香花油茶無性系苗期炭疽病調查及病菌致病力分化

廖旺姣，鐘雅婷，韋 維，鄒東霞，羅 輯

（廣西壯族自治區林業科學研究院 廣西特色經濟林培育與利用重點實驗室 廣西林業有害生物天敵繁育工程技術研究中心，廣西南寧 530002）

香花油茶（Camellia osmantha）為山茶屬短柱茶組新物種，具有早熟、果量多、出籽率高和抗逆性強等特點，樹型美觀，花帶香氣，具有獨特的表型性狀[1]。2012年，在廣西南寧發現該物種，之后逐步在廣西推廣種植。目前，香花油茶的研究主要集中在苗木快速繁育[2-4]、種質資源評價[5]、栽培[6]、生理[7-8]及葉片和果殼的綜合利用[9-11]等方面，針對病蟲害的報道較少。已報道的香花油茶苗期炭疽病病菌為Col?letotrichum fructicola[12]。單一作物連片種植易引發病害流行[13]。炭疽病是危害香花油茶葉片的主要病害之一，尤其是在苗期；苗期植株間距小，苗圃濕度大，通風透氣性差。炭疽病病菌存在明顯的致病力分化現象[14-15]，同一地區不同炭疽病菌株的致病力存在一定差異，不同地區同一炭疽病菌株的致病力也存在一定差異[16]。油茶炭疽病病菌也存在類似現象。李揚等[17]研究顯示，炭疽病原Colletotrichum ca?melliae對湘林1 號、湘林69 號和湘林89 號等12 個油茶（Camellia oleifera）品系葉片的致病力存在差異。不同香花油茶無性系炭疽病病菌的致病力還未見報道。本研究以27個香花油茶無性系為材料，采用平行線取樣法，對其苗期的炭疽病進行調查與統計，采用形態特征和分子系統學分析法，對各無性系的炭疽病病菌進行鑒定，并采用離體葉片接種法對所獲菌株進行致病性及致病力測定，明確各菌株的致病力等級，以期為香花油茶抗病育種及炭疽病防治提供更為科學和可靠的依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試的27 株感病香花油茶無性系苗木均由廣西壯族自治區林業科學研究院油茶所提供，定植于苗圃；炭疽病樣品采集于感病葉片。

1.2 炭疽病調查與分級

1.2.1 炭疽病調查

2019—2021年的每年7月，采用平行線取樣法調查27個香花油茶無性系的炭疽病發生情況，每個無性系調查30 株；從苗木東、南、西、北和中5 個方向頂端展開的葉片開始，向下隨機調查5張葉片，每株記錄25 張葉片的發病情況。根據炭疽病分級標準對調查葉片進行分級，計算發病率和病情指數[18]。

1.2.2 炭疽病分級標準

參考彭邵峰等[19]的方法，略作修改，制定香花油茶苗期炭疽病病害分級標準。0級：無病斑；1級：病斑面積占葉面積1/4 以下；2 級：病斑面積占葉面積1/4 ≤～ 1/2；3 級：病斑面積占葉面積1/2 ≤～ 3/4；4級：病斑面積占葉面積3/4以上。

1.3 病菌鑒定

根據苗期葉片炭疽病發病癥狀，采集典型病害樣品進行組織分離，統計不同無性系炭疽病病菌分離頻率；依據柯赫氏法則，測定炭疽病病菌致病性；參考相關資料，對致病病菌進行形態特征鑒定，確定致病病菌的種類[20-21]。

進行病菌基因序列測定及多基因序列分析。參考植物基因組試劑盒說明，提取病菌基因組DNA，參考廣西普通油茶炭疽病病菌序列測定方法[22]，測定病菌的核糖體轉錄間隔區（ITS）、肌動蛋白（ACT）、幾丁質合成酶（CHS1）和3-磷酸甘油醛脫氫酶（GPDH）基因序列，構建系統發育進化樹，確定病菌分類地位。

1.4 菌株致病性及致病力分化測定

1.4.1 接種體準備

將27個無性系炭疽病菌株接種至新的PDA（馬鈴薯200 g、葡萄糖20.00 g、瓊脂粉20.00 g和水1 000 mL）平板培養基上，28 ℃暗培養，產生分生孢子后，挑取分生孢子液，用滅菌水配置成6.00 ×106個孢子/mL的分生孢子液。

1.4.2 致病性測定

采用傷口接種法測定致病性。采集27 個無性系健康成熟葉片帶回實驗室，清水沖洗干凈，用75%酒精進行表面消毒，再用滅菌水沖洗3次；用濾紙吸干表面水分后，將葉片放入鋪有濾紙的28 cm×20 cm × 3 cm 透明塑料盒中（葉片背面朝上），葉片基部用脫脂棉蘸無菌水保濕，每個塑料盒中擺放10張葉片。用滅菌接種針在近葉尖處和對角線近葉基處，分別創造1 個3 mm×3 mm 傷口，分別接種菌餅和20 μL 分生孢子液至傷口上，以接種滅菌水為對照；各處理及對照均接種10張葉片。接種后蓋上盒蓋，置于28 ℃室溫生化培養箱中，8 h/16 h 光暗交替培養，10天后計算發病率，并測量病斑大小[18]。

1.4.3 致病力分化測定

采用傷口接種法進行致病力分化測定。采集香花油茶1 號無性系健康成熟葉片，葉片處理和接種方法與1.3.2 相同；27 個炭疽病菌株各接種20 張葉片，對照接種10 張葉片，培養條件與1.3.2 相同。參考杧果（Mangifera indica）炭疽病病情指數分級標準[23]，結合試驗，制定香花油茶炭疽病病情指數分級標準。0 級：無病斑；1 級：病斑直徑≤3.00 mm；3級：3.00<病斑直徑≤9.00 mm；5 級：9.00<病斑直徑≤15.00 mm；7級：15.00<病斑直徑≤25.00 mm；9級：病斑直徑>25.00 mm。菌株致病類型劃分標準參考咖啡（Coffea arabica）炭疽病病菌致病力劃分標準[24]。強致病力類型的病情指數為40<～100；中致病力類型的病情指數為20<～40；弱致病類型的病情指數為0<～20；無致病類型的病情指數為0。

1.5 數據處理

采用Excel 2010 和DPS 13.01 軟件整理和分析數據；采用Duncan's新復極差法進行差異性分析。

2 結果與分析

2.1 炭疽病發病癥狀

炭疽病主要危害香花油茶的葉片和嫩芽。多從葉尖或葉緣開始感病；感病初期，葉片上出現褐色小圓點，之后逐漸擴大；葉尖感病葉片的病斑由葉尖向葉基呈“V”字形擴展，枯死面積逐漸增加；感病嫩葉上的病斑呈向葉片背面或向上卷曲狀態（圖1）。嫩芽感病后，呈褐色枯死狀，向嫩枝方向逐漸枯死。

圖1 部分香花油茶無性系炭疽病危害癥狀Fig.1 Damage symptoms of anthracnose in some C.osmantha clones

2.2 不同年份炭疽病發生情況

2019 — 2021年，各無性系炭疽病的發病率和病情指數均逐漸升高；平均發病率分別為9.50%、16.02%和18.84%；平均病情指數分別為3.47、6.96和8.97（表1）。2019年，發病率為3.12% ～ 18.04%；其中，21號無性系發病率最低，1號無性系發病率最高。2020年，發病率為9.67%～25.33%；其中，24 號無性系發病率最低，1 號無性系發病率最高。2021年，發病率為12.67% ～ 27.50%；其中，24 號無性系發病率最低，1 和8 號無性系發病率最高。2019年，病情指數為0.90～8.42；其中，21號無性系病情指數最低，4號無性系病情指數最高。2020年，病情指數為4.58 ～ 10.92；其中，14 號無性系病情指數最低，8號無性系病情指數最高。2021年，病情指數為6.21～12.75；其中，24 號無性系病情指數最低，8 號無性系病情指數最高。

表1 不同年份香花油茶無性系炭疽病調查結果Tab.1 Investigation results of anthracnose of C.osmantha clones in different years

續表1 Continued

2019 — 2021年，各無性系炭疽病的發病率增長率和病情指數增長率均呈降低趨勢，均表現為2019 — 2020年較高，2020 — 2021年較低（表2）。2019 — 2020年，發病率增長率為14.06% ～73.26%，平均增長率為43.12%；其中，18號無性系增長率最低，21號無性系最高。2020—2021年，發病率增長率為7.89% ～ 25.92%，平均增長率為15.93%；其中，1 號無性系增長率最低，23 號無性系最高。2019—2020年，病情指數增長率為14.77%～82.85%，平均增長率為52.75%；其中，4 號無性系增長率最低，21號無性系最高。2020—2021年，病情指數增長率為11.37% ～ 34.94%，平均增長率為21.23%；其中，2 號無性系增長率最低，14 號無性系最高。

表2 不同年份香花油茶無性系炭疽病發病率及病情指數變化情況Tab.2 Changes of disease incidences and disease indexes of anthracnose of C.osmantha clones in different years(%)

續表2 Continued

2.3 不同無性系炭疽病病菌分離頻率

2019 — 2021年，各無性系炭疽病病菌的分離頻率均逐漸升高，平均分離頻率分別為34.22%、40.74% 和58.81%（表3）。2019年，分離頻率為12% ～ 64%；分離頻率大于50%的無性系有4 個，分別為1、7、17和22號無性系；分離頻率為30%～50%的無性系有10 個，分別為5、6、8、11、12、14、16、20、21 和27 號無性系；其他無性系的分離頻率均低于30%。2020年，分離頻率為20%～68%；除2和26號無性系與2019年相同外，其他無性系的分離頻率均增加；分離頻率低于30%的無性系有4 個，分別為2 、9、18 和26 號；分離頻率大于50%的無性系有5個，分別為1、7、17、21和22號無性系；其他無性系的分離頻率均為30% ～ 50%。2021年，分離頻率為28%～92%；除8 號無性系與2020年相同外，其他無性系的分離頻率均增加；分離頻率低于30%的無性系僅1 個（26 號無性系）；分離頻率為30% ～ 50%的無性系有5 個，分別為2、8、9、10 和18 號無性系；其他無性系的分離頻率均大于50%。

表3 不同年份香花油茶無性系炭疽病病菌分離頻率Tab.3 Isolation frequencies of anthracnose bacteria of C.osmantha clones in different years(%)

2.4 炭疽病病菌鑒定

從27 個無性系獲得的炭疽病菌株培養形狀相似，代表菌株YJ1506②、CZ1608①和CZ1611①在PDA 平板培養基上的菌絲呈灰白色至深灰色，先端菌絲色淺，菌落中心色深；氣生菌絲茂盛，菌落呈圓形，邊緣完整（圖2 a～c）。培養后期，菌落中心產生橘紅色分生孢子堆，背面產生黑色色素。菌株在PDA培養基上生長較快，25 ℃培養7天，平均菌落直徑為82.16 ～ 86.30 mm，平均生長速率為11.74 ～12.33 mm/d。分生孢子單孢，無色，光滑，圓柱狀，頂端鈍圓或略尖，基部平截，多數具有1 個油球，少數具有2 個油球，大小為（13.99 ～ 16.99）μm ×（4.93 ～5.67）μm（圖2 d～f）。分生孢子附著胞呈淺褐色至褐色，圓形或近圓形，邊緣完整，少數呈不規則形狀，單個或多個，大小為（6.50～10.69）μm×（5.17～9.50）μm（圖2 g～h）。菌株形態特征與核果炭疽菌（C.fructicola）一致[12，25]。

圖2 部分香花油茶無性系炭疽病病菌形態特征Fig.2 Morphological characteristics of anthracnose bacteria in some C.osmantha clones

通過多基因序列分析，獲得代表菌株YJ1506②、CZ1608①和CZ1611①的ITS、ACT、CHS1 和GPDH序列，在GenBank 上進行BLAST 同源性比對，代表菌株與目標菌株同源性高達99%～100%，下載其他炭疽病病菌序列，用Mega 6.0 的鄰接法構建多基因系統發育進化樹（圖3）。結果顯示，YJ1506②、CZ1608 ①和CZ1611 ①菌株與C.fructicola（菌株CSSX7、CMTJ18 和BL30）聚在同一分支上，與其它炭疽病病菌形成獨立分支，支持率為99%，結合形態學特征，確定YJ1506②、CZ1608①和CZ1611①病菌為C.fructicola。

圖3 系統發育進化樹Fig.3 Phylogenetic tree

2.5 致病性測定結果

從27 個無性系感病葉片上共分離出374 株炭疽病病菌，每個無性系分離獲得的菌株為7～23株，每個無性系挑選1個代表菌株進行致病性測定。接種3天后，接種點呈褐色至黑褐色，隨時間推移病斑逐漸擴展；接種10天后，接種葉片均發病，病斑大小有差異，平均直徑為4.00～11.96 mm（表4，圖4）。病斑直徑最大的為從6號無性系獲得的菌株YJ1506②（11.96 mm），與其他菌株差異顯著（P< 0.05）；其次為從12 號無性系獲得的菌株YJ1614 ①（7.57 mm）；病斑直徑最小的為14號無性系獲得的菌株YJ1617①（4.00 mm）。對照的接種點變褐色，但未擴展。對感病葉片進行再次分離，獲得的菌株與接種菌株形態特征一致；對對照葉片進行再次分離，未獲得任何菌株。確定接種的27 個炭疽病菌株均為香花油茶無性系炭疽病致病菌株。

圖4 部分香花油茶無性系致病性測定感病癥狀Fig.4 Susceptible symptoms of some C.osmantha clones in virulence determination

表4 不同香花油茶無性系炭疽病菌株致病性測定結果Tab.4 Determination results of virulence of anthracnose strains from different C.osmantha clones

2.6 炭疽病病菌致病力分化

不同無性系中獲得的炭疽病菌株致病力差異顯著（P< 0.05）（表5）。從6 號無性系獲得的YJ1506②菌株病斑直徑最大（12.75 mm），與從其他無性系獲得的菌株差異顯著（P< 0.05）；其次為從12 號無性系獲得的YJ1614①菌株（9.70 mm）；從14號無性系獲得的YJ1617①菌株病斑直徑最小（3.60 mm）。YJ1506②菌株病情指數最高（51.11），其次為YJ1614①菌株（42.22），病情指數最低的為從4 號無性系獲得的YJ1504②菌株（26.66）。依據菌株致病類型劃分標準，27 個炭疽病菌株中，YJ1506②和YJ1614 ①菌株為強致病力菌株，占供試菌株的7.41%；其他25個菌株為中等致病菌株，占供試菌株的92.59%；說明香花油茶苗期炭疽病病菌C.fructic?ola以中等致病力菌株為優勢群體。

表5 不同香花油茶無性系炭疽病病菌致病力分析Tab.5 Analysis on pathogenicity of anthracnose bacteria from different C.osmantha clones

3 討論與結論

本研究調查2019 — 2021年27 個香花油茶無性系苗期炭疽病發生情況。結果顯示，不同無性系發病率、病情指數和炭疽病菌分離頻率略有差異，且整體呈上升趨勢，可能與香花油茶無性系不同來源、寄主抗病性和病原菌積累有關。

本研究通過病原菌形態特征鑒定，并結合現代分子生物學，分析病原菌核糖體ITS、ACT、CHS1 和GPDH 多基因分子系統發育樹，確定從香花油茶無性系苗期獲得的炭疽病病菌為C.fructicola，與2016年報道的香花油茶苗期炭疽病病菌相同[12]，但與報道的普通油茶炭疽病病菌膠孢炭疽菌（C.gloeospori?oides）[22]、山茶炭疽菌（C.camelliae）不同[26]，可能與寄主不同有關。

從27 個香花油茶無性系中獲得的炭疽病菌株培養性狀相同或相似，為同一類型炭疽病病菌，菌落淺灰色至深灰色，邊緣色淺，菌落中央色深，與楊友聯等[25]報道的棉花（Gossypium hirsutum）炭疽病病原之一的C.fructicola及李河等[21]報道的湖南油茶炭疽病病原之一的C.fructicola菌落形態相同；菌落背面產生黑色色素，與李河等[21]報道相同，與楊友聯等[25]報道的C.fructicola菌落背面微黃色不同，可能與菌株不同寄主來源有關，與劉文魁[27]報道的不同寄主上的C.fructicola在地理和生物學方面存在較大差異的研究結果相符。

不同香花油茶無性系獲得的炭疽病菌株C.fructicola均有致病性，但致病力存在差異，與劉文魁[27]報道的C.fructicola不同菌株致病力存在明顯差異的結論相符。本研究結果表明，27 個香花油茶無性系來源的C.fructicola致病力分化明顯，其中2 個菌株為強致病力菌株，其他25個菌株為中等致病力菌株，以中等致病力菌株為優勢群體，與王薇等[28]報道的蘋果（Malus pumila）炭疽葉枯病菌C.fructicola種內存在致病力明顯分化現象和彭宇鴻等[29]報道的導致南方梨（Pyrusspp.）早期落葉的的果生炭疽菌C.fructicola致病力有明顯分化的結果相似。少數強致病力菌株可作為香花油茶無性系抗病選育、病原物與寄主互作等研究的菌種資源，研究結果對進一步研究該病菌群體間致病力的變化動態及香花油茶抗性無性系篩選和綜合防治有重要意義。