針灸對帕金森病小鼠黑質白細胞介素-17受體A/核因子κB信號通路的影響

高 崚 陳王璐 陳奕奕 張瀟文 王照欽, 劉慧榮,

(1 河南中醫(yī)藥大學，鄭州，450046；2 河南中醫(yī)藥大學針灸推拿學院，鄭州，450003；3 上海中醫(yī)藥大學附屬岳陽中西醫(yī)結合醫(yī)院，上海，200437；4 上海市針灸經(jīng)絡研究所，上海，200030)

帕金森病(Parkinson′s Disease，PD)是一種起病隱匿、病情呈進展性加重的神經(jīng)退行性疾病，其病理主要是黑質致密區(qū)多巴胺(Dopamine，DA)神經(jīng)元變性壞死伴胞質內嗜酸性包涵體-路易小體(Lewy Body，LB)的形成[1]。LB的主要成分是α-突觸核蛋白(α-synuclein，α-syn)。研究表明病理性α-syn具有神經(jīng)毒性，異常聚集于內質網(wǎng)會損傷其正常生理功能，引起內質網(wǎng)應激，導致多巴胺能神經(jīng)元進行性壞死，進而神經(jīng)元內多巴胺合成限速酶——酪氨酸羥化酶(Tyrosine Hydroxylase，TH)水平下降，引起各種臨床癥狀[2-6]。

本團隊前期研究發(fā)現(xiàn)，針灸可以改善PD患者臨床癥狀，并對1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶(1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine,MPTP)誘導的PD模型小鼠腸道菌群具有顯著的調節(jié)作用[7-8]。白細胞介素-17(Interleukin-17，IL-17)是促炎癥介質，研究表明，PD患者腦內生產(chǎn)IL-17的T淋巴細胞(Th17細胞)和IL-17在PD相關的神經(jīng)元死亡中有重要作用，IL-17受體及下游的核因子κB通路激活是神經(jīng)元死亡的主要原因，且IL-17受體在PD患者腦黑質致密部(Substantia Nigra Pars Compacta，SNpc)神經(jīng)元中上調可能是該通路具有較高活性的重要因素[9]。因此本研究采用行為學檢測方法、免疫組織化學法、蛋白質免疫印跡法，探討針灸對MPTP誘導的PD模型小鼠運動遲緩的作用，并探索其對PD小鼠黑質IL-17受體A/核因子κB信號通路中相關因子活性的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 健康無特定病原體(Specific Pathogen Free,SPF)級8周齡雄性C57BL/6小鼠50只，購自上海吉輝實驗動物飼養(yǎng)有限公司，許可證號：SCXK(滬)2017-0012。飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學附屬岳陽中西醫(yī)結合醫(yī)院實驗動物中心屏障環(huán)境內(倫理審批號：YYLAC-2019-060-2)。在室溫22～25 ℃，光周期為12 h光照及12 h黑暗條件下飼養(yǎng)，適應性喂養(yǎng)1周。實驗過程嚴格按照中華人民共和國科技部發(fā)布的《關于善待實驗動物的指導性意見》。

1.1.2 主要試劑與儀器 MPTP(Sigma公司，美國，批號：M0896)，甲磺酸雷沙吉蘭(Sigma公司，美國，批號：SML0124)，氯仿(上海蘇懿化學試劑有限公司，批號：151823)，異丙醇(國藥集團化學試劑有限公司，批號：A451-4)，無水乙醇(國藥集團化學試劑有限公司，批號：111727)，mRNA抽提Trizol(Invitrogen公司，批號：15596018)。疲勞轉棒儀(成都泰盟軟件有限公司，型號：ZB-200)，Gilson移液器(Gilson Inc.公司，法國，型號：F144055P)，高速冷凍離心機(Eppendorf公司，德國，型號：5424R)，超細電動勻漿機(Fluko公司，德國，型號：F6/10-6G)，WB Bio-Rad電泳儀(伯樂公司，型號：1658001)，WB電泳轉膜儀(大連競邁科技有限公司，型號：PS-9)，凝膠成像系統(tǒng)(伯樂公司，美國，型號：ChemiDoc XRS+)，定時水平搖床(Crystal公司，美國，型號：OS-03U)。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 將實驗小鼠隨機分為空白組、模型組、針刺組、針刺艾灸組、雷沙吉蘭組，每組10只。每天稱重小鼠體質量并記錄，于同一時間以MPTP腹腔注射給藥進行造模，腹腔注射的部位選擇在腹膜區(qū)略向上，以避免略向右上穿刺小腸和膀胱，將35.1 mg MPTP·HCl溶解于10 mL 0.9%氯化鈉溶液中，以10 μL/(g·d)的劑量，空白組注射等劑量的0.9%氯化鈉溶液，1次/d，連續(xù)注射5 d。

1.2.2 給藥方法 1)針刺組：模型制備成功后，次日起每日將小鼠固定在特制鼠架上，采用0.25 mm×13 mm規(guī)格一次性無菌針灸針(蘇州華佗)，取百會、陽陵泉進行針刺，捻轉15 s后每間隔5 min捻轉15 s，共留針15 min，干預1次/d，共干預14 d。穴位定位參照《針灸實驗學》和《實驗動物針灸手冊》中“常用實驗動物針灸穴位”的規(guī)定，并結合動物比較學方法，根據(jù)比較解剖學進行取穴[10]。

2)針刺艾灸組：模型制備成功后，固定及針刺選穴、干預方法同針刺組，針刺干預結束后將小鼠腹部皮毛剃凈，以0.5 cm×12 cm規(guī)格特制細艾條溫和灸關元穴，使穴位局部皮膚溫度達到45 ℃左右，持續(xù)15 min，干預1次/d，共干預14 d。3)雷沙吉蘭組：模型制備成功后，次日起每日以甲磺酸雷沙吉蘭0.2 mg/kg的劑量進行灌胃，并記錄體質量，1次/d，共灌胃14 d。空白組、模型組與針刺組、針刺艾灸組、雷沙吉蘭組進行相同的抓取和固定，不做其他干預。

1.2.3 檢測指標與方法 疲勞轉棒實驗評分：采用疲勞轉棒儀進行評估[11]。將小鼠放置于直徑約3 cm的轉棒上(小鼠的頭朝向轉棒儀內，于兩側擋板之間)。5 min內，旋轉速度從10 r/min逐漸增加至30 r/min，在MPTP注射前訓練3 d，使之能夠在20 r/min的轉棒上維持120 s，在干預結束后當天，轉棒測試10、15、20、25、30 r/min下保持時間，并采用梯形法計算總體轉棒評分(Overall Rotarod Performance，ORP)。

熒光染色技術檢測黑質區(qū)TH、α-syn的表達：4%多聚甲醛固定、切片，室溫封閉60 min后，分別滴加濃度為1∶1 000的TH和α-syn一抗，于4 ℃濕盒中孵育過夜(15 h)，滴加二抗，室溫孵育1～2 h，滴加新鮮配制的DAB顯色液，于顯微鏡下觀察，陽性表達為棕黃色或棕褐色。蛋白質免疫印跡法檢測黑質致密部IL-17受體A、核因子κB、p-核因子κB抑制劑(Inhibitor of Kappa B Alph,IκBα)、IκBα、p-轉化生長因子活化激酶1(Transforming Growth Factor-activated Kinase 1,p-TAK1)、TAK1、激活蛋白1(Activator 1,Act1)表達：黑質組織剪碎加裂解液勻漿離心提取總蛋白(離心半徑10 cm)，SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳至溴酚藍剛跑出，電轉移至聚偏二氟乙烯(Polyvinylidenefluoride，PVDF)膜上，加抗體孵育并顯色，用Scion Image圖像分析系統(tǒng)對蛋白條帶進行分析，蛋白質的相對含量以目的蛋白與β-actin條帶光密度的比值表示。

2 結果

2.1 疲勞轉棒儀評分 雷沙吉蘭組小鼠ORP與模型組比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；針刺艾灸組小鼠及針刺組小鼠ORP均高于模型組，2組比較差異均有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)；雷沙吉蘭組與針刺組、針刺艾灸組比較，差異均有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)；針刺艾灸組與針刺組比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 各組小鼠ORP比較分，n=8)

2.2 熒光染色技術檢測黑質區(qū)酪氨酸羥化酶的表達 空白組與其他組比較，TH表達更強，數(shù)量多且密度大，分布范圍廣，呈明亮的熒光綠色；模型組與空白組比較，TH數(shù)量明顯減少，分布范圍縮小，免疫熒光染色表達弱，TH成暗淡的熒光綠色；針刺組、針刺艾灸組、雷沙吉蘭組與模型組比較，TH免疫熒光染色表達增強，數(shù)量有所增加，分布范圍擴大；針刺組、針刺艾灸組與雷沙吉蘭組比較，TH免疫熒光染色表達增強，數(shù)量較多，熒光綠色信號較強；針刺艾灸組與針刺組比較，TH免疫熒光染色表達增強，數(shù)量較多，分布較廣，熒光綠色更明亮，更加接近空白組。與空白組比較，模型組小鼠TH黑質表達量明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與模型組比較，針刺組、針刺艾灸組與雷沙吉蘭組的表達量均增加，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；其中針刺艾灸組增加最明顯。見圖1、表2。

表2 各組小鼠黑質區(qū)TH表達量比較

圖1 各組小鼠黑質區(qū)TH蛋白表達(免疫熒光染色,×400)

2.3 熒光染色技術檢測α-syn的表達 模型組與其他組比較，α-syn免疫熒光染色表達更強，數(shù)目多，分布范圍廣，呈明亮的熒光綠色；空白組與模型組比較α-syn數(shù)量明顯減少，分布范圍減小，免疫熒光染色表達呈暗淡的熒光綠色；針刺組、針刺艾灸組、雷沙吉蘭組與模型組比較，α-syn免疫熒光染色表達減弱，細胞數(shù)量有所減少，分布范圍變小；針刺組、針刺艾灸組與雷沙吉蘭組比較，α-syn免疫熒光染色表達減弱，細胞較少，熒光綠色信號較強；針刺艾灸組與針刺組比較，α-syn免疫熒光染色表達減弱，細胞較少，分布較少，熒光綠色更暗，更加接近空白組。與空白組比較，模型組小鼠黑質α-syn免疫熒光強度明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與模型組比較，雷沙吉蘭組小鼠黑質α-syn熒光強度降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與模型組比較，針刺組與針刺艾灸組α-syn免疫熒光強度明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖2、表3。

表3 各組小鼠黑質區(qū)α-syn表達比較

圖2 各組小鼠黑質區(qū)α-syn蛋白表達(免疫熒光染色，×400)

2.4 各組小鼠黑質致密部IL-17受體A蛋白相對表達量 與空白組比較，模型組IL-17受體A蛋白表達上升，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；與模型組比較，針刺艾灸組IL-17受體A蛋白表達降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與模型組比較，雷沙吉蘭組、針刺組IL-17受體A蛋白表達降低，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見圖3、表4。

表4 各組小鼠黑質致密部IL-17受體A蛋白相對表達量比較

圖3 各組小鼠黑質致密部IL-17RA蛋白表達電泳圖

2.5 各組小鼠黑質致密部Act1相對表達量 與空白組比較，模型組小鼠黑質致密部Act1表達下降，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；與模型組比較，雷沙吉蘭組、針刺組、針刺艾灸組小鼠黑質致密部Act1表達差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見圖4、表5。

圖4 各組小鼠黑質致密部Act1蛋白表達電泳圖

表5 各組小鼠黑質致密部Act1相對表達量比較

2.6 各組小鼠黑質致密部p-TAK1蛋白相對表達量 與空白組比較，模型組小鼠黑質致密部p-TAK1蛋白表達差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；與模型組比較，雷沙吉蘭組、針刺組、針刺艾灸組小鼠黑質致密部p-TAK1蛋白表達差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見圖5、表6。

圖5 各組小鼠黑質致密部p-TAK1蛋白表達電泳圖

表6 各組小鼠黑質致密部p-TAK1蛋白相對表達量比較

2.7 各組小鼠黑質致密部TAK1蛋白相對表達量 與空白組比較，模型組小鼠黑質致密部TAK1蛋白表達有升高趨勢，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；與模型組比較，雷沙吉蘭組、針刺組、針刺艾灸組小鼠黑質致密部TAK1蛋白表達差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見圖6、表7。

圖6 各組小鼠黑質致密部TAK1蛋白表達電泳圖

表7 各組小鼠黑質致密部TAK1蛋白相對表達量比較

2.8 各組小鼠黑質致密部p-TAK1/TAK1蛋白相對表達量比率 與空白組比較，模型組小鼠黑質致密部p-TAK1/TAK1蛋白相對表達量比率差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；與模型組比較，雷沙吉蘭組、針刺組、針刺艾灸組小鼠黑質致密部p-TAK1/TAK1蛋白相對表達量比率差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表8。

表8 各組小鼠黑質致密部p-TAK1/TAK1蛋白相對表達量比率比較

2.9 各組小鼠黑質致密部p-IκBα比較 與空白組比較，模型組小鼠黑質致密部p-IκBα表達明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與模型組比較，雷沙吉蘭組、針刺組、針刺艾灸組小鼠黑質致密部p-IκBα表達均降低，差異均有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)。見圖7、表9。

圖7 各組小鼠黑質致密部p-IκBα蛋白表達電泳圖

表9 各組小鼠黑質致密部p-IκBα比較

2.10 各組小鼠黑質致密部IκBα相對表達量 與空白組比較，模型組小鼠黑質致密部IκBα表達下降，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；與模型組比較，雷沙吉蘭組、針刺組、針刺艾灸組小鼠黑質致密部IκBα表達差異均無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)。見圖8、表10。

圖8 各組小鼠黑質致密部IκBα蛋白表達電泳圖

表10 各組小鼠黑質致密部IκBα相對表達量比較

2.11 各組小鼠黑質致密部p-IκBα/IκBα比較 與空白組比較，模型組小鼠黑質致密部p-IκBα/IκBα升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與模型組比較，雷沙吉蘭組、針刺組、針刺艾灸組小鼠黑質致密部p-IκBα/IκBα率降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表11。

表11 各組小鼠小鼠黑質致密部p-IκBα/IκBα比較

2.12 各組小鼠核因子κB相對表達量 與空白組比較，模型組小鼠黑質致密部核因子κB蛋白表達明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與模型組比較，雷沙吉蘭組、針刺組、針刺艾灸組小鼠黑質致密部核因子κB蛋白表達均降低，差異均有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)。見圖9、表12。

圖9 各組小鼠黑質致密部核因子κB蛋白表達電泳圖

表12 各組小鼠黑質致密部核因子κB蛋白相對表達量比較

3 討論

帕金森病(PD)屬“顫證”“震顫”“顫振”“掉”等范疇，癥可見頭身肢體不自主地搖動、顫抖為主要臨床表現(xiàn)的一種病證[12-13]。為本虛標實之病，病位在筋脈，與肝、脾、腎等臟關系密切[14-16]。如《素問長刺節(jié)論》曰：“病在筋，筋攣節(jié)痛，不可以行，名曰筋痹。”本課題組認為該病的病因病機屬于陰陽失衡，督脈失職，筋脈失養(yǎng)所致。《靈樞·邪氣藏府病形篇》曰：“筋急，陽陵泉主之。”陽陵泉為“筋會”，有舒筋緩急的作用，為筋氣聚會之外，故陽陵泉是治療筋病的要穴，特別是下肢筋病，臨床較為常用，具有舒筋和壯筋的作用[17]。百會穴與腦聯(lián)系密切，作為督脈的重要穴位，亦是“三陽五會”之穴，其位于巔頂，是調節(jié)大腦功能的要穴，其穴性屬陽，又于陽中寓陰，故能通達陰陽脈絡，連貫周身經(jīng)穴，對于調節(jié)機體的陰陽平衡起著重要的作用[18]。故本實驗選用百會聯(lián)合陽陵泉，通過強筋補髓，調和陰陽緩解PD小鼠癥狀。

核因子κB是一種多向性炎癥轉錄因子，在調控免疫細胞的激活、T淋巴細胞的發(fā)育、細胞凋亡、腫瘤形成、病毒復制、炎癥反應及多種自身免疫性疾病等方面發(fā)揮重要作用[19]。核因子κB轉錄、活化與炎癥反應有關的靶基因，其表達產(chǎn)物主要參與免疫應答和炎癥反應，最終導致細胞損害[20]。研究表明，IL-17RA/核因子κB通路激活是PD神經(jīng)元死亡的主要原因之一。在與PD患者的T淋巴細胞共培養(yǎng)或添加IL-17情況下，通過誘導多能干細胞(Induced Pluripotent Stem Cells，iPSC)衍生的PD中腦神經(jīng)元(Midbrain Neuron，MBN)上調IL-17受體信號轉導和其下游靶標，激活B細胞核因子κ輕鏈增強劑(核因子κB)而導致MBN死亡，添加IL-17、IL-17受體的阻斷劑或添加IL-17抗體蘇金單抗(Secukinumab)則可挽救此種死亡。另一方面，PD患者人誘導多能干細胞來源的MBN中IL-17受體表達顯著上升，可能是此類MBN對IL-17和PD來源的T淋巴細胞的特異性反應的基礎，“迎接”更多的IL-17而激活核因子κB通路[9]。本研究發(fā)現(xiàn)，MPTP誘導的PD模型小鼠核因子κB表達明顯升高，而TH表達顯著降低，證實了核因子κB的活化是促進多巴胺能神經(jīng)元死亡的重要機制。PD模型小鼠IL-17受體A蛋白表達表現(xiàn)出一定的上升，而針刺艾灸干預可以顯著抑制IL-17受體A表達，且雷沙吉蘭組、針刺組、針刺艾灸組與模型組比較，核因子κB表達均降低，提示調節(jié)IL-17/NF-κB通路可能是針灸保護黑質多巴胺能神經(jīng)元的一個關鍵環(huán)節(jié)。

核因子κB ACT1是IL-17受體A下游至核因子κB信號通路所必需的銜接蛋白，介導從IL-17受體A到核因子κB和其他轉錄因子信號通路的活化。而腫瘤壞死因子相關因子6是ACT1的關鍵底物，在核因子κB激酶抑制物(Inhibitor of Nuclear Factor Kappa-B Kinase,IKK)相關激酶與ACT1的相互作用下，參與到IL-17介導的ACT1的磷酸化過程，促使核因子KB的激活[21]。在本研究中，各組之間的ACT1表達差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，ACT1在模型組核因子κB激活環(huán)路中的角色尚不明確，另一方面，IKK相關激酶(TANK-結合激酶1和誘導核因子κB激酶抑制物)對ACT1的磷酸化修飾是IL-17通路負反饋調控的關鍵機制，ACT1的磷酸化水平有待進一步的研究探明。核因子κB在PD的發(fā)病過程中的激活，TAKl通過多種形式參與。模型組與空白組比較，p-TAK1、TAK1的表達以及p-TAK1/TAK1比值差異均無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)，提示TAK1及其磷酸化水平在PD中腦核因子κB相關通路中的角色尚不明確，有待進一步研究。

IκBα結合形成異源二聚體存在于細胞質中，在外界多種因素刺激下，IκBα可磷酸化并迅速降解使核因子κB得以釋放，與靶基因啟動因子結合介導多種炎癥介質包括誘生型一氧化氮合酶的過量表達[22]。本研究觀察到，各組間IκBα蛋白表達差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，而模型組與空白組比較，p-IκBα表達及p-IκBα/IκBα的比值顯著升高，提示模型組中腦黑質存在核因子κB的顯著活化，而雷沙吉蘭組、針刺組、針刺艾灸組與模型組比較，p-IκBα表達與p-IκBα/IκBα比值均降低，表明3種方法均可有效降低IκBα的磷酸化水平，抑制核因子κB活化，提示抑制IκBα的磷酸化可能是針灸調節(jié)IL-17受體通路的關鍵作用機制之一。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)MPTP誘導的PD模型小鼠中腦黑質部IL-17受體A/NF-κB信號通路異常，并發(fā)現(xiàn)針灸可以調節(jié)IL-17受體A/NF-κB信號通路活性，調控IκBα的磷酸化水平可能是其中的關鍵機制之一。