茵梔黃口服液對(duì)溶血性黃疸小鼠模型的退黃作用及有效劑量和安全性研究

鄧 惠 李貴平

新生兒黃疸主要表現(xiàn)為目黃、身黃、尿黃，是新生兒常見(jiàn)疾病之一，其發(fā)病主要與濕熱邪蘊(yùn)有關(guān)，新生兒肺、脾、腎常不足，三焦水道運(yùn)化水濕不利，濕與熱結(jié)，濕熱熏蒸肝膽，膽汁外溢肌膚，故全身肌膚黃染；且濕困脾胃，脾胃不能運(yùn)化水濕，加重濕熱內(nèi)困，惡性循環(huán)，加重黃染程度[1]。新生兒黃疸是新生兒住院的首要原因[2]，嚴(yán)重時(shí)可引起核黃疸，導(dǎo)致聽(tīng)力和神經(jīng)系統(tǒng)等不可逆損傷。目前臨床治療主要有藍(lán)光照射、換血療法、藥物治療，但均不良作用明顯，費(fèi)用較高[3,4]。傳統(tǒng)中醫(yī)常用經(jīng)典名方茵陳蒿湯加減治療，結(jié)合新生兒脾胃虛弱特點(diǎn)，茵梔黃口服液采用黃芩、金銀花代替茵陳蒿湯中大黃成分，降低方劑的瀉下力量，在臨床上使用較廣泛，取得了一定的療效[5,6]，減少新生兒黃疸住院率和住院時(shí)間，其具有經(jīng)濟(jì)、方便、安全的優(yōu)點(diǎn)，但是因新生兒個(gè)體差異，臨床上部分患兒出現(xiàn)腹瀉、吐奶、腹脹等不良反應(yīng)，尤其是溶血性黃疸，有效及安全劑量難以掌握。因此本研究通過(guò)對(duì)比生理鹽水和不同劑量茵梔黃口服液灌胃溶血性黃疸小鼠后，肝功能各項(xiàng)指標(biāo)、肝組織病理改變，探討茵梔黃口服液的有效劑量及安全性，以期為臨床使用茵梔黃口服液治療新生兒黃疸提供理論依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物健康的昆明小鼠，雌雄各半，體質(zhì)量17～23 g，共40只，由西南醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)為SCXK(川)2018—17，于西南醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心適應(yīng)性飼養(yǎng)，保持室內(nèi)相對(duì)溫度19～21 ℃，相對(duì)濕度為50%～70%?；\底放置清潔的動(dòng)物飼養(yǎng)墊料，使用維持飼料喂養(yǎng)，飼料旁放置一個(gè)小鼠專(zhuān)用水瓶(內(nèi)儲(chǔ)自來(lái)水)，每日定時(shí)添加飼料、更換墊料及飲用水。本實(shí)驗(yàn)所采用飼料、墊料統(tǒng)一由西南醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心采購(gòu)。實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格遵守動(dòng)物管理規(guī)則和使用原則。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物茵梔黃口服液(北京華潤(rùn)高科天然藥物有限公司，批號(hào)：Z11020607)，乙酰苯肼(APH，上海麥克林生化科技有限公司提供)。

2 方法

2.1 造模依據(jù)文獻(xiàn)制作溶血性黃疸小鼠模型[7，8]，先對(duì)40只雌雄各半的小鼠進(jìn)行適應(yīng)性喂養(yǎng)5 d后，按雌雄各半比例，將小鼠隨機(jī)分為造模組32只、正常組8只。將APH溶于生理鹽水，按60 mg/(kg·d)的劑量對(duì)造模組小鼠進(jìn)行腹腔注射，正常組小鼠腹腔注射20 ml/(kg·d)生理鹽水，連續(xù)注射3 d后，與正常組對(duì)比，造模組小鼠煩躁，皮毛失去光澤，耳朵等處皮膚變黃，尿液、大便黃，造模成功。

2.2 分組及給藥注射APH 3 d后，將造模成功的32只昆明小鼠隨機(jī)分成4組，每組8只，分別為茵梔黃口服液低、中、高劑量組和模型組。低、中、高劑量組分別灌胃5 ml/(kg·d)、10 ml/(kg·d)、20 ml/(kg·d)茵梔黃口服液(低、中劑量組分別于灌胃藥物中分別加入15 ml/(kg·d)、10 ml/(kg·d)生理鹽水，使3組灌胃總液體量均為20 ml/(kg·d))，模型組、正常組灌胃20 ml/(kg·d)生理鹽水，每天1次，連續(xù)灌胃3 d。

2.3 檢測(cè)血清肝功能各組昆明小鼠灌胃3 d后，眼球取血1.5 ml，送西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院檢驗(yàn)科檢驗(yàn)，檢測(cè)血清總膽紅素(TBIL)、直接膽紅素(DBIL)、間接膽紅素(IBIL)、天門(mén)冬氨酸氨基酸轉(zhuǎn)移酶(AST)、丙氨酸氨基酸轉(zhuǎn)移酶(ALT)、堿性磷酸酶(ALP)、總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)和球蛋白(GLB)。

2.4 肝臟病理切片觀察將取眼球血的小鼠立即處死，摘取肝臟，取肝臟組織于甲醛中固定，再經(jīng)脫水、透明后，浸蠟包埋、切片，進(jìn)行HE染色，于光學(xué)顯微鏡下觀察肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)是否正常。

3 結(jié)果

3.1 各組昆明小鼠一般情況比較低、中、高劑量組和模型組小鼠造模后，與正常組小鼠比較，反應(yīng)遲鈍，進(jìn)食減少，活動(dòng)減少，個(gè)別小鼠出現(xiàn)俯伏、抽動(dòng)、易激惹、聚堆，小鼠皮毛失去光澤，耳朵皮膚蒼黃，尿液黃，大便黃，表明造模成功。低、中、高劑量組小鼠灌胃茵梔黃口服液后反應(yīng)、進(jìn)食、活動(dòng)、皮毛光澤、耳朵皮膚蒼黃、二便黃、俯伏、抽動(dòng)、易激惹、聚堆情況均有不同程度改善。

3.2 昆明小鼠生化指標(biāo)

3.2.1 昆明小鼠膽紅素指標(biāo)比較與正常組比較，模型組的TBIL、DBIL、IBIL均明顯升高，且P<0.05，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。低、中、高劑量組與模型組比較，TBIL均降低，其中低劑量組與模型組比較，P>0.05，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明低劑量茵梔黃口服液對(duì)降低TBIL無(wú)效；中、高劑量組與模型組比較，P<0.05，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明中、高劑量的茵梔黃口服液對(duì)降低TBIL有效；而中、高劑量組比較，P>0.05，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明中、高劑量的茵梔黃口服液降低TBIL的效果不明顯；低、中、高劑量組的DBIL與模型組比較，P>0.05，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明茵梔黃口服液對(duì)降低DBIL無(wú)明顯效果。與模型組比較，低、中、高劑量組的IBIL均明顯下降，且P<0.05，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明茵梔黃口服液能明顯降低IBIL；其中低、中、高劑量組的DBIL兩兩比較，P>0.05，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明低、中、高3種劑量的茵梔黃口服液對(duì)降低IBIL的效果差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)表1。

3.2.2 昆明小鼠肝功能指標(biāo)比較正常組、模型組、低劑量組、中劑量組、高劑量組的TP、AST、ALT的值，各組之間兩兩比較，均P>0.05，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明造模前后TP、AST、ALT無(wú)明顯變化，且茵梔黃口服液對(duì)TP、AST、ALT無(wú)明顯影響。與正常組比較，模型組ALP、ALB降低，GLB、A/G均升高，且P<0.05，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明造模后ALP、ALB明顯降低，GLB、A/G明顯升高；模型組、低劑量組、中劑量組、高劑量組的ALP、ALB、GLB、A/G的值，各組間兩兩比較，均P>0.05，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明茵梔黃口服液對(duì)ALP、ALB、GLB、A/G無(wú)明顯影響，說(shuō)明茵梔黃口服液對(duì)肝功能無(wú)明顯影響。見(jiàn)表2。

表1 各組小鼠血清中膽紅素濃度比較

3.3 昆明小鼠肝組織病理改變比較圖片A中正常組小鼠肝組織排列緊密整齊，細(xì)胞核完整，且大而圓，無(wú)明顯肝細(xì)胞破壞，未見(jiàn)明顯炎癥細(xì)胞。與正常組比較，圖片B中造模組肝組織排列疏松，肝組織結(jié)構(gòu)破壞，有明顯肝細(xì)胞壞死灶，空泡樣變性，炎細(xì)胞浸潤(rùn)，表明造模后小鼠出現(xiàn)肝組織損傷。與圖片B中模型組比較，圖片C、D、E中的低、中、高劑量組，肝組織結(jié)構(gòu)排列疏松程度均有所減輕，肝細(xì)胞壞死灶減少，空泡樣變性減少，有炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；圖片C、D中低、中劑量組比較肝臟病理切片差異不明顯；與圖片C、D中低、中劑量組比較，圖片E中高劑量組肝組織結(jié)構(gòu)排列更疏松，肝組織結(jié)構(gòu)破壞相對(duì)較多，空泡樣變性相對(duì)增多，表明茵梔黃口服液對(duì)肝臟組織病理性改變具有一定改善作用，但劑量過(guò)大時(shí)，對(duì)肝組織病理?yè)p傷的改善作用降低。見(jiàn)圖1。

表2 各組小鼠肝功能比較 (只，

注：A正常組；B模型組；C低劑量組；D中劑量組；E高劑量組。圖1 小鼠肝臟病理切片比較

4 討論

新生兒黃疸，又名新生兒高膽紅素血癥，其主要表現(xiàn)為膽紅素過(guò)高出現(xiàn)皮膚黃染、小便黃，原因主要包括膽紅素生成過(guò)多，血漿白蛋白聯(lián)結(jié)膽紅素的能力不足，肝細(xì)胞處理膽紅素能力差，腸肝循環(huán)致重吸收增加[1]。膽紅素代謝途徑：紅細(xì)胞衰老分解生成脂溶性的間接膽紅素，間接膽紅素與血漿白蛋白結(jié)合后，進(jìn)入肝細(xì)胞中解離后與Y、Z蛋白結(jié)合，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)經(jīng)葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶(UDPGT)催化變?yōu)樗苄缘闹苯幽懠t素經(jīng)腸道、腎臟排出體外[9]。

APH破壞紅細(xì)胞，造成小鼠血虛，血虛不能榮養(yǎng)肌膚皮毛[10]，故皮毛失去光澤；血虛不能化神，故反應(yīng)遲鈍、進(jìn)食減少、活動(dòng)減少；氣隨血脫，陽(yáng)氣不足，不能溫煦全身，故個(gè)別小鼠出現(xiàn)俯伏、聚堆等異常行為?！督饏T要略》中記載“黃家所得，從濕得之”說(shuō)明黃疸與濕邪密切相關(guān)[11]，濕熱熏蒸肝膽，膽汁外溢肌膚而耳朵皮膚黃染，下注膀胱而小便黃，行大腸而大便黃。茵梔黃口服液由茵陳、梔子、黃芩、金銀花組成，茵陳、梔子、黃芩均具有清利濕熱作用，其中茵陳利膽退黃，乃治黃疸要藥，佐以金銀花清熱解毒。本實(shí)驗(yàn)中，低、中、高劑量組與模型組小鼠比較，耳朵皮膚蒼黃、小便黃均有不同程度消退，抽動(dòng)、易激惹情況亦均有改善，茵梔黃口服液從濕邪病因入手，并清熱以標(biāo)本兼治，改善溶血性黃疸小鼠癥狀。

APH主要通過(guò)破壞紅細(xì)胞，使膽紅素生成過(guò)多，導(dǎo)致溶血性黃疸[10]。本實(shí)驗(yàn)中，造模組小鼠與正常組比較，TBIL、DBIL、IBIL均升高，ALP、ALB均降低，可能是因紅細(xì)胞破壞過(guò)多導(dǎo)致貧血，貧血可誘發(fā)ALP降低。溶血致TBIL生成過(guò)多，其中主要以IBIL升高為主，造成小鼠耳朵皮膚蒼黃。IBIL與ALB結(jié)合，消耗導(dǎo)致ALB降低，生成大量DBIL，經(jīng)由小便、大便排出，導(dǎo)致小便、大便黃染。膽紅素過(guò)高，透過(guò)血腦屏障，影響神經(jīng)系統(tǒng)，小鼠出現(xiàn)抽動(dòng)、易激惹等異常。本實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ徒M肝臟病理切片提示肝組織損傷，炎癥浸潤(rùn)，而當(dāng)機(jī)體發(fā)生炎癥反應(yīng)時(shí)，可使免疫球蛋白升高，GLB、A/G升高可能與其有關(guān)，造模后小鼠可能出現(xiàn)肝炎。中、高劑量組TBIL降低可能與茵梔黃口服液中茵陳、梔子、黃芩、金銀花均具有保肝利膽作用相關(guān)[12-15]；而低劑量茵梔黃口服液不能降低TBIL，說(shuō)明低劑量組的劑量低于茵梔黃口服液的有效劑量，中、高劑量組的劑量在有效范圍內(nèi)，而中、高劑量組間TBIL差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明茵梔黃口服液的退黃作用強(qiáng)弱可能與劑量無(wú)明顯關(guān)系，但具體有效劑量范圍還需進(jìn)一步研究證明。茵陳能通過(guò)增加UDPCT活性，增強(qiáng)肝臟處理膽紅素能力[16]，低、中、高劑量茵梔黃口服液均能降低IBIL可能與其有關(guān)。DBIL主要通過(guò)二便排出體外，而茵梔黃口服液為茵陳蒿湯減去大黃，增加黃芩、金銀花變化所得方劑，大黃對(duì)大腸、小腸運(yùn)動(dòng)均具有增強(qiáng)作用[17]，故而茵梔黃口服液排泄二便能力相對(duì)減弱，本實(shí)驗(yàn)低、中、高劑量組DBIL與模型組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可能與其相關(guān)。TP、ALP、AST、ALT、ALB、GLB、A/G均為衡量肝功能損傷的指標(biāo)，其中ALB能與IBIL結(jié)合形成DBIL排出體外，降低膽紅素，而本實(shí)驗(yàn)低、中、高劑量組TP、ALP、AST、ALT、ALB、GLB、A/G與模型組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明茵梔黃口服液可能對(duì)肝功能無(wú)明顯影響，且其退黃作用可能與白蛋白無(wú)關(guān)，茵梔黃口服液具體退黃機(jī)制有待進(jìn)一步研究。低、中、高劑量組的肝臟病理切片與模型組比較，肝組織疏松、壞死灶、空泡樣變性、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)均有不同程度減輕，茵梔黃口服液能減輕肝臟病理?yè)p害，其可能與茵梔黃口服液中茵陳、梔子能減少肝臟MDA生成以減輕肝細(xì)胞損害及黃芩能抑制自由基對(duì)肝細(xì)胞的毒性有關(guān)[18-20]；中劑量與低劑量比較改善差異不明顯，低、中劑量比高劑量肝組織損傷改善更明顯，說(shuō)明高劑量茵梔黃口服液可能對(duì)肝組織病理?yè)p傷的改善作用降低，也可能高劑量茵梔黃口服液對(duì)肝組織具有一定損害作用，具體作用機(jī)制有待學(xué)者進(jìn)一步研究。

本實(shí)驗(yàn)由于客觀因素限制，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)有待進(jìn)一步完善，實(shí)驗(yàn)條件、技術(shù)、樣本量等因素具有一定局限性，有待學(xué)者進(jìn)一步深入研究。