一測多評法同時測定蒲公英配方顆粒中5種成分的含量*

施文婷，鄧桂海，文珊，黎桃敏，張蘭蘭，劉權震，梁志毅

（廣東一方制藥有限公司/廣東省中藥配方顆粒企業重點實驗室，廣東 佛山 528244）

蒲公英是菊科植物蒲公英（Taraxacum mongolicum Hand.-Mazz.）、堿地蒲公英（Taraxacum borealisinense Kitam.）或同屬數種植物的干燥全草[1]。其主要產于北半球溫帶至亞熱帶地區，在我國主要分布于華北、東北、西北、西南等地區[2]。現代藥理研究表明，蒲公英含有酚酸類、黃酮類、多糖類、萜類及甾醇類等多種有效成分[3-5]，具有抗癌、抗氧化、降血糖、抗血栓、免疫調節等多重藥理作用，同時蒲公英具有清熱解毒、健胃消炎、散結、利尿活血的功效，臨床上主要用于治療炎癥、疔毒癰腫、腫瘤、高脂血癥、前列腺等疾病[6-10]。

蒲公英配方顆粒由蒲公英藥材炮制成飲片后，經過提取、濃縮和制劑工藝精制而成，具有藥性強、藥效好、免煎煮、服用方便等優勢，臨床應用廣泛[11]。一測多評法借助相對校正因子，只需測定一個成分（內標物），即可實現對多個有效成分的定量分析，同時降低了檢測成本，在中藥質量控制方面得到廣泛應用[12-13]。本研究通過建立一測多評法，以咖啡酸為內標物，同時測定蒲公英配方顆粒中單咖啡酰酒石酸、新綠原酸、綠原酸和菊苣酸的含量，以期為蒲公英配方顆粒的質量控制及后續研究提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Thermo U3000型高效液相色譜儀（美國賽默飛公司）；Waters Arc型高效液相色譜儀（美國沃特世公司）；Milli-Q Direct型超純水系統（德國默克公司）；XP26型百萬分之一天平、ME204E型萬分之一天平均購自瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司；KQ-500DE型數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 試藥 綠原酸對照品（批號：110753-201817，質量分數為96.80%）、咖啡酸對照品（批號：110885-201703，質量分數為99.7%）均購自中國食品藥品檢定研究院；單咖啡酰酒石酸對照品（批號：wkq20043006，質量分數為99.10%）、新綠原酸對照品（批號：wkq18030107，質量分數為98.00%）、菊苣酸對照品（批號：wkq20030403，質量分數為98.56%）均購自四川省維克奇生物科技有限公司；乙腈、甲醇為色譜純均購自德國默克公司；醋酸為色譜純（天津市科密歐化學試劑有限公司）；其他試劑為分析純。本研究所用10批蒲公英配方顆粒（編號：S1～S10）由廣東一方制藥有限公司提供。

2 方法與結果

2.1 色譜條件[14]采用Waters Xbridge C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5.0 μm，美國沃特世公司），流動相為乙腈（A）-0.5%醋酸溶液（B），梯度洗脫（0～25 min，5%～15%A；25～35 min，15%～35%A；35～50 min，35%A），檢測波長為323 nm，柱溫為35 ℃，進樣量為10 μL，流速為1.0 mL/min。

2.2 混合對照品溶液的制備 分別取單咖啡酰酒石酸、新綠原酸、綠原酸、咖啡酸、菊苣酸對照品適量，精密稱定，加入50%甲醇定容，制成質量濃度分別為556.248 0、53.468 8、54.046 6、54.840 8、388.864 0 μg/mL的混合對照品貯備液。

2.3 供試品溶液的制備[12]取蒲公英配方顆粒約0.2 g，精密稱定樣品質量，置于100 mL的具塞錐形瓶中，精密加入水50 mL，密塞，稱定總質量，超聲波提取目標成分30 min后，取出，放冷后再稱質量，補足減失的水溶液質量，搖勻，濾過，取續濾液，即得供試品溶液。

2.4 方法學考察

2.4.1 專屬性試驗[15]分別精密吸取空白溶劑、混合對照品溶液及供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣測定。結果顯示，空白溶劑色譜圖中，在單咖啡酰酒石酸、新綠原酸、綠原酸、咖啡酸、菊苣酸的出峰位置無吸收峰；供試品溶液色譜中，在與混合對照品溶液色譜相同保留時間處有相應色譜峰，表明該方法專屬性良好。（見圖1）

2.4.2 線性關系考察[12]精密量取0.1、0.2、0.5、1.0、2.5、5.0、10.0 mL的單咖啡酰酒石酸（556.248 0 μg/mL）、新綠原酸（53.468 8 μg/mL）、綠原酸（質54.046 6 μg/mL）、咖啡酸（54.840 8 μg/mL）、菊苣酸（388.864 0 μg/mL）混合對照品溶液，置于容量瓶中，緩慢滴加50%甲醇溶液定容至10 mL的刻度線處，制成系列濃度的混合對照品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄單咖啡酰酒石酸、新綠原酸、綠原酸、咖啡酸、菊苣酸的峰面積。以對照品溶液質量濃度為橫坐標（x），峰面積為縱坐標（y）進行線性回歸。結果表明各成分的線性關系在其相應的質量濃度范圍內均有良好的線性關系。（見表1）

表1 線性關系考察結果

續表1：

2.4.3 精密度試驗[15]精密吸取“2.2”項下混合對照品溶液，按“2.1”項下色譜條件連續進樣6次，計算得單咖啡酰酒石酸、新綠原酸、綠原酸、咖啡酸、菊苣酸色譜峰峰面積的RSD均小于3%，表明儀器精密度良好。

2.4.4 穩定性試驗[15]取蒲公英配方顆粒樣品適量，精密稱定，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件分別于制備0、2、4、8、12、24 h后進樣測定，計算得單咖啡酰酒石酸、新綠原酸、綠原酸、咖啡酸、菊苣酸色譜峰峰面積的RSD均小于3%，表明供試品溶液在24 h內穩定性良好。

2.4.5 重復性試驗[15]取蒲公英配方顆粒樣品適量，精密稱定，按“2.3”項下方法平行制備6份供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，計算得單咖啡酰酒石酸、新綠原酸、綠原酸、咖啡酸、菊苣酸色譜峰峰面積的RSD均小于3%，表明該方法重復性良好。

2.4.6 加樣回收率試驗[12]取同一批次已知成分含量的蒲公英配方顆粒共9份，研細，每份取約0.5 g，精密稱定后分別置于錐形瓶100 mL中，每組分別加入單咖啡酰酒石酸、新綠原酸、綠原酸、咖啡酸、菊苣酸對照品溶液，加入量為蒲公英配方顆粒中各成分含量的50%、100%和150%，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，計算加樣回收率及RSD。平均回收率：單咖啡酰酒石酸為105.20%（RSD=1.76%）；新綠原酸為106.83%（RSD=2.40%）；綠原酸為106.89%（RSD=1.77%）；咖啡酸為102.60%（RSD=2.51%）；菊苣酸為105.30%（RSD=2.91%）。表明該方法準確度良好。（見表2）

表2 5 種成分的加樣回收率試驗結果（n=9）

2.5 相對校正因子的確定[16-17]精密吸取“2.4.2”項下混合對照品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，以咖啡酸為內標物，計算其他4種成分的相對校正因子（fs/k），公式為fs/k=fs/fk=（As×Ck）/（Ak×Cs）。其中As為內標物峰面積，Cs為內標物質量濃度，Ak為待測成分峰面積，Ck為待測成分質量濃度。結果見表3。

表3 各成分相對校正因子（n=7）

2.6 耐用性和系統適應性試驗

2.6.1 不同色譜系統及色譜柱對相對校正因子的影響[18]以咖啡酸為內標物，考察其他4種成分在Thermo U3000型、Waters Arc型2種高效液相色譜系統，以及Waters Xbridge C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Agilent ZORBAX Extend-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）、YMC Triart C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）3種色譜柱下的相對校正因子。結果見表4。各成分的RSD均小于3%，表明不同色譜系統和色譜柱對各成分相對校正因子無顯著影響。

表4 不同色譜系統、色譜柱對相對校正因子的影響

2.6.2 不同柱溫對相對校正因子的影響[18]采用Waters Arc型高效液相色譜儀、Waters Xbridge C18色譜柱，考察柱溫25、30、35、40 ℃對各成分相對校正因子的影響。結果見表5。不同柱溫條件下各成分的RSD均小于3%，表明柱溫對各成分相對校正因子無顯著影響。

表5 不同柱溫對相對校正因子的影響

2.6.3 不同流速對相對校正因子的影響[18]采用Waters Arc型高效液相色譜儀、Waters Xbridge C18色譜柱，考察流速0.8、1.0、1.2 mL/min對各成分相對校正因子的影響。結果顯示不同流速條件下各成分的RSD均小于3%，表明不同流速對各成分相對校正因子無顯著影響。（見表6）

表6 不同流速對相對校正因子的影響

2.6.4 不同進樣體積對相對校正因子的影響[18]采用Waters Arc型高效液相色譜儀、Waters Xbridge C18色譜柱，考察進樣體積2、4、6、8、10、15 μL對各成分相對校正因子的影響。結果顯示各成分的RSD均小于3%，表明進樣體積的波動對各成分相對校正因子無顯著影響。（見表7）

表7 不同進樣體積對相對校正因子的影響

2.7 待測成分色譜峰的定位[19]在QAMS的應用中，目前常用的色譜峰定位方法有相對保留值法、保留時間差法、時間校正法、對照提取物法等方法。保留時間差法計算公式：Δti/s=ti-ts。相對保留值法計算公式：ti/s=ti/ts。本實驗采用相對保留時間進行待測組分色譜峰的定位，以咖啡酸為內標物，考察其他4種成分在Thermo U3000型和Waters Arc型2種高效液相色譜系統，以及3根不同廠家的色譜柱（Waters Xbridge C18、Agilent ZORBAX Extend-C18、YMC Triart C18）的相對保留時間。采用相對保留值法各成分的RSD均小于3%，表明采用相對保留值法對待測成分的定位是可行的。（見表8）

表8 各成分相對保留時間

2.8 一測多評法與外標法測定結果比較 取10批蒲公英配方顆粒適量，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，分別采用外標法和一測多評法測定各成分含量，利用SPSS 20.0軟件對兩組檢測結果進行配對t檢驗及Pearson相關性分析。兩種方法之間的相關系數r均為1.000，表明兩種方法測定結果比較，差異無統計學意義（P＞0.05），建立的一測多評法具有較好的可信度。（見表9）

表9 外標法與一測多評測定結果比較（%，n=3）

3 討 論

蒲公英作為一種藥食同源植物，在我國傳統食用和藥用方面的應用已有幾千年歷史。蒲公英含有多種有效成分，其中酚酸類成分如單咖啡酰酒石酸、新綠原酸、綠原酸和菊苣酸等為其主要活性成分，具有抗氧化、免疫調節、降血糖和抑制腫瘤等多重藥理作用[20-22]。蒲公英配方顆粒國家標準屬于國家藥品監督管理局首批頒布的160個中藥配方顆粒國家標準之一，已于2021年11月1日正式實施。中藥配方顆粒國家標準的執行將有助于實現安全性、有效性等多方面的整體質量控制。本研究在此基礎上，采用QAMS法同時測定了蒲公英配方顆粒中5種有效成分的含量，并對QAMS法的可行性與適用性進行了探討。計算結果與外標法實測結果無明顯差異，表明所建立的QAMS方法經濟、穩定、可行，可為蒲公英配方顆粒的質量控制、譜效相關研究提供基礎，并為其他品種質量評價研究提供范例。