定坤丹對宮腔粘連大鼠血管生成及PI3K/AKT/mTOR通路的影響研究

劉超萍 李 姣

(湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院婦產科，長沙，410007)

宮頸粘連(Intrauterine Adhesion，IUA)多由刮宮術后子宮內膜損傷引起，以子宮內膜粘連、子宮腔部分或完全閉塞、下腹部周期性疼痛、月經減少、不孕等為主要表現(xiàn)，為婦產科常見疾病之一[1]。研究表明，約有40%的不孕病例和7%的繼發(fā)性閉經病例與IUA相關[2]。目前對其發(fā)病機制的認識主要包括子宮內膜干細胞損傷、局部神經痙攣、纖維細胞增殖及新生血管形成等。近幾年研究發(fā)現(xiàn)，磷脂酰肌醇3激酶(Phosphoinositide 3-kinase，PI3K)/蛋白激酶B(Protein Kinase B,AKT)/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(Mammalian Target of Rapamycin，mTOR)信號通路能夠參與子宮內膜血管新生過程，與IUA的發(fā)生發(fā)展關系密切，通過干預PI3K/AKT/mTOR通路能夠有效抑制IUA大鼠子宮內膜的增生[3-4]。定坤丹為治療經血不調的名方，具有補腎養(yǎng)血，調經止痛之功效。臨床研究證明，其用于IUA患者具有良好療效，能夠顯著改善患者癥狀，減輕子宮腔粘連及子宮內膜增生，然而其發(fā)揮作用的具體機制尚未明晰[5]。本研究通過機械刮宮結合脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)感染建立IUA大鼠模型，觀察不同劑量定坤丹治療大鼠IUA的效果，并探討其調節(jié)PI3K/AKT/mTOR信號通路抑制IUA內膜血管生成及炎癥反應，恢復子宮形態(tài)的潛在機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 無特定病原體(Specific Pathogen Free,SPF)級SD大鼠60只，雌性，體質量180～200 g，由湖南省實驗動物中心提供，動物合格證號：SYXK(湘)2020-0015。于我院SPF級實驗動物房中飼養(yǎng)，室內保持20～22 ℃，明暗交替各12 h。所有動物實驗均經我院實驗動物福利倫理委員會審核批準(倫理審批號：20210412)。

1.1.2 藥物 脂多糖(Sigma公司，美國，貨號：L2880)；定坤丹(山西廣譽國藥有限公司，批號：20210308)；戊酸雌二醇片(拜耳醫(yī)藥保健有限公司，批號：108492)。

1.1.3 試劑與儀器 大鼠血管內皮生長因子(Vascular Endothelial Growth Factor，VEGF)、白細胞介素-6(Interleukin,IL-6)、白細胞介素-10(Interleukin-10，IL-10)酶聯(lián)免疫吸附試驗試劑盒(上海朗頓生物科技有限公司，批號：20210521、20210614、20210523)；VEGF抗體試劑盒(武漢博士德公司，批號：MK1165)；PI3K、AKT、mTOR一抗(Abcam公司，美國，批號：ab83091，ab35200，ab88204)；逆轉錄PCR(Reverse Transcription PCR，RT-PCR)引物(上海生工生物工程有限公司，貨號：S0214)。組織切片機(Leica公司，德國，型號：RM 2135)；光學倒置顯微鏡(OLYMPUS公司，日本，型號：BX51)；低溫高速離心機(Sigma公司，美國，型號：2K15)；多功能酶標儀(Tecan公司，瑞士，型號：GENIOSPLOS)；電泳儀(Bio-Rad公司，美國，型號：Mini-protean)，RT-PCR儀(Eppenndorf Centrifuge公司，德國，型號：7500)。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 稱取SD大鼠體質量并按體質量進行分層，隨后取各層內大鼠，隨機方法分為6組：空白組、模型組、戊酸雌二醇組、定坤丹低劑量組、定坤丹中劑量組、定坤丹高劑量組，每組10只。除空白組外，其余各組采用機械刮宮+LPS感染雙重損傷法建立IUA模型[6]：大鼠給予腹腔注射水合氯醛(400 mg/kg)麻醉后，無菌條件下切開下腹，暴露子宮，于子宮上方約1/3處作3 mm縱切口，采用宮腔刮勺經切口沿大鼠宮腔全層行刮宮術，至宮腔肌壁出現(xiàn)粗糙感時停止搔刮；將無菌手術線提前置于6 mg/L的LPS生理鹽水中，4 ℃浸泡24 h備用，于刮宮損傷后，將LPS手術線放入損傷宮腔，在腹壁留置約0.5 cm的尾絲以便隨后取出，生理鹽水沖洗并縫合切口，48 h后開腹，輕拉尾絲取出LPS棉線，生理鹽水沖洗并關腹，9 d后肉眼可見大鼠子宮色蒼白，宮腔狹窄，子宮四壁厚薄不均，病理可見宮腔狹窄，內膜粘連，腺體減少，組織纖維化增生，子宮內膜組織纖維化面積比明顯增加，即為IUA造模成功[7]。

1.2.2 給藥方法 各給藥組于造模術后第1天開始灌胃給藥治療，戊酸雌二醇組予以0.3 mg/kg灌胃干預，定坤丹低劑量組、中劑量組、高劑量組根據臨床人用劑量折算出大鼠等效劑量的1、2和4倍分別給予定坤丹混懸液(2.13、4.26、8.52 g/kg)灌胃治療，1次/d，持續(xù)給藥28 d。空白組、模型組給予等體積生理鹽水灌胃處理。

1.2.3 檢測指標與方法

1.2.3.1 蘇木精-伊紅(Hematoxylin Eosin，HE)染色觀察子宮組織病理形態(tài) 各組大鼠腹主動脈取血后處死，解剖后取部分子宮組織，置于10%多聚甲醛溶液中固定48 h，依次放入梯度乙醇中浸泡脫水，置于透明劑二甲苯中透明，經石蠟液包埋后冷卻凝固，切片機作5 μm厚切片。切片于恒溫箱中烘干，采用二甲苯脫蠟、梯度乙醇水化、蘇木精染色、1%鹽酸乙醇分化、伊紅染色、梯度乙醇脫水、二甲苯透明后，用中性樹膠封片，倒置光學顯微鏡下觀察子宮組織形態(tài)并拍照。

1.2.3.2 Masson染色觀察子宮組織纖維化面積 大鼠經腹主動脈取血后處死，解剖后取部分子宮組織，置于10%多聚甲醛溶液中固定48 h，依次放入梯度乙醇中浸泡脫水，置于透明劑二甲苯中透明，經石蠟液包埋后冷卻凝固，切片機作5 μm厚切片，行Masson染色，于高倍鏡(×200)下選取6個視野，采用Image-Pro Plus軟件計算組織纖維化面積比，纖維化面積比=纖維化面積/視野總面×100%[8]。

1.2.3.3 酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測血清中VEGF、IL-6、IL-8水平 大鼠經腹主動脈取血，血液于離心半徑13.5 cm，3 000 r/min轉速下離心15 min以分離血清，將血清樣品分裝并凍存于-20 ℃冰箱備用。臨用前將血清置于常溫下平衡1 h，3 000 r/min(離心半徑13.5 cm)，離心15 min，樣品孔加入血清樣品10 μL，樣品稀釋液40 μL和辣根過氧化物酶標記的抗體100 μL，同時做空白孔和標準孔，37 ℃恒溫箱中孵育1 h，洗板6次，各孔加入顯色液100 μL，37 ℃恒溫箱避光孵育15 min，加入終止液50 μL，酶標儀450 nm波長下檢測各孔OD值，根據標準孔OD值繪制標準曲線，代入樣品孔OD值計算各樣本VEGF、IL-6、IL-8的表達水平。

1.2.3.4 免疫組織化學法檢測子宮內膜VEGF蛋白表達 取大鼠部分子宮組織置于10%多聚甲醛溶液中固定48 h，經梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟液包埋后作5 μm切片，經脫蠟、透明和脫水后，切片滴加30%過氧化氫(H2O2)孵育20 min，枸櫞酸鈉抗原熱修復15 min，牛血清白蛋白(Bovine Serum Albumin，BSA)封閉20 min，一抗4 ℃孵育過夜，二抗37 ℃恒溫箱孵育20 min，鏈霉抗生物素蛋白-生物素-過氧化物酶復合物法(Streptavidin-biotin-peroxidase Complex method，SABC法)37 ℃恒溫箱孵育20 min，滴加二氨基聯(lián)苯胺(Diaminobenzidine，DAB)顯色，中性樹膠封片，倒置光學顯微鏡下觀察拍照，Image J軟件分析平均光密度值(MOD值)。

1.2.6 蛋白質印跡法檢測子宮組織PI3K/AKT/mTOR通路蛋白表達 取大鼠部分子宮組織，冰上快速勻漿后，加入放射免疫沉淀分析裂解緩沖液(Radio-Immunoprecipitation Assay Buffer,RIPA buffer)，4 ℃，12 000 r/min(離心半徑8 cm)離心20 min提取總蛋白，取少量上清二喹啉甲酸(Bicinchoninic Acid，BCA)法測定蛋白濃度。將蛋白樣品調至等濃度，加入10 μL樣品，SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳濃縮膠電泳分離，冰上轉膜，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，加入一抗，4 ℃冰箱孵育過夜，加入二抗，室溫孵育2 h，滴加增強型化學發(fā)光試劑(Enhanced Chemiluminescence,ECL)，凝膠成像系統(tǒng)曝光并拍照，用ImageJ軟件分析條帶灰度值，計算目的蛋白表達量。

1.2.7 反轉錄PCR檢測子宮組織PI3K/AKT/mTOR通路mRNA表達 取大鼠部分子宮組織，用無菌剪將組織塊剪成碎塊，采用Trizol裂解液提取總RNA，紫外分光光度法測定總RNA濃度，再將RNA逆轉錄為cDNA，按PCR試劑盒進行擴增，反應條件為95 ℃變性10 s，退火60 ℃ 30 s，40個循環(huán)。結果以β-actin為內參，2-△△Ct法分析相對mRNA表達量。具體引物序列見表1。

表1 各基因引物序列

2 結果

2.1 各組大鼠子宮病理形態(tài)變化 光鏡下可見空白組大鼠子宮結構清晰完整，子宮腔通暢，內膜厚度正常，腺體量多；模型組正常宮腔結構消失，子宮腔變小變窄，腺體數量減少；與模型組比較，定坤丹各劑量組大鼠子宮結構均有不同程度改善，隨給藥濃度的增加，大鼠腺體數量逐漸增多，子宮腔逐漸通暢。見圖1。

圖1 各組大鼠子宮組織病理形態(tài)變化(HE染色，×50)

2.2 各組大鼠子宮纖維化面積 Masson染色顯示，與空白組比較，模型組大鼠子宮組織纖維化面積比明顯升高(P<0.01)；定坤丹各劑量組治療后，大鼠子宮內膜組織中纖維化面積比隨給藥濃度的增加逐漸降低(P<0.05，P<0.01)。見圖2～3。

圖2 各組大鼠子宮組織纖維化情況(Masson染色，×200)

2.3 各組大鼠血清VEGF、IL-6、IL-8表達水平 與空白組比較，模型組大鼠血清中VEGF、IL-6、IL-8水平均有顯著升高(P<0.01)；戊酸雌二醇及定坤丹各劑量組血清VEGF、IL-6、IL-8的水平較模型組均明顯降低(P<0.05，P<0.01)，且定坤丹低劑量、中劑量、高劑量組之間呈劑量依賴性，以高劑量組改善作用最明顯。見表2。

表2 大鼠血清中VEGF、IL-6、IL-8的水平

圖3 各組大鼠子宮組織纖維化情況比較

2.4 各組大鼠子宮內膜VEGF蛋白陽性表達 免疫組化可見VEGF的陽性表達位于胞質內，呈棕黃色，胞核呈藍染。空白組大鼠子宮內膜僅見少量VEGF陽性表達，模型組VEGF陽性表達較空白組明顯增多，呈強陽性(P<0.01)；與模型組比較，定坤丹各劑量組VEGF表達均有不同程度的減少(P<0.05，P<0.01)，以定坤丹高劑量組最為明顯。見圖4～5。

圖4 各組大鼠子宮內膜中VEGF的陽性表達(IHC染色，×200)

2.5 各組大鼠子宮組織PI3K/AKT/mTOR通路的蛋白表達 與空白組比較，各組大鼠AKT、mTOR的蛋白表達差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，模型組大鼠PI3K、p-AKT和p-mTOR的表達較空白組顯著升高(P<0.01)；定坤丹各劑量組劑量依賴地降低了大鼠子宮組織PI3K、p-AKT、p-mTOR的表達(P<0.05，P<0.01)。見圖6～7。

圖5 各組大鼠子宮內膜中VEGF的陽性表達比較

圖6 各組大鼠子宮內膜組織PI3K/AKT/mTOR通路的蛋白表達

圖7 各組大鼠子宮內膜組織PI3K/AKT/mTOR通路的蛋白表達比較

2.6 各組大鼠子宮組織PI3K/AKT/mTOR通路的mRNA表達 與空白組比較，模型組大鼠子宮組織中PI3K、p-AKT、p-mTOR的mRNA表達顯著升高(P<0.01)；經定坤丹不同劑量治療后，大鼠PI3K、p-AKT和p-mTOR的mRNA表達水平較模型組明顯降低(P<0.05，P<0.01)，且效果具有劑量依賴型。見表3。

表3 各組大鼠子宮內膜組織PI3K/AKT/mTOR通路mRNA表達

3 討論

IUA是由刮宮術、子宮內膜感染、創(chuàng)傷等因素導致的以宮腔粘連閉塞為主要表現(xiàn)的常見并發(fā)癥。近年來，隨著人工流產率的不斷升高，IUA患病率也逐年攀升，由此引起的月經紊亂、閉經、周期性下腹疼痛、反復流產等一系列內分泌及生殖問題嚴重影響著患者的生殖健康[1-2]。目前臨床針對IUA的治療手段主要包括應用雌激素制劑結合宮腔鏡粘連松解術，以及術后放置宮內節(jié)育器等方法輔助宮腔隔離，這些療法雖然對部分患者具有良好療效，但復發(fā)率較高，中度和重度IUA患者術后復發(fā)率高達23%和62%，宮內節(jié)育器的放置也會阻礙子宮內膜再生，引起宮內感染和再次粘連等問題[9]。

中醫(yī)學中并無“IUA”相應病名記載，根據其癥狀表現(xiàn)可將其囊括于“婦人腹痛”“閉經”“不孕”等范疇。認為其病屬本虛標實，以金器所傷，胞脈受損，瘀血內停為其標，腎精耗傷，沖任虧損，血海不足為其本，腎虛兼血瘀為其病機關鍵，故治療當以益精補腎，化瘀活血為原則。定坤丹為清代治療經血不調的名方，有補腎養(yǎng)血調經之效。方中以人參、白術、茯苓、甘草“四君子”益氣補脾，鹿茸、杜仲、肉桂、鹿角霜補腎溫陽，干姜溫經通脈，當歸、熟地黃、阿膠、枸杞子滋肝補腎，白芍、川芎行氣活血，五靈脂、三七、延胡索、雞血藤、紅花、牛膝化瘀活血，香附、柴胡、烏藥、砂仁、黃芩疏肝調經，清熱解郁，諸藥合用，既滋補腎精、培補氣血，又行氣化滯，活血消瘀，使補血而不留滯，化瘀而不傷血，用于腎虛血瘀之IUA具有滿意療效。本實驗中，IUA模型大鼠子宮組織壞死，腺體減少，組織纖維化增生，纖維化面積與空白組比較明顯增加，符合IUA特征，經不同劑量定坤丹灌胃干預后，子宮內膜損傷程度及纖維化面積比均有不同程度改善，提示定坤丹對刮宮損傷和LPS感染所致的IUA具有明顯療效。

現(xiàn)代醫(yī)學對IUA的病理機制尚未完全明晰，多數研究認為，子宮內膜創(chuàng)傷所引起的炎癥及局部新生血管的形成在其發(fā)生與進展中起到重要作用[10-11]。VEGF能夠與血管內皮特異性結合，加速內皮細胞增殖和血管新生[12]。在子宮內膜出現(xiàn)感染和損傷后，局部缺血和炎癥環(huán)境可刺激VEGF的表達增多，引起新生血管形成和炎癥介質的釋放，進而促使內皮細胞增殖，導致子宮內膜增生和浸潤[13-14]。IL-6是巨噬細胞釋放的一種多功能炎癥介質，可參與機體局部炎癥反應的形成，IL-8是一種重要的炎癥介質，也是促血管生成因子[15-16]。在IUA發(fā)病過程中，受損子宮內膜引起的炎癥反應可引起IL-6和IL-8水平的升高，IL-6又可誘導VEGF的表達增多，增多的VEGF和IL-8可進一步引起內皮細胞增殖和黏附，使細胞外基質降解減少，大量堆積于子宮內膜，使之逐漸被結締組織取代，最終形成子宮內膜纖維化，為IUA的發(fā)病提供條件[17]。本實驗中，經定坤丹不同劑量灌胃治療后，IUA大鼠血清中IL-6、IL-8和VEGF的水平均明顯降低，免疫組織化學顯示子宮組織中VEGF的陽性表達亦有顯著減少，提示定坤丹可通過抑制IL-6和IL-8炎癥介質的釋放，降低VEGF的表達而抑制子宮內膜新生血管形成，延緩IUA的進展。

PI3K/AKT/mTOR信號通路是機體調節(jié)細胞增殖分化、凋亡、自噬與血管再生的重要途徑，與IUA的發(fā)病關系密切[18]。子宮內膜在缺血缺氧狀態(tài)下，VEGF表達的增多能夠誘導PI3K活化，AKT發(fā)生磷酸化，加速內皮細胞增殖并抑制其凋亡，PI3K/AKT的激活又可促進IL-8、VEGF等血管生成相關分子表達的增加，刺激血管內皮細胞生成，進而形成新生血管[19-20]。研究顯示，通過抑制PI3K/AKT通路激活能夠有效抑制IUA大鼠子宮內膜再生[4]。過度活化的PI3K/AKT進一步激活下游的mTOR，使其發(fā)生磷酸化，磷酸化的mTOR可發(fā)揮其生物活性，促使VEGF過量表達和內膜細胞的大量增殖[21]。本研究蛋白質印跡法和反轉錄PCR檢測結果可見，定坤丹能夠顯著抑制IUA大鼠PI3K、p-AKT和p-mTOR的蛋白及mRNA水平，說明定坤丹可能通過抑制PI3K/AKT/mTOR信號轉導通路的激活，發(fā)揮對IUA相關血管生成的抑制作用。

綜上所述，定坤丹能夠顯著減輕IUA大鼠子宮組織損傷和宮腔粘連，其中定坤丹高劑量組對各項指標的改善更為明顯，其作用機制可能與抑制PI3K/AKT/mTOR通路的活化水平，從而降低局部血管再生因子和炎癥介質的分泌相關。