HPLC-ELSD法測(cè)定生化丸中4種糖含量*

孔鑫磊，黃紅英，逯艷艷

（1.青海省中醫(yī)院，青海 西寧 810016；2.青海省人民醫(yī)院，青海 西寧 810000）

生化丸由當(dāng)歸、川芎、桃仁、干姜炭和甘草5味中藥組成，用于產(chǎn)后受寒惡露不行或行而不暢，夾有血塊，小腹冷痛。正常產(chǎn)產(chǎn)婦及剖宮產(chǎn)產(chǎn)婦產(chǎn)后服用小劑量生化丸可促進(jìn)子宮復(fù)原[1-3]。生化丸（大蜜丸）以蜂蜜為黏合劑，約占總量50%，因此蜂蜜的質(zhì)量對(duì)藥物的療效有重要作用[4-5]。蜂蜜的基本組成是以葡萄糖和果糖為主的各種糖類，國(guó)家蜂蜜標(biāo)準(zhǔn)（GB 14963—2011）規(guī)定蜂蜜中果糖和葡萄糖含量（總量）不少于60 g/100 g，但由于蜂蜜產(chǎn)量有限，市場(chǎng)需求卻日益龐大，導(dǎo)致近幾年來蜂蜜價(jià)格一路攀升，市場(chǎng)較為混亂，摻偽情況時(shí)有發(fā)生，主要替代品有麥芽糖漿、轉(zhuǎn)化糖漿、果葡糖漿等[6-9]。為考察生化丸整體質(zhì)量，檢測(cè)蜂蜜原料在生化丸中的使用情況，筆者建立HPLC-ELSD法測(cè)定果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖在生化丸中的含量，以期為生化丸輔料中蜂蜜質(zhì)量情況提供依據(jù)[10-11]。

1 儀器與材料

1.1 主要儀器BSA224S-CW型萬分之一電子天平（德國(guó)Sartrious公司）；CP225D型十萬分之一電子天平（賽多利斯公司）；Agilent 1260高效液相色譜儀（配備ELSD檢測(cè)器）（美國(guó)安捷倫科技有限公司）；Prevail Carbohydrate ES 5u色譜柱（Grace品牌，型號(hào)：5126533.s2546）；PWUV超純水系統(tǒng)（香港力康發(fā)展有限公司）。

1.2 材料果糖對(duì)照品（批號(hào)：100231-201606）、D-無水葡萄糖對(duì)照品（批號(hào)：110833-201506）、蔗糖對(duì)照品（批號(hào)：11507-201303）均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；麥芽糖對(duì)照品（批號(hào)：150225）購(gòu)自北京世紀(jì)奧科生物技術(shù)有限公司；煉蜜由青海省中醫(yī)院制劑中心提供；當(dāng)歸（市售，批號(hào)：20211704）、川芎（市售，批號(hào)：20081703）、甘草（市售，批號(hào)：20121702）、干姜炭（市售，批號(hào)：20121703）、桃仁（市售，批號(hào)：20171706）均購(gòu)自安徽亳州康美中藥城，經(jīng)青海省中醫(yī)院藥劑科黃紅英主任藥師鑒定，符合2015年版《中華人民共和國(guó)藥典》一部標(biāo)準(zhǔn)要求；乙腈為色譜純（德國(guó)默克公司）；其他試劑均為分析純，購(gòu)自西隴化工；水為超純水為PWUV超純水系統(tǒng)制備。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件Prevail Carbohydrate ES 5u色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈-水（77∶23）；流速：1.0 mL/min；檢測(cè)器：蒸發(fā)光檢測(cè)器（ELSD）；漂移管溫度：75℃；柱溫：25℃；進(jìn)樣量：5 μL；記錄時(shí)間：25 min，各峰分離度〉1.5，理論板數(shù)按果糖色譜峰計(jì)算大于3 000。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取果糖對(duì)照品0.021 21 g，D-無水葡萄糖對(duì)照品0.021 97 g，置10 mL量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得（每1 mL含果糖2.114 mg，葡萄糖2.194 mg）；精密稱取蔗糖對(duì)照品0.010 53 g，麥芽糖對(duì)照品0.010 30 g，置10 mL量瓶中，加純化水溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得（每1 mL含蔗糖1.050 mg，葡萄糖1.029 mg）。

2.2.2 供試品溶液的制備 取本品適量，剪碎，取約2 g，精密稱定，精密加水50 mL，稱定質(zhì)量，振搖溶散，超聲30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用水補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，過濾，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 陰性及陽性溶液的制備 模擬制劑陽性溶液：取模擬制劑適量，剪碎，取約2 g，精密稱定，精密加水50 mL，稱定質(zhì)量，振搖溶散，超聲30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用水補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，過濾，取續(xù)濾液，即得。

蜂蜜陰性溶液：取蜂蜜陰性制劑約2 g，精密稱定，精密加水50 mL，稱定質(zhì)量，振搖溶散，超聲30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用水補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，過濾，取續(xù)濾液，即得。

2.2.4 各藥材、煉蜜溶液的制備 生化丸溶液：取生化丸處方中各味藥材細(xì)粉約1 g，精密稱定，精密加水50 mL，稱定質(zhì)量，超聲30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用水補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，過濾，取續(xù)濾液，即得。

煉蜜溶液：取煉蜜約1 g，精密稱定，精密加水100 mL，稱定質(zhì)量，振搖溶散，超聲30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用水補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，過濾，取續(xù)濾液，即得。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)按“2.1”色譜條件，分別精密吸取對(duì)照品溶液、供試品溶液、模擬制劑陽性溶液、蜂蜜陰性溶液、生化丸溶液等各5 μL，注入高效液相色譜儀，測(cè)定，對(duì)照品色譜、供試品和缺蜂蜜陰性對(duì)照品色譜圖見圖1。蜂蜜陰性溶液上述條件下顯示與蔗糖相同保留時(shí)間相同的色譜峰，對(duì)生化丸方中各味藥材進(jìn)行4種糖含量的測(cè)定，發(fā)現(xiàn)其中當(dāng)歸（每1 g含蔗糖762.30 mg）、川芎（每1 g含蔗糖95.07 mg）、甘草（每1 g含蔗糖189.31 mg）中蔗糖含量較大，桃仁中也含少量蔗糖，表明此方法不適合判斷生化丸中蔗糖的含量，其他三組分陰性無干擾。

圖1 果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖HPLC色譜圖

2.4 線性關(guān)系考察分別精密吸取果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖混合對(duì)照品溶液（質(zhì)量濃度分別為2.114、2.194、1.050、1.029 mg/mL）1、2、5、10、12、15、20 μL，注入液相色譜儀，測(cè)定峰面積。以峰面積為縱坐標(biāo)，4種糖對(duì)照品進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。果糖、葡萄糖、蔗糖及麥芽糖分別在1.653～76.259、3.398～152.470、1.927～103.624、1.936～102.583 μg范圍內(nèi)與色譜峰面積呈良好線性關(guān)系。回歸方程見表1。

表1 果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖線性關(guān)系考察

2.5 精密度試驗(yàn)精密配置果糖（質(zhì)量濃度為2.114 mg/mL）和葡萄糖（質(zhì)量濃度為2.194 mg/mL）的混合對(duì)照品溶液；麥芽糖（質(zhì)量濃度為1.029 mg/mL）對(duì)照品溶液，照“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，結(jié)果果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖峰面積的RSD分別為0.12%、0.10%、0.31%、0.22%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)取“2.2”項(xiàng)下供試品溶液（批號(hào)：2151109）適量，分別于室溫下放置0、2、6、12、18、24 h時(shí)按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖峰面積的RSD分別為0.51%、1.23%、1.77%、1.98%（n=6），表明供試品溶液在室溫下放置24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)取供試品（批號(hào)：2151109）適量，按“2.2”項(xiàng)下方法制備6份供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定并計(jì)算各組分含量。結(jié)果果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖峰面積的RSD分別為1.51%、1.01%、0.67%、0.88%（n=6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.8 加樣回收率試驗(yàn)稱取已知含量的生化丸（檢品號(hào)：201700421）適量，剪碎，取約1 g，共6份，精密稱定后置于錐形瓶中，精密加入果糖、葡萄糖混合對(duì)照品溶液（每1 mL含果糖42.25 mg，葡萄糖22.83 mg）10 mL；蔗糖、麥芽糖混合對(duì)照品溶液（每1 mL含蔗糖0.282 2 mg，葡萄糖0.015 7 mg）10 mL，加水80 mL，稱定質(zhì)量，振搖溶散，超聲30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用水補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，過濾，取續(xù)濾液，即得。按“2.1”色譜條件測(cè)定4種糖含量，計(jì)算回收率，4種成分平均加樣回收率≥95%，RSD均小于2.0%（n=6），回收率較好，表明方法可行，結(jié)果見表2。

表2 4種成分加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.9 樣品測(cè)定取市售91批生化丸樣品，按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，并按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，計(jì)算樣品含量，結(jié)果見表3。

表3 生化丸（大蜜丸與小蜜丸）糖含量測(cè)定值

續(xù)表3：

3 討 論

國(guó)家蜂蜜標(biāo)準(zhǔn)(GB 14963—2011）中規(guī)定，蜂蜜中果糖和葡萄糖含量（總量）不少于600 mg/g，2020年版《中華人民共和國(guó)藥典》“蜂蜜”項(xiàng)下要求蜂蜜中果糖與葡萄糖含量比值不得小于1.0，含果糖和葡萄糖的總量不少于60.0%，蔗糖和麥芽糖含量分別不得過5.0%。生化丸處方中各藥材均含有一定量蔗糖，本試驗(yàn)不再考察蔗糖含量占比[12-14]。

按生化丸中蜂蜜與藥粉比例折算，企業(yè)J、K、L、M生產(chǎn)的生化丸部分批次麥芽糖含量高于《中華人民共和國(guó)藥典》蜂蜜中麥芽糖含量不得過5.0%的限度，大部分企業(yè)生產(chǎn)的生化丸中果糖與葡萄糖總量較低，果糖與葡萄糖含量比值均低于1.0，提示這些企業(yè)對(duì)蜂蜜輔料的質(zhì)量不夠重視，有意無意摻加或使用了麥芽糖漿[15-17]。

蜂蜜作為蜜丸重要的輔料，《本草綱目》曰：“蜂蜜入藥之功有五：清熱也，補(bǔ)中也，解毒也，潤(rùn)燥也，止痛也。生則性涼，故能清熱；熟則性溫，故能補(bǔ)中，甘而和平，故能解毒；柔而濡澤，故能潤(rùn)燥；緩可以去急，故能止心腹肌肉瘡瘍之痛；和可以致中，故能調(diào)和百藥而與甘草同功。”足見蜂蜜入藥的重要意義[18-21]，因此建議嚴(yán)格監(jiān)管蜂蜜的投料，完善蜂蜜質(zhì)量?jī)?nèi)控指標(biāo)，從而增加經(jīng)典中成藥的有效性。