作物茬口對黑土農(nóng)田土壤反硝化細(xì)菌數(shù)量及群落結(jié)構(gòu)的影響

王 璐，劉俊杰，劉株秀，顧海東，張興義，王光華，劉曉冰

（1 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150030；2 中國科學(xué)院東北地理與農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所 /黑土區(qū)農(nóng)業(yè)生態(tài)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江哈爾濱 150081）

反硝化作用是硝酸鹽 (NO3-)逐步被還原成亞硝酸鹽 (NO2-)、一氧化氮 (NO)、一氧化二氮 (N2O)和終產(chǎn)物氮 (N2)的四步還原過程[1-2]。NO2-還原為NO是反硝化細(xì)菌區(qū)別于其他硝酸鹽呼吸細(xì)菌的關(guān)鍵過程[3]，此步還原過程是由亞硝酸鹽還原酶 (NIR)催化的，該酶具有兩種結(jié)構(gòu)不同但功能相同的形式，分別為nirS基因編碼的cd1細(xì)胞色素還原酶和nirK型基因編碼的含銅還原酶[4-5]。N2O是重要的溫室氣體，其全球變暖潛力比等摩爾量的CO2高出300倍[6]。農(nóng)田是溫室氣體的主要來源，農(nóng)業(yè)土壤排放的N2O約占全球人為排放N2O的60%，而土壤微生物介導(dǎo)的反硝化作用被認(rèn)為是人為N2O排放的關(guān)鍵因素[7-8]。目前如何通過調(diào)控土壤反硝化作用減少N2O的排放備受關(guān)注[9]。

土壤微生物在土壤生態(tài)系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用，是評價(jià)土壤生態(tài)系統(tǒng)功能的重要指標(biāo)[10]。土壤微生物介導(dǎo)了包括固氮作用、硝化作用和反硝化作用等重要的土壤氮素循環(huán)過程[11]。大量研究證實(shí)，連作導(dǎo)致土壤理化性質(zhì)惡化、土壤生物群落失衡，不僅影響農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定性，而且顯著降低作物產(chǎn)量，而輪作被認(rèn)為是保持土壤肥力和土壤健康的一種合理耕作方式。周麗等[12]對四川紫色土反硝化細(xì)菌nirS型基因豐度的研究發(fā)現(xiàn)，玉米-大豆輪作體系的nirS型基因豐度顯著高于連作處理。Behnke等[13]研究發(fā)現(xiàn)，與玉米-大豆輪作比，玉米連作的nirS型基因豐度無顯著變化，但顯著增加了nirK型基因豐度。Jude等[14]研究發(fā)現(xiàn)，輪作處理大豆茬口下，nirK型基因豐度顯著高于輪作體系下的小麥茬口，而不同作物茬口的nirS型基因豐度沒有顯著變化。此外，研究結(jié)果表明，土壤類型[15]、作物茬口[16]和輪作年限[17]均對反硝化細(xì)菌數(shù)量和群落組成具有顯著影響。因此，以反硝化nirS和nirK型基因?yàn)闃?biāo)記，開展不同作物茬口土壤反硝化微生物群落變化特征研究，有助于進(jìn)一步認(rèn)知土壤微生物參與的農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)的生物地球化學(xué)循環(huán)過程。

黑龍江省農(nóng)作物種植面積達(dá)10.99萬hm2，糧食產(chǎn)量占全國的1/4，調(diào)出量占1/3，是我國糧食安全的“壓艙石”和“穩(wěn)壓器”。黑龍江省是我國大豆的主產(chǎn)區(qū)，隨著國家作物種植結(jié)構(gòu)的調(diào)整和大豆產(chǎn)業(yè)振興計(jì)劃的實(shí)施，加之耕地面積和經(jīng)濟(jì)效益的制約，東北地區(qū)大豆連作現(xiàn)象有所加重，必將制約中國大豆生產(chǎn)力的提高，威脅中國大豆產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展，是目前亟待解決的現(xiàn)實(shí)問題。連作則會導(dǎo)致土壤肥力不均衡，降低土壤肥力，引發(fā)連作障礙，從而導(dǎo)致土傳病害加重，而輪作是改善土壤肥力、減少養(yǎng)分流失的有效技術(shù)措施[18]。目前，基于黑土農(nóng)田土壤不同作物茬口下反硝化細(xì)菌群落的變化特征的研究相對較少。因此，開展該地區(qū)不同作物茬口下土壤反硝化細(xì)菌數(shù)量、多樣性指數(shù)、群落組成及其與反硝化速率間的作用關(guān)系研究，對選擇適宜的種植方式提高土壤氮素利用率和改善土壤生態(tài)功能具有重要意義。鑒于此，本研究采用qPCR和高通量測序技術(shù)對黑土區(qū)玉米連作、大豆連作和玉米-大豆輪作體系下土壤反硝化細(xì)菌數(shù)量和群落特征進(jìn)行綜合分析，旨在從微生物生態(tài)學(xué)角度，明確不同作物茬口下反硝化細(xì)菌群落的變化特征，闡明不同作物茬口影響N2O排放的微生物學(xué)機(jī)制，為提出減少溫室氣體排放的種植方式提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與土壤樣品采集

利用2013年建立于中國科學(xué)院東北地理與農(nóng)業(yè)生態(tài)所海倫水土保持監(jiān)測研究站的長期定位試驗(yàn)開展研究。試驗(yàn)站位于黑龍江省海倫市前進(jìn)鄉(xiāng)光榮村(47°23′N，126°51′E)，海拔高度為 210 m；是溫帶大陸性季風(fēng)氣候，冬季干燥寒冷，夏季炎熱多雨，平均年降水量為530 mm，年均氣溫1.5℃，極端最高溫度為37℃，極端最低溫度為-39.5℃，土壤類型為典型黑土，該地區(qū)是雨養(yǎng)農(nóng)業(yè)區(qū)。

該定位試驗(yàn)2013年開始種植玉米，2014年種植大豆，由此循環(huán)。該樣地采用人工播種、人工除草、機(jī)械中耕的方法。選用定位試驗(yàn)中的4個(gè)處理，分別為：大豆連作 (CC)、玉米連作 (SS)、玉米-大豆輪作玉米茬口 (CSC)和玉米-大豆輪作大豆茬口 (SSC)處理。隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，4次重復(fù)，每小區(qū)12條壟，壟距為0.7 m，壟長為9 m，每個(gè)小區(qū)面積為75.6 m2。種植的大豆和玉米品種分別為‘東生1號’和‘興墾5號’，種植大豆小區(qū)施用磷酸二銨150 kg/hm2、尿素50 kg/hm2和硫酸鉀50 kg/hm2；玉米小區(qū)施用磷酸二胺150 kg/hm2、尿素70 kg/hm2和硫酸鉀50 kg/hm2，并在玉米生長的V6期追施225 kg/hm2尿素。

于2018年大豆成熟期和玉米蠟熟期，采集16個(gè)土壤樣品，土樣過2 mm篩后分為3份，一份于-80℃保存，用于土壤微生物DNA提取；一份風(fēng)干，用于土壤理化性質(zhì)測定；一份于4℃保存，用于反硝化速率測定。

1.2 土壤理化性質(zhì)測定

土壤pH采用pH計(jì) (PHS-3C，中國)測定 (w土:v水為 1 : 5 )。利用元素分析儀 (VarioELIII，德國)測定土壤全碳和全氮含量。土壤全磷、速效磷、銨態(tài)氮 (NH4+-N)和硝態(tài)氮 (NO3--N)含量用連續(xù)流動(dòng)分析儀 (SKALAR SAN++，荷蘭)測定。利用電感耦合等離子發(fā)射光譜 (ICPS-7500，日本)測定土壤全鉀和有效鉀含量。

1.3 土壤反硝化速率

采用乙炔抑制法測定土壤的反硝化速率[19]。取4℃保存的土壤樣品于28℃活化7天，取10 g活化后的土樣放入集氣瓶中，加入10 mL無菌蒸餾水，提供厭氧環(huán)境。集氣瓶瓶蓋插入兩個(gè)針頭，一個(gè)充氮?dú)猓粋€(gè)排空氣，待排除瓶內(nèi)空氣后，抽取15 mL氮?dú)猓右胰?5 mL，震蕩1 h，25℃培養(yǎng)12 h。由于乙炔氣體的存在抑制了N2O向N2的還原，所以N2O成為了反硝化作用的最終產(chǎn)物，最后通過氣相色譜 (GC-2010，日本)測定集氣瓶中N2O的濃度，用以表征土壤反硝化作用的強(qiáng)弱。

1.4 土壤總DNA提取、qPCR和Illumina MiSeq測序

稱取土壤樣品0.5 g，采用Fast DNA?Spin Kit for Soil (MP Biomedicals，美國)試劑盒，按照說明書提取土壤總DNA，并使用NanoDrop?2000 (Thermo Scientific, USA)檢測DNA濃度和純度，將提取的DNA放入-20℃冰箱中保存。

利用引物 Cd3aF (5′-GTSAACGTSAAGGARACSGG-3′)/R3cdR (5′-GASTTCGGRTGSGTCTTGA-3′)[20]和 F1aCu (5′-ATCATGGTSCTGCCGCG-3′)/R3Cu (5′-GCCTCGATCAGRTTGTGGTT-3′)[21]，分別對反硝化細(xì)菌nirS型基因和nirK型基因進(jìn)行擴(kuò)增。利用 LightCycler?480 thermocycler (Roche Applied Science)進(jìn)行qPCR反應(yīng)。將拷貝數(shù)已知的質(zhì)粒DNA，按10倍梯度稀釋做標(biāo)準(zhǔn)曲線，每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)樣品做4次重復(fù)。qPCR反應(yīng)體系包括10 μL SYBR?Premix Ex Taq (Takara，大連，中國)、1 μL 土壤樣品 DNA、1 μL 10 μmol/L 正向引物、1 μL 10 μmol/L反向引物和7.0 μL H2O。反應(yīng)條件為：95℃初變性30 s，然后95℃變性5 s，60℃退火和延伸30 s，共25個(gè)循環(huán)，最后50℃保持30 s。

采用上述相同的引物，對nirS和nirK型基因進(jìn)行高通量測序分析。區(qū)別于qPCR分析，高通量測序分析每個(gè)引物5′端被樣本特異的barcode所修飾，以區(qū)分土壤樣本的處理來源。PCR體系共25 μL，包含 2.5 μL 10× PCR buffer、2 μL 2.5 mmol/L dNTPs、0.25 μL Taq 酶 (5 U/μL) (TaKaRa，大連，中國)、0.5 μL正向和反向引物，2 μL樣品DNA為模板，用滅菌超純水補(bǔ)足至25 μL。PCR反應(yīng)條件：95℃初變性5 min，然后95℃變性1 min，63℃復(fù)性1 min和72℃延伸1 min，共30個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸5 min。每個(gè)樣品做3次重復(fù)，PCR產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳檢測，并利用膠純化試劑盒 (TaKaRa，大連，中國)進(jìn)行純化。利用Illumina MiSeq平臺 (上海美吉生物公司，中國)對純化后的PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序分析。

1.5 測序數(shù)據(jù)分析

基于Illumina PE 300測序平臺，測序結(jié)果通過QIIME Pipeline Version 1.9.0軟件進(jìn)行分析 (http://qiime.org/tutorials/tutorial.html)。首先，將獲得的反硝化細(xì)菌FASTQ原始序列文件，進(jìn)行序列拆分和質(zhì)量控制[22]。利用FLASH (fast length adjustment of short reads)軟件，對質(zhì)控序列進(jìn)行雙端拼接，去除序列短于200 bp以及平均質(zhì)量得分小于20的序列信息[23]。將得到的優(yōu)質(zhì)序列，以97%相似度水平進(jìn)行OTU(operational taxonomic units)聚類。將每個(gè)OTU的代表性序列翻譯成氨基酸序列，然后在NCBI上比對。使用Mega軟件將代表性序列與參考序列對比，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。將每個(gè)樣品的序列，按最小序列數(shù)進(jìn)行抽平處理，用于后續(xù)生物信息學(xué)分析。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

基于SPSS (Version 18.0)軟件，利用單因素方差分析 (one-way ANOVA)對不同處理的土壤理化性狀、反硝化速率和反硝化細(xì)菌相對豐度進(jìn)行差異顯著性分析。利用R (Version 3.3.1)軟件 (R Development CoreTeam, 2006)的“vegan”包，進(jìn)行基于Bray-Curtis距離的主坐標(biāo)分析 (principal co-ordinates analysis，PCoA)和冗余分析 (redundancy analysis，RDA)，以分析不同處理間反硝化細(xì)菌群落的差異及其主要驅(qū)動(dòng)因素。用R軟件的“pheatmap”包進(jìn)行反硝化細(xì)菌相對豐度與反硝化速率間相關(guān)性的Heatmap分析。此外，利用SPSS AMOS軟件 (Version 24.0，Chicago，IL: Amos Development Corporation)構(gòu)建結(jié)構(gòu)方程模型 (structural equation models，SEM)，以解析土壤理化性質(zhì)、nirS型和nirK型反硝化細(xì)菌基因豐度和群落結(jié)構(gòu)對反硝化速率的影響。采用方差膨脹系數(shù)(variance inflation factor，VIF)分析，構(gòu)建以土壤全氮、C/N和NO3--N為最佳土壤理化因子的SEM結(jié)構(gòu)方程模型。

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤理化性質(zhì)變化的差異

表1顯示，4個(gè)處理的土壤pH、全碳、全鉀以及速效鉀含量無顯著差異 (P＞0.05)。與連作處理CC和SS相比，輪作處理的CSC和SSC顯著提高了土壤全氮含量，而降低了土壤C/N (P＜0.05)。此外，CSC顯著增加了銨態(tài)氮 (NH4+-N)和硝態(tài)氮 (NO3--N)含量，但顯著降低了土壤全磷含量，SSC顯著增加了土壤速效磷含量 (P＜0.05)。

表1 不同作物茬口對土壤理化性狀的影響Table 1 The effects of crop stubble in different cropping systems on soil physical and chemical properties

2.2 土壤反硝化速率及反硝化細(xì)菌豐度變化差異

4個(gè)處理間土壤反硝化速率差異顯著 (P＜0.05)(圖1)。其中，CC處理的土壤反硝化速率最高，達(dá)到21.15 μg/(g·h)；其次是輪作處理CSC和SSC，反硝化速率分別為16.93和16.48 μg/(g·h)。SS處理的土壤反硝化速率最低，為7.00 μg/(g·h)，相比于CC、CSC和SSC處理，分別降低66.9%、58.7%和57.5% (P＜0.05)。

圖1 不同作物茬口對土壤的反硝化速率的影響Fig.1 Effects of crop stubble in different cropping systems on soil denitrification rate

不同處理?xiàng)l件下，反硝化細(xì)菌nirK型基因拷貝數(shù)為 6.83×106～10.31×106/ (g, soil)，nirS型基因拷貝數(shù)為 2.59×107～3.48×107/ (g, soil) (圖2)。輪作處理SSC和CSC中nirS和nirK型基因拷貝數(shù)均顯著高于SS處理 (P＜0.05)，SSC處理的nirK型基因拷貝數(shù)顯著高于CC處理 (P＜0.05)，而SSC和CSC的nirS型基因拷貝數(shù)與CC處理無顯著差異 (P＞0.05)。

圖2 不同作物茬口對反硝化基因豐度的影響Fig.2 The effects of crop stubble in different cropping systems on denitrification gene abundance

2.3 土壤反硝化速率與反硝化細(xì)菌的相關(guān)性

本研究分別獲得了471和1055個(gè)nirS和nirK型反硝化細(xì)菌OTUs。土壤nirS和nirK型反硝化細(xì)菌OTUs與反硝化速率的相關(guān)性分析結(jié)果 (圖3)表明，nirS型基因中，OTU225 (羅河桿菌屬Rhodanobacter)、OTU357 (草螺菌屬Herbaspirillum)等30個(gè)OTUs與土壤反硝化速率呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系；OTU63 (噬氫菌屬Hydrogeaophaga)、OTU472 (慢生根瘤菌屬Bradyrhizobium)等9個(gè)OTUs與土壤反硝化速率呈顯著正相關(guān)關(guān)系，其余OTUs與土壤反硝化速率則無顯著相關(guān)性。在nirK基因中，OTU346 (慢生根瘤菌屬Bradyrhizobium)、OTU159 (中慢生根瘤菌屬M(fèi)esorhizobium)等24個(gè)OTUs與土壤反硝化速率呈顯著正相關(guān)；而OTU281 (根瘤菌屬Rhizobium)、OTU258 (中慢生根瘤菌屬M(fèi)esorhizobium)等65個(gè)OTUs與反硝化速率呈負(fù)相關(guān)，其余966個(gè)OTUs與土壤反硝化速率無顯著相關(guān)性。

圖3 土壤反硝化速率與反硝化細(xì)菌的相關(guān)性分析Fig.3 Correlation between soil denitrification rate and denitrifying bacterial communities

2.4 nirS型和nirK型反硝化細(xì)菌群落的變化

圖4列出了土壤nirS和nirK型反硝化細(xì)菌中與反硝化速率顯著正相關(guān)的8個(gè)屬 (OTUs)在不同茬口土壤總的相對豐度。CC和CSC處理的nirS和nirK型反硝化細(xì)菌相對豐度均高于甚至顯著高于SS處理。除OTU261 (慢生根瘤菌屬Bradyrhizobium)和OTU307 (中慢生根瘤菌屬M(fèi)esorhizobium)的相對豐度顯著高于CSC處理外，CC處理其余的OTUs基因豐度與CSC處理的多無顯著差異。nirK型反硝化細(xì)菌中，CC處理OTU346 (慢生根瘤菌屬Bradyrhizobium)、OTU376 (假單胞菌屬Pseudomonas)和OTU307 (中慢生根瘤菌屬M(fèi)esorhizobium)在CSC和SSC處理中的相對豐度差異不顯著，而OTU261 (慢生根瘤菌屬Bradyrhizobium)在輪作體系SSC處理中相對豐度顯著高于CSC處理，且均明顯高于SS處理 (P＜0.05)。nirS型反硝化細(xì)菌中，輪作體系CSC處理的OTU472(慢生根瘤菌屬Bradyrhizobium)、OTU129 (新草螺菌屬Noviherbaspirillum)和OTU100 (草螺菌屬Herbaspirillum)相對豐度均顯著高于SSC處理，且OTU129和OTU100的相對豐度顯著高于SS處理(P＜0.05)。

圖4 不同作物茬口土壤下nirK和nirS型細(xì)菌中與反硝化速率正相關(guān)的8個(gè)屬(OTUs)的基因相對豐度Fig.4 The relative gene abundance of the eight OTUs is positively related to the denitrifying rate of nirK or nirS in soils with different crop stubbles

2.5 不同茬口反硝化細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)及其驅(qū)動(dòng)因素

基于bray-curtis距離的PCoA分析結(jié)果(圖5)表明，PCoA1和PCoA2分別解釋了nirS型反硝化細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)變化的47.72%和7.83%。根據(jù)Adonis分析，nirS型反硝化細(xì)菌群落中SSC處理和CSC處理各自單獨(dú)聚類 (Adonis test，P=0.028)，而CC和SS處理群落相似度較大 (Adonis test，P=0.212)。對于nirK型反硝化細(xì)菌而言，PCoA1和PCoA2分別解釋了群落結(jié)構(gòu)變異的34.36%和14.46%。Adonis分析表明，CC處理和SS處理的nirK型反硝化細(xì)菌群落存在顯著差異 (Adonis test，P=0.036)，而SSC處理和CSC處理在PCoA分析圖譜中聚集較為緊密，其群落相似度較高 (Adonis test，P=0.134)。此外，RDA分析結(jié)果表明，NO3--N和C/N分別是nirS和nirK型反硝化細(xì)菌群落分異的最主要驅(qū)動(dòng)因子。

圖5 不同作物茬口土壤中反硝化細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)及其驅(qū)動(dòng)因素Fig.5 Denitrifying bacterial community structures and their driving factors in soils with different crop stubbles

2.6 土壤理化性質(zhì)、nirS和nirK型反硝化細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和基因豐度對反硝化速率的影響

本研究利用結(jié)構(gòu)方程模型 (SEM)探究了土壤理化性質(zhì)、反硝化基因豐度及反硝化細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)對土壤反硝化速率的影響 (圖6)。SEM分析結(jié)果表明，土壤全氮與nirS型 (R2=-0.62)和nirK型 (R2=-0.66)反硝化細(xì)菌的基因豐度呈顯著負(fù)相關(guān)，與土壤反硝化速率呈顯著正相關(guān) (R2=0.78)。土壤C/N和NO3--N均通過影響nirS型 (R2=0.65)和nirK型 (R2=0.59)反硝化細(xì)菌群落多樣性，間接影響土壤反硝化速率。此外，nirS型反硝化細(xì)菌群落多樣性與反硝化速率呈顯著正相關(guān) (R2=0.92)，nirK型反硝化細(xì)菌群落多樣性與反硝化速率呈顯著負(fù)相關(guān) (R2=-0.81)，而nirS和nirK型基因豐度與土壤反硝化速率無顯著相關(guān)關(guān)系。

圖6 土壤理化性質(zhì)與反硝化細(xì)菌群落對反硝化速率的直接與間接影響Fig.6 Direct and indirect effects of soil physical and chemical properties and denitrifying bacterial communities on soil denitrification rate

3 討論

3.1 作物茬口對土壤理化性質(zhì)、反硝化細(xì)菌豐度和反硝化速率的影響

作物茬口顯著影響著土壤的理化性質(zhì)。與大豆連作相比，玉米-大豆輪作顯著增加了土壤pH、全氮、全碳和速效養(yǎng)分含量[24-25]。本研究中，不同作物茬口的土壤pH和全碳含量無顯著差異，可能與本研究的試驗(yàn)持續(xù)時(shí)間較短 (第5年)、輪作倒茬僅兩次有關(guān)。然而，與玉米連作和大豆連作處理相比，玉米-大豆輪作體系處理顯著增加了土壤全氮含量(表1)。利用相同的土壤樣本，Zou等[26]研究發(fā)現(xiàn)，玉米-大豆輪作導(dǎo)致大豆根瘤菌數(shù)量增加，大豆從空氣中固定更多的氮素，進(jìn)而增加了土壤全氮含量。

在本試驗(yàn)中，nirS型反硝化細(xì)菌的基因豐度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于nirK型細(xì)菌，表明短期內(nèi)nirS型反硝化細(xì)菌可能比nirK型細(xì)菌在土壤反硝化中發(fā)揮更重要的作用[27-28]。Wang等[29]研究發(fā)現(xiàn)，nirK型反硝化細(xì)菌主要在深層土壤中富集，而本研究采集的土壤樣品為表層 (0—15 cm)土壤，這可能是導(dǎo)致nirK型反硝化細(xì)菌豐度低于nirS型反硝化細(xì)菌的原因。本研究同時(shí)發(fā)現(xiàn)，玉米連作處理的土壤反硝化速率顯著高于其他處理，這很可能與玉米種植時(shí)高的氮肥投入量有關(guān)。已有研究均發(fā)現(xiàn)，氮肥能顯著增加土壤反硝化細(xì)菌數(shù)量，進(jìn)而促進(jìn)土壤反硝化作用[30-31]。黃國宏等[32]研究表明，土壤N2O排放隨著種植作物的不同而發(fā)生改變，種植玉米的土壤N2O排放量比種植大豆的土壤增加了103.7%。

3.2 作物茬口對nirS和nirK型反硝化細(xì)菌群落組成的影響

本研究中，通過分析nirS和nirK型反硝化細(xì)菌相對豐度與反硝化速率呈正相關(guān)的OTUs，發(fā)現(xiàn)玉米連作處理的反硝化細(xì)菌相對豐度顯著高于大豆連作處理，說明種植玉米施用的氮量可導(dǎo)致反硝化微生物數(shù)量的增加，其在加速作物對養(yǎng)分吸收利用的同時(shí)也加速了土壤反硝化速率[33-34]。有趣的是，Zou等[26]利用相同土壤樣本對不同作物茬口下土壤固氮微生物群落的研究發(fā)現(xiàn)，nifH型基因豐度在種植相同茬口的作物中，輪作處理下的基因豐度均顯著高于連作處理。然而，本研究發(fā)現(xiàn)，nirS和nirK基因豐度未呈現(xiàn)與nifH基因豐度變化一致性規(guī)律，盡管玉米-大豆輪作玉米茬的相對豐度多顯著高于連作大豆，僅玉米-大豆輪作大豆茬的OTU346 (Bradyrhizobiumsp.)和OTU261 (Bradyrhizobiumsp.)豐度高于大豆連作，說明反硝化細(xì)菌群落組成受到氮肥施用量和作物茬口的雙重制約，且氮肥施用是反硝化細(xì)菌群落分異的主導(dǎo)因素[35-37]。此外，nirS型反硝化細(xì)菌草螺菌屬 (Hydrogenophaga)在玉米茬口下豐度顯著高于大豆茬口，Gabriela等[38]研究證明氮肥施用量相比于作物茬口對草螺菌屬的影響更大。與nirK型反硝化細(xì)菌變化特征相比，nirS型反硝化細(xì)菌群落中玉米-大豆輪作大豆茬口和大豆連作處理相對豐度及大豆-玉米輪作玉米茬口和玉米連作處理相對豐度均無顯著差異。已有研究發(fā)現(xiàn)，nirS型反硝化細(xì)菌對于土壤中可利用資源的競爭能力顯著高于nirK型反硝化細(xì)菌，致使nirS型反硝化細(xì)菌的環(huán)境適應(yīng)能力更強(qiáng)且不易受到作物茬口的影響[39-40]。

3.3 土壤理化性質(zhì)和反硝化細(xì)菌群落對土壤反硝化速率的影響

基于PCoA結(jié)果顯示，玉米-大豆輪作體系處理中nirS型反硝化細(xì)菌群落差異顯著，大豆連作和玉米連作處理群落相似度較高，而nirK型反硝化細(xì)菌群落則呈現(xiàn)完全相反的趨勢，說明不同作物茬口對nirS和nirK型反硝化細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響存在分異。Teele等[41]研究表明，nirS型反硝化細(xì)菌群落偏好氧濃度較高的環(huán)境，而nirK型反硝化細(xì)菌群落對土壤氧氣水平不敏感，為此輪作導(dǎo)致的土壤氧氣含量升高是導(dǎo)致nirS型反硝化細(xì)菌在輪作處理中差異顯著，而連作處理下群落相似度高的主要原因。結(jié)合RDA分析和SEM分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，土壤全氮、土壤C/N和土壤硝態(tài)氮對nirS和nirK型反硝化群落結(jié)構(gòu)存在顯著影響，這與以往研究結(jié)果一致，即土壤氮素作為反硝化作用的底物其強(qiáng)烈影響反硝化微生物群落的結(jié)構(gòu)[42-43]。

已有研究發(fā)現(xiàn)，nirK型反硝化細(xì)菌群落對調(diào)節(jié)反硝化速率有顯著影響[44-45]。本研究SEM結(jié)構(gòu)方程分析同樣發(fā)現(xiàn)，nirS型反硝化細(xì)菌群落與反硝化速率顯著正相關(guān)，說明東北黑土中nirS型反硝化細(xì)菌群落可能對土壤反硝化作用起到更重要的作用。這一結(jié)論與Yin等[46]研究結(jié)果一致，即黑土區(qū)農(nóng)田土壤中攜帶nirK型基因的反硝化細(xì)菌與反硝化速率無顯著相關(guān)關(guān)系，而nirS型反硝化細(xì)菌是土壤反硝化作用的主要貢獻(xiàn)者。本研究發(fā)現(xiàn)，反硝化基因豐度與反硝化速率間不存在顯著相關(guān)性 (nirS:P=0.395;nirK:P=0.597)，此外，SEM分析也發(fā)現(xiàn)，nirS和nirK型基因豐度對反硝化速率變化沒有顯著影響，而反硝化細(xì)菌群落組成與反硝化速率顯著相關(guān) (圖6)。采用qPCR技術(shù)對土壤反硝化基因豐度變化研究均發(fā)現(xiàn)，土壤反硝化基因豐度與土壤反硝化速率之間不存在顯著相關(guān)性[47-49]。本研究和上述報(bào)道均證明，反硝化基因豐度僅表征了反硝化微生物的潛在生理功能，而反硝化細(xì)菌的多樣性特征和群落組成是土壤反硝化作用發(fā)生的決定因素。

4 結(jié)論

連作玉米茬口土壤中nirS和nirK型反硝化細(xì)菌的相對豐度多顯著高于連作大豆茬口，輪作玉米和大豆茬口與連作大豆茬口也存在顯著性差異，但未表現(xiàn)出一致的規(guī)律性變化特征。輪作體系中大豆茬口和玉米茬口nirS型反硝化細(xì)菌群落構(gòu)成差異顯著，而連作玉米和連作大豆在nirK型反硝化細(xì)菌群落構(gòu)成間存在顯著差異。反硝化速率與nirS型反硝化細(xì)菌群落構(gòu)成顯著正相關(guān)，與nirS和nirK型基因豐度無顯著相關(guān)性。土壤NO3--N和C/N含量是驅(qū)動(dòng)黑土中nirS型反硝化細(xì)菌群落構(gòu)成的主要因素。