補腎通脈方通過調控microRNA-126-3p對血管內皮損傷的保護作用*

陳宏昱，程 紅，莊震坤，徐 翀，劉樹楷，趙海梅，彭少林，燕竹青，陳穎穎，焦萁薈，程 晶

（廣州中醫藥大學第四臨床醫學院/深圳市中醫院，廣東 深圳 518033）

動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）一直是心血管疾病發生發展的主要原因，亦是其防治的關鍵。由AS所致的臨床疾病主要包括缺血性心臟病、缺血性中風和周圍動脈硬化等，這些疾病都有很高的致殘率、致死率。截至2019年，我國心血管病患病人數達3.3億，其中腦卒中1 300萬、冠心病1 100萬[1]。基于AS復雜的發病機制，從20世紀50年代至今涌現出多種相關假說，包括脂質浸潤學說、損傷-反應學說、內皮功能學說、炎癥反應學說、氧化學說、剪切應力學說等，這些假說基本明確了炎癥、脂肪、血流異常、內皮細胞等作為媒介在AS過程中的重要作用，為進一步研究AS的病理機制奠定了基礎。目前治療AS的藥物主要有他汀類的調脂藥，以阿司匹林為主的抗血小板聚集藥，通過降低心率-血壓乘積進而減緩AS進程的β受體阻滯劑，以及抑制血管內皮增生的血管緊張素轉換酶抑制劑及其受體拮抗劑，但藥物的禁忌證、副作用及患者依從性使得治療存在一定局限性；非藥物治療有動脈內膜切除術、動脈內支架植入術及經皮動脈腔內血管成形術，因手術的創傷性及其一定比例的再狹窄率使其應用受到限制[2]。近幾年AS相關microRNA（miRNA）領域的研究飛速發展，從基因層面揭露了AS的發生發展過程。研究發現miRNA作為細胞黏附、增殖，脂質攝取和流出，以及炎癥介質的產生等病理生理過程的重要調節因子，可以直接或間接調節內皮細胞功能、炎癥反應和脂質代謝，以發揮延緩AS進程的作用[3-4]。

miRNA-126是一種內皮細胞特異性miRNA，是在內皮細胞分化過程中和成年內皮細胞中表達最多的miRNA之一[5]。在維持血管完整性和調節血管生成方面，miRNA-126能夠直接靶向某種蛋白或調節因子，激活相關分子途徑以發揮抗AS的作用。研究表明，HUVEC凋亡小體中過表達的miRNA-126-3p靶向祖細胞動員的負調節因子G蛋白信號調節因子16（Regulator of G-protein signaling 16，RGS16）可以誘導趨化因子（C-X-C基序）配體12[chemokine（C-X-C motif）ligand 12，CXCL12]表達，通過促進具有內皮祖細胞功能的lin-Sca-1+祖細胞募集，以加速內皮修復的方式抑制AS進展[6-7]。miRNA-126-3p作為miRNA-126的主要客鏈，在AS進展中發揮著至關重要的作用，故本研究嘗試以miRNA-126-3p為主要對象以闡明補腎通脈方對miRNA-126的調控作用。

1 材 料

1.1 實驗動物10周齡普通級健康雄性新西蘭大白兔15只，體質量2.0～2.5 kg，購自廣東省醫學實驗動物中心，動物許可證號：SCXK（粵）2019-0035，正式實驗開展前適應性飼養7 d，飼養條件為溫度（23±2）℃，濕度（50±10）%，自由攝食水。本實驗中新西蘭大白兔均由耳緣靜脈注射空氣致死，實驗操作符合一般動物實驗倫理學原則，經醫學實驗動物管理委員會批準。

1.2 藥物與試劑補腎通脈方，方藥組成：附子15 g，桂枝15 g，酒蓯蓉30 g，川芎20 g，三七10 g，麥冬15 g，陳皮10 g，熟地黃10 g，石菖蒲15 g，制天南星10 g，人參30 g。上述中藥均來源于深圳市中醫院藥劑科，藥劑科主任審核鑒定后由醫院煎藥房煎煮成湯劑。氨基甲酸乙酯（烏拉坦，批號：H20130609）購自上海滬試實驗室器材股份有限公司；阿托伐他汀（立普妥，批號：H20051408）購自美國輝瑞制藥有限公司；TRIzol Reagent（貨號：15596-018）購自廣州創融生物科技有限公司；人源氧化低密度脂蛋白（oxidized low density lipoprotein，ox-LDL）（貨號：OX-LDL-01）購自北京華力德科技有限公司；RIPA裂解液（貨號：P0013B）購自廣州繼科生物科技有限公司；0.1%Ⅰ型膠原酶（貨號：AAPR531-A）購自廣州沛瑜生物制品有限公司；胰蛋白酶（貨號：T6325-100g）購自上海麥克林生化科技有限公司；PrimeScript RT Master Mix（貨號：RR036A）購自廣州天駿生物科技有限公司；逆轉錄試劑盒（貨號：RBWG5-100T）購自廣州一科生物科技有限公司；2×SYBR Green qPCR Mix（貨號：SL2690-1mL）購自深圳市文樂生物科技有限公司；CD31抗體（貨號：ab28364）購自廣州維德昕生物科技有限公司；山羊抗兔IgG H&L（貨號：ab150077）購自寶如億（北京）生物技術有限公司。

1.3 主要儀器H1M型多功能微孔板檢測儀（廣州達瑞生物技術股份有限公司）；5810R型臺式大容量冷凍離心機（廣州金鋒生物科技有限公司）；ME203E型電子天平[梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司]；371型二氧化碳培養箱[賽默飛世爾科技（中國）有限公司]；Ts2R倒置顯微鏡（北京中實天工儀器設備有限公司）；FQD-96A型熒光定量PCR儀（濟南鑫貝西生物技術有限公司）。

2 方 法

2.1 補腎通脈方及阿托伐他汀含藥血清的制備將15只新西蘭大白兔隨機分為補腎通脈方組、阿托伐他汀組及正常組，每組5只；補腎通脈方組和阿托伐他汀組每只兔分別給予30 mL補腎通脈方湯劑、30 mL阿托伐他汀溶液（按0.8 mg/kg給藥）進行灌胃，1次/d，灌胃7 d，在末次給藥2 h后采血；正常組兔正常進食水，7 d后采血；腹腔注射20%烏拉坦溶液（按1.2 g/kg給藥）對兔進行麻醉，觀察兔活動度，待兔失去疼痛反射后解剖，充分暴露腹主動脈后采血；所得血液標本靜置于37℃環境中，3 000 r/min離心15 min，無菌條件下使用移液器分離血清，分裝后保存于-20℃環境中備用。

2.2 人臍靜脈內皮細胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVEC）培養獲取健康剖腹產新生嬰兒臍帶（已簽署知情同意書），立即在室溫下用濃度為0.1%的Ⅰ型膠原酶消化，1 h后得血管內皮細胞，置于5%CO2、37℃、飽和濕度的培養箱進行原代培養，培養基采用含有10%胎牛血清的M199培養基（50 μg/mL肝素鈉、2 mmol/L谷氨酰胺、10 U/mL貝復濟、50 U/mL慶大霉素、100 U/mL青霉素），定期更換培養液，并在倒置顯微鏡下觀察原代及傳代細胞的形態特點。

2.3 HUVEC鑒定將已培養完成的HUVEC接入鋪有蓋玻片的六孔板內，24 h后，觀察細胞融合情況，細胞融合至70%左右時開始染色；HUVEC經過固定、透化和封閉，加入CD31抗體，后于4℃條件下孵育12 h；次日經PBS漂洗后加入熒光二抗，室溫孵育1 h；重復上述操作，共漂洗3次，并在最后一次漂洗時加入核染料DAPI，再加入10～20 μL封片劑封片；最后鏡下觀察拍照。

2.4 ox-LDL干預HUVEC建立內皮細胞損傷模型在96孔板中配置100 μL的HUVEC細胞懸液，將培養板置于37℃，5%CO2培養箱中預培養。24 h后向培養板加入10 μL不同質量濃度（10、50、100 μg/mL）的ox-LDL，將培養板置于培養箱孵育24 h，然后向每孔加入10 μL CCK8溶液，將培養板在培養箱內繼續孵育4 h，用酶標儀測定各組細胞在450 nm處的吸光度，了解細胞活性；選定ox-LDL作用濃度。以同樣的方法選定合適的作用時間，最終以合適的ox-LDL作用濃度及作用時間干預HUVEC建立內皮細胞損傷模型。

2.5 分組及含藥血清干預在ox-LDL誘導內皮細胞損傷模型建立中，將HUVEC分為8組：正常對照組，損傷對照組，補腎通脈方5%、10%、15%濃度組，阿托伐他汀5%、10%、15%濃度組。正常對照組予正常兔血清干預；在細胞損傷模型建立完成后，損傷對照組予正常兔血清干預，補腎通脈方組及阿托伐他汀組予不同濃度的含藥血清干預，含藥血清濃度設定為補腎通脈方5%、10%、15%及阿托伐他汀5%、10%、15%。24 h后用CCK-8法檢測各組細胞活性。

2.6 qPCR檢測HUVEC中miRNA-126-3p的表達分別收集正常對照組、損傷對照組、補腎通脈方10%濃度組和阿托伐他汀組細胞，經PBS漂洗3次，加入Trizol裂解液。分離提取總miRNA，逆轉錄獲得cDNA，再以cDNA為模板，采用SYBR Green染料法相對定量qPCR實驗；所采用反應條件：94℃預變性2 min，94℃5 s、60℃30 s共40個循環，72℃10 min，最后以2-ΔΔCt法（Livak法）計算miRNA-126-3p相對表達量，每組實驗均進行3次。引物序列詳見表1。

表1 qPCR引物序列

2.7 統計學方法采用SPSS 26.0統計學軟件進行數據分析。計量資料以“均數±標準差”（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較用LSD-t檢驗，P〈0.05為差異有統計學意義。

3 結 果

3.1 HUVEC培養光鏡下可見大量3～4個成團的內皮細胞。細胞接種后4 h開始貼壁生長，5 d左右可融合成片，原代細胞呈小三角形、圓形或梭形，細胞分布不均勻，成簇生長互不重疊。（見圖1）

圖1 光鏡下觀察HUVEC細胞形態

3.2 HUVEC鑒定免疫熒光結果顯示所有HUVEC細胞均表達CD31，表明本實驗分離培養的HUVEC細胞純度較高。（見圖2）

圖2 CD31免疫熒光染色HUVEC細胞

3.3 ox-LDL作用濃度及作用時間對細胞活性的影響以ox-LDL作用24 h為條件，ox-LDL干預質量濃度為10、50、100 μg/mL時，細胞活性均有下降。與正常對照組比較，10、50 μg/mL組細胞活性下降不明顯，差異無統計學意義（P〉0.05）；100 μg/mL組細胞活性下降至正常對照組的47%，差異有統計學意義（P〈0.05）。（見圖3A）選定ox-LDL作用質量濃度為50 μg/mL，ox-LDL干預時間分別為12、24、48 h，細胞活性均有下降。與正常對照組比較，干預12、24 h組細胞活性下降不明顯，差異無統計學意義（P〉0.05）；48 h組細胞活性下降至正常對照組的53%，差異有統計學意義（P〈0.05）。（見圖3B）綜上，質量濃度為50 μg/mL的ox-LDL作用24 h為最適合的實驗條件。

圖3 ox-LDL作用濃度及作用時間對細胞活性的影響（±s，n=6）

3.4 補腎通脈方及阿托伐他汀對ox-LDL內皮細胞損傷的保護作用與正常對照組比較，損傷對照組、補腎通脈方5%濃度組、補腎通脈方15%濃度組、阿托伐他汀5%濃度組及阿托伐他汀15%濃度組細胞活性均明顯降低（P〈0.05）；與損傷對照組比較，補腎通脈方5%、10%、15%濃度組及阿托伐他汀10%、15%濃度組細胞活性均明顯升高（P〈0.05）；與補腎通脈方10%濃度組比較，補腎通脈方5%、15%濃度組細胞活性均明顯降低（P〈0.05）；與阿托伐他汀10%濃度組比較，阿托伐他汀5%、15%濃度組細胞活性均明顯降低（P〈0.05）。表明補腎通脈方對ox-LDL內皮細胞損傷具有保護作用。（見圖4）

圖4 各組細胞活性水平比較（±s，n=8）

3.5 各組HUVEC細胞中miRNA-126-3p相對表達量比較與正常對照組比較，阿托伐他汀組HUVEC細胞中miRNA-126-3p相對表達量明顯上調，差異有統計學意義（P〈0.05）；與損傷對照組比較，補腎通脈方組及阿托伐他汀組HUVEC細胞中miRNA-126-3p相對表達量均明顯上調，差異有統計學意義（P〈0.05）；補腎通脈方組HUVEC細胞中miRNA-126-3p的相對表達量與阿托伐他汀組比較，差異無統計學意義（P〉0.05）。（見圖5）

圖5 各組HUVEC細胞中miRNA-126-3p相對表達量比較（±s，n=3）

4 討 論

本研究通過體外實驗已證實補腎通脈方對ox-LDL誘導的內皮細胞損傷具有保護作用，并能上調miRNA-126-3p的表達。中醫學以“以證定法，以法選方”為基本原則，動脈粥樣硬化以腎氣虧虛、痰瘀互結為基本證型。腎陽虧虛，則鼓動無力，津液運行遲緩，布散失常，聚留而成痰瘀，與血液軸流失常的病理狀態相似，并逐步發展為炎癥細胞浸潤、內皮損傷等病理階段；腎陰不足，濡潤失司，津液化生乏源，則津枯血少，結為痰瘀，此過程與血管內皮損傷后炎癥細胞浸潤類似，最后發展為動脈粥樣硬化。故自擬方藥“補腎通脈方”以奏補腎益氣、活血化瘀之功，發揮內皮保護功能而起到預防作用。該方中用附子、桂枝溫腎助陽，徐生腎氣，桂枝以通為主，附子以補為要，一通一補，使陽氣充沛，腎氣得充；人參為補氣之要藥，氣為血之帥，氣充才能鼓動脈道內的血液運行周身，與熟地黃相配，使陰中有陽，助生精血；熟地黃補血滋陰，益精填髓。《本草綱目》有云：“填骨髓，長肌肉，生精血，補五臟內傷不足，通血脈，利耳目，黑須發。”熟地黃兼有補益和通利血脈兩種功效；肉蓯蓉歸腎經，專補腎中水火，與熟地黃為伍可增強溫腎陽、益精血之功；川芎善行散，走而不守，上至巔頂，下至血海，活血祛瘀之力強，三七尤其擅長活血、止血，但補虛強壯亦能彰顯其特點，正如《本草綱目拾遺》中記載：“人參補氣第一，三七補血第一，味同而功亦等，故稱人參三七，為中藥中之最珍貴者。”川芎、三七兩藥配伍一者可補血潤脈，二者可活血通脈；麥冬養陰生津，與人參相伍，一補一潤，則益氣養陰之功益彰；陳皮理氣健脾，使全方補而不滯；石菖蒲、制天南星燥濕化痰，使痰瘀得散。各藥相配，旨在補腎活血化痰。大量臨床研究已經證實了以補腎、活血為首要原則的中藥處方治療動脈粥樣硬化的有效性[8-9]。王信林等[10]研究表明人參皂苷Rg1對載脂蛋白E基因敲除小鼠的主動脈動脈粥樣硬化具有較好的抑制作用，其作用機制可能為抑制核因子-κB（NF-κB）信號通路異常活化而阻止巨噬細胞向促炎型巨噬細胞轉化，抑制炎癥細胞浸潤，從而通過抑制炎癥反應發揮內皮保護作用。孫曉晶等[11]采用人參皂苷Rb1干預缺血性腦卒中大鼠模型，結果表明，實驗組中胞內磷脂酰肌醇激酶（phosphatidylinositide 3-kinases，PI3K）與蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）的表達上調。行為學評分、水迷宮實驗顯示，人參皂苷Rb1對缺血性腦卒中大鼠模型腦組織具有保護作用，其機制可能與調控PI3K/AKT信號通路相關。該通路與細胞增殖、凋亡密切相關，可通過促進內皮修復的直接方式保護內皮細胞。亦有相關實驗證明了三七、川芎、附子、桂枝、肉蓯蓉的內皮保護特性[12-14]。就整體方藥而言，本課題組前期研究應用該方治療頸動脈粥樣硬化患者，結果提示補腎通脈方能夠發揮抗動脈粥樣硬化作用，其作用效果與阿托伐他汀組無明顯差別[15]；體外實驗表明，補腎通脈方可上調抑制凋亡基因B淋巴細胞瘤-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）的表達，降低促凋亡基因半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（Caspase-3）的表達活性，減少內皮細胞的凋亡數，抑制細胞凋亡發揮內皮細胞保護作用，此過程可能與補腎通脈方上調miRNA-126-3p的表達有關[16]；同時，該方還能下調基質金屬蛋白酶2（matrix metalloproteinases-2，MMP2），上調金屬蛋白酶2組織抑制因子（tissue inhibitor of metalloproteinase 2，TIMP-2）在兔動脈粥樣硬化模型斑塊內的表達，而MMP2作為分解斑塊內基質的主要蛋白，其表達水平的下降能有效穩定動脈粥樣硬化斑塊、抑制動脈粥樣硬化進展[17-18]。所以補腎通脈方不僅能夠在動脈粥樣硬化初期階段保護損傷的內皮細胞，在動脈粥樣硬化進展期也能夠有效穩定斑塊，進而延緩動脈粥樣硬化的進一步發展。

通過與給定靶標mRNA的3'非翻譯區結合，miRNA在轉錄后可調節基因表達模式，進而調控蛋白質的表達水平以達到影響動脈粥樣硬化發展過程的作用[19-21]。近幾年，有一些研究已經明確了有關miRNA在炎癥激活、細胞增殖和內皮細胞再生中的調節作用[22-23]。miRNA-126-3p防治動脈粥樣硬化的作用機理較為復雜，在多個方面均有論證。QU Q X[24]等通過細胞實驗研究證明miRNA-126-3p能促進HUVECs增殖、遷移和成管作用，并在之后的動物試驗中建立大鼠靜脈動脈化模型，結果分析顯示，用miRNA-126-3p修飾的人臍帶間充質干細胞移植治療的組別具有更高的靜脈再內皮化，并可以顯著減少大鼠移植血管內膜增生。此作用機制可能與SPRED-1（sprouty related EVH1 domain containing 1，SPRED-1）/PI3K/AKT/ERK1/2信號通路有關。該信號通路與細胞增殖、遷移密切相關，能加速病變血管的內皮修復。高水平的促炎性細胞因子一直被認為是動脈粥樣硬化疾病發展及并發癥發生的危險因素。OHTA M等[25]通過研究發現炎癥因子白細胞介素-6（IL-6）能夠抑制人臍靜脈細胞融合細胞中miRNA-126-3p的表達水平，加速內皮細胞炎癥反應，其作用機制可能與調控細胞間黏附分子1（ICAM-1），促進單核細胞向內皮細胞遷移有關。除了脂質聚集所致的內皮損傷之外，大量單核細胞黏附于內皮細胞表面也是動脈粥樣硬化前期進展的關鍵因素之一。IL-6可通過下調miRNA-126-3p的表達水平促進ICAM-1表達，進而導致動脈粥樣硬化進展。另外，細胞自噬作為機體自我更新的保護機制，對于抗細胞衰老及凋亡至關重要。研究表明，ox-LDL誘導的HUVEC自噬通量下調，而miRNA-126的干預能夠逆轉此過程、挽救自噬通量，以減少HUVEC中的細胞損傷及細胞凋亡，此過程可能與PI3K/AKT/mTOR通路有關，但具體客鏈尚未明確[26]，這也值得研究者深入探索。這些研究確定了miRNA-126-3p無論是調控內皮細胞增殖和遷移、抑制炎癥反應，還是抗細胞衰老及凋亡，均能夠發揮延緩動脈粥樣硬化進展的作用，這與補腎通脈方的內皮保護機制相契合。

本實驗通過體外實驗觀察補腎通脈方對miRNA-126-3p的調控作用，嘗試從基因層面闡釋補腎通脈方對動脈粥樣硬化中內皮損傷的保護作用。結果顯示，在補腎通脈方含藥血清的作用下，ox-LDL誘導的HUVEC損傷模型細胞活性明顯升高。與損傷對照組比較，5%、10%、15%濃度補腎通脈方均能挽救細胞活性；10%濃度的作用最明顯，且補腎通脈方10%濃度組細胞活性與正常對照組比較，差異無統計學意義（P〉0.05）。同時，與損傷對照組比較，補腎通脈方含藥血清能明顯提高HUVEC中miRNA-126-3p的表達水平，且補腎通脈方組HUVEC中miRNA-126-3p表達水平與阿托伐他汀組比較，差異無統計學意義（P〉0.05）。綜上所述，補腎通脈方能夠上調miRNA-126-3p的表達以發揮內皮保護作用，進而延緩動脈粥樣硬化進展。