙條顯示結(jié)果，3 條T線幾乎消失，剩下淺淺的印，明顯淺于C線，故初步檢測下限為：吡蟲啉0.05 mg/kg；吡唑醚菌酯0.025 mg/kg；氟蟲腈0.01 mg/kg，符合GB2763—2021對生乳中農(nóng)藥殘留做出明確限量規(guī)定。

圖4 檢測下限顯示結(jié)果圖

2.2.2 加標(biāo)回收測試結(jié)果

圖5對比表2，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，4號試紙條3條T線已經(jīng)明顯變淺，但是為了更加確定的陽性判斷，規(guī)定5號試紙條對應(yīng)的濃度為檢測下限，即吡蟲啉0.05 mg/kg；吡唑醚菌酯0.025 mg/kg；氟蟲腈0.01 mg/kg，與初始檢測檢測限試驗結(jié)果相符，由于膠體金免疫層析法本身是半定量分析，無法精確計算加標(biāo)回收率。

圖5 加標(biāo)回收測試結(jié)果圖

2.2.3 與國標(biāo)方法結(jié)果對比試驗結(jié)果

表4為膠體膠體金免疫層析試紙條同時檢測生乳中吡蟲啉、吡唑醚菌酯、氟蟲腈殘留與國標(biāo)方法結(jié)果對比試驗結(jié)果，通過結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過測試的25 個樣品，其中吡蟲啉項目超過檢測下限0.05 mg/kg的5 個樣品，膠體金試紙條均已經(jīng)檢出；吡唑醚菌酯項目超過檢測下限0.025 mg/kg的4 個樣品，膠體金試紙條均已經(jīng)檢出；氟蟲腈項目超過檢測下限0.01 mg/kg的3 個樣品，膠體金試紙條均已經(jīng)檢出；陰性樣品均對應(yīng)符合。定性判斷結(jié)果與國標(biāo)檢測方法符合率100%，符合對快速檢測方法的要求。

表4 結(jié)果對比表

2.2.4 穩(wěn)定性測試

連續(xù)檢測5周結(jié)果（圖6）：第1至第5周測試結(jié)果顯色沒有明顯變化，根據(jù)阿倫尼烏斯公式：25 ℃下保存1 年，相當(dāng)于37 ℃老化91 天，相當(dāng)于45 ℃老化37 天。目前試紙條45 ℃保存5周即相當(dāng)于25 ℃下保存1 年，滿足生產(chǎn)使用需要。

圖6 穩(wěn)定性測試圖（左起分別為第1至第5周）

2.3.5 交叉反應(yīng)測試

表5為相似結(jié)構(gòu)的常用農(nóng)藥交叉反應(yīng)結(jié)果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)噠螨靈、咪鮮胺、嘧霉胺、嘧菌環(huán)胺、克百威、毒死蜱、阿苯達(dá)唑、烯酰嗎啉、百菌清、腐霉利最高濃度均達(dá)到2.0 mg/kg時，10 種相似結(jié)構(gòu)的常用農(nóng)藥均無陽性反應(yīng)，說明這些農(nóng)藥對試紙條的陽性反應(yīng)沒有實質(zhì)性影響，無交叉反應(yīng)。由于膠體金試紙條本身為半定量的檢測手段，不能精確計算出交叉反應(yīng)率。

表5 交叉反應(yīng)測試結(jié)果對比表

3 討論與結(jié)論

目前，利用儀器檢測生乳中農(nóng)藥殘留的方法及文獻(xiàn)較多，但利用膠體金試紙條能夠同時檢測生鮮乳中3 種農(nóng)藥殘留的文獻(xiàn)較少。本研究通過膠體金免疫層析速測法檢測生乳中吡蟲啉、吡唑醚菌酯和氟蟲腈農(nóng)藥殘留，通過比對試驗，提高了試紙條的檢測下限，本研究發(fā)現(xiàn)，吡蟲啉微孔法比干條法檢測下限提升3 倍左右；吡唑醚菌酯啉微孔法比干條法檢測下限提升3 倍左右；氟蟲腈微孔法比干條法檢測下限提升5 倍左右；檢測下限具體為：吡蟲啉0.05 mg/kg；吡唑醚菌酯0.025 mg/kg；氟蟲腈0.01 mg/kg。每次檢測可在50 min內(nèi)完成一件樣品從前處理到測試卡顯色讀取的全部過程，并用高效液相色譜法、超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法、氣相色譜質(zhì)譜法進(jìn)行驗證，相比之下，與國標(biāo)檢測方法符合率100%，符合對快速檢測方法的要求；25 ℃下可保存1 年。

通過膠體金試紙條的反應(yīng)，在T線區(qū)域顯色，通過判斷相應(yīng)的T線來確定三種農(nóng)藥是否超標(biāo)，操作簡單，快速靈敏，穩(wěn)定準(zhǔn)確；按照《農(nóng)殘辦技術(shù)材料要求及審查程序》要求，本研究對試紙條特異性、準(zhǔn)確性、穩(wěn)定性等進(jìn)行了性能測試，均符合要求。可以用于現(xiàn)場的快速檢測，檢測檢測下限符合GB 2763—2021生乳中相應(yīng)農(nóng)殘的要求，可以作為前期農(nóng)殘檢測的快速篩查手段。但是由于農(nóng)藥的種類繁多，還需要持續(xù)的開發(fā)更多的試紙條檢測更多的農(nóng)藥殘留。