白花蛇舌草抗炎機制的網絡藥理學分析及實驗研究

李 曼 張露蓉,2 金順琪 侯文躍 梁國強,2

(1 南京中醫藥大學附屬蘇州市中醫醫院中心實驗室，蘇州，215000；2 蘇州市吳門醫派研究院中藥研究與開發部，蘇州，215000)

白花蛇舌草別名蛇舌草、蛇舌癀，是茜草科耳草屬植物白花蛇舌草HedyotisdiffusaWilld.的干燥全草，性寒味苦甘，寒性清熱，苦味燥濕，用于治療各種濕熱病癥，具有清熱、利濕、解毒的功效[1-2]。其提取物分布較廣泛，包括蒽醌類、萜類、甾醇類和水溶性酚酸類等，具有抗炎抑菌、抗腫瘤、增強機體免疫的作用[3-7]。近年來，對白花蛇舌草抗炎作用的研究多停留在動物整體水平或細胞水平，對其中發揮抗炎作用的主要化學成分及機制研究并不深入[8-9]。網絡藥理學是基于系統生物學理論，對生物系統進行網絡分析，是研究中藥“多成分-多靶點-多通路”的作用手段[10-12]。本研究利用網絡藥理學分析方法篩選白花蛇舌草中與抗炎相關的靶點通路，以動物實驗模型評價其藥效作用并檢測血清中炎癥介質含量，探討其抗炎作用的物質基礎及潛在的分子靶點，為白花蛇舌草抗炎機制研究提供參考。

1 資料與方法

1.1 相關活性成分的篩選及“成分-靶點”網絡圖的構建 通過中藥系統藥理學數據庫與分析平臺(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP，https://tcmspw.com/tcmspsearch.php)檢索白花蛇舌草化學成分37個，以口服生物利用度(Oral Bioavailability，OB)≥30%、類藥性(Drug Likeness，DL)≥0.18為條件篩選白花蛇舌草有效活性成分并匹配其相關靶點，將其靶點數據在UniProt數據庫(https://www.uniprot.org/)中進行轉化、確認，導入Cytoscape 3.7.2軟件構建“白花蛇舌草活性成分-靶點”網絡圖。

1.2 疾病相關靶點的獲取 以“Anti-Inflammatory”為檢索詞，在人類基因數據庫(GeneCards)(https://www.genecards.org/)和在線人類孟德爾遺傳數據庫(Online Mendelian Inheritance in Man，OMIM，https://omim.org/)數據庫中搜索疾病靶點，根據Relevance Score值以中位數卡點獲得相關疾病靶點，利用韋恩圖在線繪制工具篩選白花蛇舌草抗炎成分和相關炎癥靶點的交集基因并繪圖。

1.3 蛋白質-蛋白質相互作用(Protein-protein Interaction，PPI)構建 將活性成分和疾病的交集靶點上傳至STRING數據庫(https://www.string-db.org/)，構建PPI網絡，結果導入Cytoscape 3.7.2軟件，計算各節點的Degree值，PPI圖根據Degree值大小進行排列。

1.4 基因本體(Gene Ontology,GO)富集分析和京都基因和基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)富集分析 將共有靶點導入Metascape數據庫(http://metascape.org/gp/index.html#/main/step1)進行GO和KEGG通路的富集分析，物種選擇“H.sapiens”，并運用相關軟件繪圖。

1.5 分子對接 選取PPI網絡圖中Degree值排名較高的靶點與相關活性成分進行分子對接，在RCSB PDB數據庫(http://www1.rcsb.org/)中下載相關靶點的3D結構“pdb”文件，在ZINC數據庫(http://zinc15.docking.org/)中下載化合物小分子的3D結構“mol2”文件，利用AutoDock軟件進行分子對接，最終結果以結合能來評價分子對接情況。

1.6 動物實驗材料

1.6.1 動物 健康ICR雄性小鼠，無特定病原體(Specific Pathogen Free,SPF)級，體質量在20～22 g，購自昭衍(蘇州)新藥研究中心有限公司，動物生產許可證號：SCXK(蘇)2018-0006。飼養于南京中醫藥大學附屬蘇州市中醫醫院吳門醫派研究院中心實驗室動物房內(倫理審批號：2018倫動批006)，在室溫22～25 ℃、相對濕度40%～50%、12 h光照條件下適應性喂養5 d。實驗過程嚴格按照中華人民共和國科技部發布的《關于善待實驗動物的指導性意見》。

1.6.2 藥液的制備 白花蛇舌草樣品購自藥材市場或經產地采收，由蘇州中醫醫院藥劑科進行鑒別。精密稱取白花蛇舌草干品40 g，用800 mL 75%乙醇(純水)提取2次，每次微沸后提取1 h，最后合并醇提液(水煎液)，旋蒸濃縮，冷凍干燥為粉末，冷藏備用。

1.6.3 試劑與儀器 95%乙醇(分析醇，上海聯試化工試劑有限公司，批號：160702)，雙氯芬酸鈉緩釋片(北京諾華制藥有限公司，批號：x0804)；二甲苯(上海聯試化工試劑有限公司，批號：20131201)；醋酸(天津市致遠化學試劑有限公司，批號：201620910236)；酶聯免疫吸附試驗試劑盒(IL-6、TNF-α)(聯科生物技術股份有限公司，貨號:70-EK2062/2，70-EK2822/2)；玻璃旋轉蒸發儀(Heidolph公司，德國，型號：Heizbad HB digit)；高速離心機(Sigma公司，德國，型號：1-13型)

1.7 實驗方法

1.7.1 分組與給藥 將小鼠隨機分為模型組(0.9%生理鹽水)、陽性藥組(雙氯芬酸鈉緩釋片，DSSRT，13 mg/kg)、白花蛇舌草水提物組[2、4、8 g(生藥)/kg]、醇提物組[2、4、8 g(生藥)/kg]，每組8只。實驗前1 d禁食18 h。每天灌胃給藥，1次/d，連續7 d。

1.7.2 二甲苯致小鼠耳腫脹實驗 于末次給藥1 h后，將20 μL二甲苯(100%)均勻涂抹于各組小鼠右耳的兩面致炎，小鼠的左耳不涂作為對照，30 min后摘眼球取血并脫頸椎處死，沿小鼠耳郭剪下小鼠的兩耳，用直徑6 mm的打孔器在左右耳相同位置打下圓形耳片，分別稱重，以雙耳片的質量差作為耳腫脹度，計算腫脹抑制率。腫脹度=右耳質量-左耳質量。

將血液于離心機上3 500 r/min(離心半徑6 cm)，離心10 min，取上清，按照酶聯免疫吸附試驗試劑盒說明書檢測血清中白細胞介素-6(Interleukin-6，IL-6)、腫瘤壞死因子-α(Tumor Necrosis Factor，TNF-α)的含量。

1.7.3 醋酸致小鼠扭體實驗 末次給藥1 h后，各小鼠注射醋酸溶液(0.6 %)0.2 mL，計時15 min，記錄其扭體次數(腹部收縮內凹、伸展后肢、臀部抬高)，以模型組與給藥組小鼠扭體均數之差占模型組扭體均數的百分比表示抑制率[13]。

2 結果

2.1 白花蛇舌草主要活性成分的分析 得到7個活性成分，根據文獻報道及篩選結果發現，E-6-O-P-Methoxycinnamoyl Scandoside Methyl Ester具有極高的類藥性，Deacetyl Asperuloside Acid_Qt具有較高OB，共9個活性成分。見表1。

表1 白花蛇舌草主要活性成分

在TCMSP數據庫中，除1、3、9號成分未匹配到相關靶點，其余成分獲得相關靶基因173個。圖1中有6個活性成分節點和173個靶基因節點，綠色菱形代表靶點，紅色長方形是活性成分，淺藍色長方形是藥物名稱，均以Degree值大小依次排列。活性成分按照度值排列為Quercetin(槲皮素)、Stigmasterol(豆甾醇)、2-Methoxy-3-Methyl-9,10-Anthraquinone、Beta-Sitosterol(Β-谷甾醇)、Deacetyl Asperuloside Acid_Qt、Poriferasterol；度值≥4的靶點有PTGS2、PTGS1、NCOA2、GABRA1、ADRB2、SCN5A。

圖1 白花蛇舌草“活性成分-預測靶點”網絡

2.2 白花蛇舌草活性成分和炎癥靶點交集基因 從數據庫中搜索8 297個疾病靶點相關信息，根據Relevance score值以中位數卡點，得1 046個靶點信息，繪制與成分靶點的交集基因的韋恩圖，共得交集基因99個。見圖2。

圖2 白花蛇舌草活性成分與炎癥靶點交集基因韋恩圖

2.3 白花蛇舌草PPI網絡的構建 根據Degree值大小將99個交集靶點按照形狀由大到小、顏色由紅到淺藍色進行排序，度值≥60的靶點有IL-6、AKT1、TNF、VEGFA、TP53、PTGS2、JUN、MMP9、CXCL8、IL-1β、CASP3、EGF、EGFR、CCL2、MAPK1，度值越高表明此節點越重要。見圖3。

圖3 PPI網絡及篩選結果

2.4 GO功能和KEGG通路的富集分析 GO分析選取P值前20項，分析結果發現，相關靶點在細胞分布上主要分布于膜筏、膜微區、膜區、細胞外基質等；分子功能主要集中于轉錄因子結合、細胞因子受體結合、細胞因子活性和RNA聚合酶Ⅱ轉錄因子結合等功能。參與的生物過程涉及脂多糖、細菌來源分子、毒性物質反應、應對受傷、細胞外刺激的反應、凋亡信號通路、氧化應激反應等。見圖4。

圖4 白花蛇舌草相關靶點的GO富集分析

KEGG富集到兩百多條通路，其中癌癥通路中Pathways in cancer相關靶點44個，為擊中靶點最多的通路，前20項結果顯示，所預測的相關靶點信息與炎癥相關通路有：AGE-RAGE信號通路、TNF信號通路、IL-17信號通路，與其相關的靶點有AKT1、TNF、IL-6、PTGS2、VEGFA等。見圖5。

圖5 預測靶點KEGG通路富集分析

2.5 分子對接 將PPI網絡中Degree值排名前6位的交集靶點AKT1(PDB ID 3CQW)、IL-6(PDB ID 4O9H)、TNF(PDB ID 2AZ5)、VEGFA(PDB ID 4KZN)，其中β-谷甾醇與AKT1結合能力最強，Poriferasterol、2-methoxy-3-methyl-9,10-anthraquinone、豆甾醇與5個靶點結合力普遍較強。見表2。

表2 分子對接結果(1 cal=4.184 J)

2.6 白花蛇舌草對小鼠耳腫脹的影響 白花蛇舌草水提液和醇提液均可顯著減輕小鼠耳腫脹，降低小鼠血清中IL-6、TNF-α因子水平。見圖6。在耳腫脹實驗中，各給藥組腫脹度與模型組比較，差異均有統計學意義(均P<0.05)，且以水提物高劑量組藥效最好。此外，與對照組比較，2種提取物中、高劑量組均可明顯降低小鼠血清中炎癥介質IL-6水平和TNF-α水平，差異均有統計學意義(均P<0.05)。見表3。

表3 白花蛇舌草對二甲苯致小鼠耳緣腫脹反應模型的影響(n=8)

圖6 白花蛇舌草提取物對耳腫脹小鼠血清中IL-6、TNF-α的影響

2.7 白花蛇舌草對醋酸致小鼠扭體的影響 白花蛇舌草水提物和醇提物均可明顯減少醋酸致小鼠扭體次數；除水提物低劑量組外，各給藥組與模型組比較，差異均有統計學意義(均P<0.05)，以水提物高劑量組鎮痛效果最佳。見表4。

表4 白花蛇舌草對醋酸致小鼠扭體反應模型的影響(n=8)

3 討論

白花蛇舌草是清熱解毒的良藥，現代臨床研究以其抗腫瘤作用為主，但在傳統古方中白花蛇舌草多用于治療蟲蛇咬傷等引起的紅腫熱痛，即現代醫學常說的急性炎癥[14]。本研究基于網絡藥理學方法，篩選得6個活性成分，173個相關靶點，取其活性成分和抗炎交集靶點99個，構建“靶點-成分”可視化網絡，藥物活性成分包括槲皮素、豆甾醇、2-Methoxy-3-Methyl-9,10-Anthraquinone、Β-谷甾醇、Deacetyl Asperuloside Acid_Qt、Poriferasterol，核心靶點有AKT1、IL-6、TNF、VEGFA、TP53、PTGS2等[15]。槲皮素具有廣泛抗炎作用[16]；豆甾醇能顯著抑制TNF-α、IL-6、IL-1β、誘導型一氧化氮合酶和環氧合酶2的表達，通過下調核因子κB、P65，抑制核因子κB抑制物磷酸化(Phosphorylation of Nuclear Factor-kappa B Inhibitorα，p-IκBα)活化，增加了抗炎因子IL-10的表達[17]；Β-谷甾醇能夠最大程度地降低脂多糖誘導的RAW 264.7細胞中一氧化氮的產生，抑制巨噬細胞IL-6的活性，并減少TNF-α和IL-1β的分泌，達到抗炎效果[18]；2-Methoxy-3-Methyl-9,10-Anthraquinone尚未見文獻報道相關抗炎作用。核心靶點中AKT1與細胞代謝、生存遷移和基因表達有關，可通過調節血管通透性發揮作用，導致水腫和白細胞外滲，對于急性炎癥和組胺介導的血管滲漏至關重要[19]。IL-6是趨化因子家族中的細胞因子，能促進B細胞增殖分化，增強炎癥細胞的浸潤[20]；血管內皮生長因子A可促進體外血管內皮細胞的生長，誘導體內血管增生，增加血管的通透性，從而促進炎癥介質的生成[21]；在急性炎癥反應中，活化轉錄因子3(Activating Transcription Factor 3，ATF3)負調節前列腺素-內過氧化酶合酶(Prostaglandin-endoperoxide Synthase2,PTGS2),PTGS2軸失調可能會導致慢性炎癥疾病中白細胞積累增加，前列腺素E2/前列腺素D2水平升高，PTGS2表達異常[22]。以上皆表明白花蛇舌草中6個活性成分可能作用于AKT1、IL-6、TNF、VEGFA、TP53、PTGS2等靶點發揮抗炎作用，分子對接也證明此結合的有效性。

GO和KEGG通路富集分析顯示花蛇舌草通過不同途徑調控體內多種信號通路。發揮抗炎效應的靶點主要參與TNF、IL-17、AGE-RAGE等信號通路。TNF是由巨噬細胞或單核細胞活化產生的細胞因子，其下游轉導信號有核因子κB、細胞凋亡、JNK等信號通路途徑，在炎癥反應、腫瘤免疫等方面發揮重要作用[23]。IL-17是一種高度多功能的炎癥介質，在宿主防御、組織修復、炎癥疾病發病機制和癌癥進展等多種過程中都至關重要[24]。

本研究進一步通過體內實驗對白花蛇舌草的抗炎鎮痛作用進行藥效學的驗證，結果顯示其提取液可顯著減輕二甲苯致小鼠耳腫脹，減少醋酸致小鼠扭體次數，降低血清中IL-6、TNF-α水平。體內實驗水提物呈良好的“量-效”關系，提示白花蛇舌草提取液中水溶性成分越高，抗炎作用越有優勢。此外，醇提液也有明顯的抗炎作用，表明溶于水醇溶液中的抗炎成分同樣不可忽視。

綜上所述，白花蛇舌草可能通過Β-谷甾醇，Poriferasterol、2-Methoxy-3-Methyl-9,10-Anthraquinone、豆甾醇等關鍵成分影響AKT1、IL-6、TNF、VEGFA、PTGS2等關鍵靶點，影響TNF等信號通路，體現了白花蛇舌草治療炎癥作用的“多成分、多靶點、多通路”的特點，通過體內實驗進一步驗證其抗炎作用，推測其抗炎機制可能與抑制TNF-α和IL-6這2種炎癥介質的生成有關，為白花蛇舌草抗炎機制的進一步研究提供參考。