黃芩苷口腔貼片的制備及質(zhì)量初步評(píng)價(jià)*

楊 東，畢建云，劉文靜

（1.濰坊市益都中心醫(yī)院，山東 濰坊 262500；2.山東中醫(yī)藥大學(xué)，山東 濟(jì)南 250355）

黃芩苷為唇形科植物黃芩（Scutellaria baicalensis Georgi）的干燥根經(jīng)加工提取的黃酮類化合物，為淡黃色至棕黃色的粉末，味淡、微苦。藥理研究結(jié)果顯示黃芩苷水解可產(chǎn)生黃芩素和葡萄糖醛酸，具有抗炎、降血壓、調(diào)節(jié)免疫等多種藥理作用[1-3]，現(xiàn)常用劑型為片劑和膠囊劑。但黃芩苷水溶性差、口服吸收不佳，易在胃腸道降解而降低口服給藥生物利用度，從而限制藥性發(fā)揮[4]。故筆者將黃芩苷制備成口腔貼片粘貼于口腔，使其經(jīng)黏膜吸收后起局部或全身作用，從而有效避免藥物首過效應(yīng)和口服給藥導(dǎo)致的患者服藥依從性降低，同時(shí)使藥物直達(dá)患處，穩(wěn)定藥效和藥物釋放速率，延長藥物的釋放和作用時(shí)間。本研究采用BOX-Behnken-響應(yīng)面法（BBDRSM法）優(yōu)選黃芩苷口腔貼片的最佳成型工藝，并通過片重差異、薄層鑒別和含量測(cè)定對(duì)黃芩苷口腔貼片進(jìn)行初步質(zhì)量評(píng)價(jià)，為其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定提供依據(jù)。

1 材料與試劑

1.1 儀器 LC-16型高效液相色譜儀，檢測(cè)器為SPD-16紫外可見檢測(cè)器，工作站為LC-Solution（日本島津）；FA2004B型電子天平（上海天美天平儀器有限公司）；HH-2型數(shù)顯恒溫水浴鍋（江蘇東鵬儀器制造有限公司）；PL-S20型數(shù)碼超聲波提取器（昆山市超聲儀器有限公司）；ZP-8型壓片機(jī)（上海天和制藥機(jī)械有限公司）；UV-9600型紫外燈分析儀（杭州齊威儀器有限公司）。

1.2 藥物與試劑 黃芩（批號(hào)：20031001）購于山東省藥材公司，供提取黃芩苷用；黃芩苷（批號(hào)：MUST-13112909）購于上海經(jīng)科化學(xué)科技有限公司，供含量測(cè)定用；輔料：羥丙甲基纖維素、卡波姆、甘露醇、微晶纖維素均購于陜西正一藥用輔料有限公司；試劑：硬脂酸鎂、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣、碳酸氫鈉、薄荷腦、淀粉、鹽酸、氫氧化鈉、乙醇、醋酸、甲醇、磷酸均購自濟(jì)南啟光科貿(mào)有限公司，甲醇、磷酸均為色譜純；水為娃哈哈純凈水；聚酰胺薄膜（浙江省臺(tái)州市路橋四甲生化塑料廠）；黃芩苷口腔貼片3批（批號(hào)：20210409，20210411，20210413），由山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)實(shí)驗(yàn)室研制。

2 方法與結(jié)果

2.1 黃芩苷提取物的制備 按照堿溶酸沉原理，遵循2020年版《中華人民共和國藥典》[5]步驟制備黃芩苷提取物。

2.2 考察指標(biāo)的確立

2.2.1 外觀性狀 本實(shí)驗(yàn)成品為淡黃色口腔貼片，外表光滑，干燥無黏性，遇唾液黏附性良好。

2.2.2 pH值 取本實(shí)驗(yàn)成品5片均勻分散于10 mL水中使其充分溶脹并超聲混勻，測(cè)定pH值，為6～8。

2.2.3 體外黏附時(shí)間的測(cè)定 取2.38 g Na2HPO4、0.19 g KH2PO4、0.8 g NaCl溶于1 000 mL蒸餾水中配制人工唾液，并調(diào)節(jié)pH值至7.0備用。用人工唾液潤濕藥片底部，使藥片自然黏附于小燒杯壁上的中間部分，加入足量人工唾液沒過藥片，37 ℃水浴保溫，記錄藥片脫落時(shí)間，考慮兩餐間隔時(shí)間，藥品脫落時(shí)間應(yīng)不少于3.5 h[6]。

2.2.4 黏附力的測(cè)定 首先配制1 000 mL人工唾液備用。取新鮮的雞蛋殼膜置于人工唾液中浸泡，使充分浸潤后，剪取適當(dāng)面積大小（應(yīng)大于所制備口腔貼片面積）粘貼于玻片。用人工睡液潤濕口腔貼片釋藥面并迅速覆蓋玻片，給予一定外力使圖1中的“3”和“4”緊密接觸，放緩輸液速度，玻片脫落時(shí)圖1中“4”和“5”的總質(zhì)量即藥片黏附力，每個(gè)處方平行測(cè)定5次[7]。（見圖1）

2.2.5 體外釋藥性能 采用瓊脂基質(zhì)測(cè)定法測(cè)定所制備口腔貼片的釋藥性能。取9 g NaCl、0.12 g KCl、0.24 g CaCl2、0.2 g NaHCO3溶于1 000 mL蒸餾水中配制林格液，并調(diào)節(jié)pH值至7.0，備用。取200 mL林格液，加入1.4 g瓊脂粉，煮沸溶解，趁熱傾入試管，垂直放至冷凝。將制備的口腔貼片釋藥面用少許人工唾液潤濕后垂直放入，使其自然黏附于試管內(nèi)的瓊脂基質(zhì)表面，37 ℃水浴恒溫，黃芩苷口腔貼片本身呈淡黃色，故可直接記錄0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 h時(shí)的呈色區(qū)高度。以時(shí)間為橫坐標(biāo)，擴(kuò)散距離的平方為縱坐標(biāo)擬合一直線，直線的斜率即擴(kuò)散系數(shù)。擴(kuò)散系數(shù)大者釋放性能優(yōu)[8]。

2.3 黃芩苷口腔貼片的制備 將黃芩苷提取物充分研磨備用。綜合現(xiàn)有文獻(xiàn)記載黃芩常用處方量及現(xiàn)存口腔貼片制備工藝中常用輔料及其配比，初步確定黃芩苷口腔貼片所用輔料及其處方量為每片含14 mg黃芩苷提取物、24 mg羥丙甲基纖維素、16 mg卡波姆、6 mg甘露醇、14 mg微晶纖維素、4 mg硬脂酸鎂。精密稱取后按照等量遞加的原則依次加入原料藥和輔料并充分混合均勻，根據(jù)依從性需要，可加入微量薄荷腦。調(diào)節(jié)壓片機(jī)使得片厚度為0.9 mm，采用6 mm沖模進(jìn)行粉末直接壓片，即得黃芩苷口腔貼片[9-12]。

2.4 星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法優(yōu)選黃芩苷口腔貼片的最佳成型工藝[13-17]

2.4.1 因素水平表的建立 本實(shí)驗(yàn)所用輔料較少，故選擇對(duì)黃芩苷口腔貼片成型工藝影響顯著的3個(gè)因素，即基質(zhì)羥丙甲基纖維素用量（A）、卡波姆用量（B）、微晶纖維素用量（C）為考察因素，以黏附力（R1）和擴(kuò)散系數(shù)（R2）為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用BBD-RSM法設(shè)計(jì)三因素三水平優(yōu)選成型工藝，根據(jù)“2.3”項(xiàng)下實(shí)驗(yàn)結(jié)果，確定各因素水平的極值。（見表1）

表1 Box-Behnken 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)因素及水平

2.4.2 星點(diǎn)設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析 將上述各因素水平采用Design-Expert 8.0.6.1軟件隨機(jī)安排實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。

表2 Box-Behnken 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

2.4.3 模型擬合 根據(jù)表2的數(shù)據(jù)結(jié)果，通過Design-Expert 8.0.6.1軟件得到黏附力（R1）和擴(kuò)散系數(shù)（R2）的二次多項(xiàng)式回歸模型：R1=7.00+0.93A+0.54B+0.61C-0.13AB+0.25AC-1.15BC-1.46A2+0.75B2+1.10C2；R2=8.52-0.49A-0.13B-0.19C-1.24AB+0.17AC+0.049BC-0.47A2+0.16B2+1.05C2。

2.4.4 方差分析 為檢驗(yàn)“2.4.3”中二次多項(xiàng)式回歸模型的有效性及“2.4.1”所述因素對(duì)黏附力和釋放性能的影響程度，對(duì)回歸方程進(jìn)行方差分析。

由表3可知，總模型方程極顯著（P＜0.01），說明該模型擬合度良好，較好地反映了黏附力與羥丙甲基纖維素用量、卡波姆用量和微晶纖維素用量之間的關(guān)系；二項(xiàng)式回歸方程失擬項(xiàng)檢驗(yàn)不顯著（P=0.076 9＞0.05），說明在黏附力的測(cè)定試驗(yàn)中誤差較小，回歸方程的代表性較好，能準(zhǔn)確地預(yù)測(cè)黃芩苷口腔貼片的黏附力情況。

表3 黏附力二次多項(xiàng)式模型的方差分析

表4可知，以擴(kuò)散系數(shù)為響應(yīng)值的二次回歸模型（P＜0.01），達(dá)到顯著水平，說明該模型擬合程度較高，擴(kuò)散系數(shù)測(cè)定實(shí)驗(yàn)誤差較小；失擬項(xiàng)檢驗(yàn)不顯著（P=0.926 7＞0.05），說明實(shí)驗(yàn)結(jié)果所受干擾較小，故該模型可用來對(duì)黃芩苷口腔貼片的釋放性能進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)。

表4 擴(kuò)散系數(shù)二次多項(xiàng)式模型的方差分析

對(duì)回歸方程各項(xiàng)方差進(jìn)行進(jìn)一步檢驗(yàn)可看出，羥丙甲基纖維素用量P均小于0.01，說明這個(gè)因素對(duì)黃芩苷口腔貼片黏附力和擴(kuò)散系數(shù)的影響都極顯著；羥丙甲基纖維素用量和微晶纖維素用量二次項(xiàng)對(duì)黃芩苷口腔貼片黏附力和擴(kuò)散系數(shù)的影響均達(dá)到極顯著水平，交互項(xiàng)BC對(duì)黃芩苷口腔貼片黏附力極顯著，交互項(xiàng)AB對(duì)黃芩苷口腔貼片擴(kuò)散系數(shù)影響顯著。綜上，在所選的各因素水平范圍內(nèi)，羥丙甲基纖維素用量對(duì)黃芩苷口腔貼片最優(yōu)處方的篩選影響最大。

2.4.5 工藝優(yōu)化與預(yù)測(cè) 應(yīng)用Design-Expert 8.0.6.1軟件，根據(jù)二次多項(xiàng)式回歸方程繪制各響應(yīng)值與因素的三維響應(yīng)面圖。由圖2的響應(yīng)面圖可知3個(gè)影響因素對(duì)黏附力和擴(kuò)散系數(shù)的影響及變化趨勢(shì)。此實(shí)驗(yàn)在所選范圍內(nèi)最佳落點(diǎn)在實(shí)驗(yàn)考察的區(qū)域內(nèi)，從而確定最佳制備工藝為：羥丙甲基纖維素用量為26.53 mg，卡波姆用量為12 mg，微晶纖維素用量為16 mg，此時(shí)黃芩苷口腔貼片理論黏附力為10.31 g，理論擴(kuò)散系數(shù)為10.02。（見圖2～3）

2.4.6 口腔貼片成型工藝的處方優(yōu)化及驗(yàn)證 根據(jù)“2.4.5”最佳條件制備3批黃芩苷口腔貼片，并對(duì)實(shí)驗(yàn)樣品進(jìn)行初步質(zhì)量檢查，即分別平行測(cè)定其黏附力和擴(kuò)散系數(shù)3次。預(yù)測(cè)值與真實(shí)值偏差均小于10%，表明該回歸模型具有可靠性，所建立的數(shù)學(xué)模型具有良好的預(yù)測(cè)性，篩選出的口腔貼片符合《中華人民共和國藥典》的規(guī)定，所優(yōu)選的最佳成型工藝合理可行、穩(wěn)定可靠。（見表5）

表5 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.5 質(zhì)量初步評(píng)價(jià)

2.5.1 片重均勻度 取按照最優(yōu)處方制備的3批黃芩苷口腔貼片各20片，精密稱定每一片的重量，為減小操作過程誤差，故用鑷子夾取口腔貼片進(jìn)行精密稱定。《中華人民共和國藥典》規(guī)定0.3 g以下片劑重量限度為±7.5%，所制備3批樣品重量差異范圍為-5.26%～5.50%，均未超出重量差異限度，表明黃芩苷口腔貼片重量差異合格。

2.5.2 薄層鑒別[18]

2.5.2.1 對(duì)照品溶液的制備 取黃芩苷對(duì)照品，加甲醇制成質(zhì)量濃度為1 mg/mL的溶液。

2.5.2.2 供試品溶液的制備 取3批樣品各140 mg，置具塞錐形瓶中，用20 mL甲醇超聲處理30 min，放冷濾過，取上清液，定容至25 mL。

2.5.2.3 陰性對(duì)照溶液的制備 按“2.4.5”所述最佳條件制成不含黃芩苷提取物的陰性口腔貼片，按“2.5.2.2”項(xiàng)方法制成陰性對(duì)照溶液。

2.5.2.4 TLC實(shí)驗(yàn)及結(jié)果 照2020年版《中華人民共和國藥典》黃芩苷提取物薄層鑒別法進(jìn)行檢視，譜圖結(jié)果見圖4，供試品與對(duì)照品在相應(yīng)位置顯示相同顏色的熒光斑點(diǎn)，陰性對(duì)照在相應(yīng)位置無斑點(diǎn)，表明本實(shí)驗(yàn)所用鑒別方法具良好重現(xiàn)性、專屬性和層析效果。

2.5.3 含量測(cè)定[19-20]

2.5.3.1 色譜條件 色譜柱：Inertsil ODS-3（4.6 mm×250 mm，5 μm）；填充劑：ODS；流動(dòng)相：甲醇-水-磷酸（47∶53∶0.2）；檢測(cè)波長：280 nm；柱溫：25 ℃；流速：1.0 mL/min；進(jìn)樣量：10 μL。

2.5.3.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取黃芩苷對(duì)照品3 mg，置100 mL量瓶加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻即得。

2.5.3.3 供試品溶液的制備 精密稱取3批樣品粉末各12 mg，用15 mL甲醇超聲0.5 h，放冷濾過，取上清液置25 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻過0.45 μm微孔濾膜，每一批樣品做3組供試品。

2.5.3.4 陰性樣品溶液的制備 按“2.4.5”最佳條件制得不含黃芩苷提取物的陰性樣品，按“2.5.3.3”項(xiàng)下方法制成陰性樣品溶液。

2.5.3.5 專屬性試驗(yàn) 分別精密吸取上述各溶液10 μL，按“2.5.3.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，色譜圖結(jié)果見圖5。

2.5.3.6 線性關(guān)系考察 精密吸取不同濃度的黃芩苷對(duì)照品10 μL，進(jìn)樣量（μg）分別為0.15、0.30、0.60、1.30、2.50，以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，相應(yīng)峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性回歸方程為Y=2 099 650.06X-8 767.62，相關(guān)系數(shù)（r）=0.999 8。（見圖6）

2.5.3.7 精密度試驗(yàn) 在“2.5.3.1”項(xiàng)下色譜條件下，精密吸取黃芩苷對(duì)照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，RSD為1.53%，表明儀器精密度良好。

2.5.3.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取供試品溶液各10 μL，分別在0、4、8、12、24 h進(jìn)行測(cè)定，RSD為1.81%，表明黃芩苷性質(zhì)穩(wěn)定。

2.5.3.9 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一時(shí)間同批號(hào)原料制備的口腔貼片，按“2.5.3.3”項(xiàng)下方法平行制備6 份供試品溶液，按“2.5.3.1”項(xiàng)色譜條件測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算含量，結(jié)果樣品平均濃度為0.054 0mg/mL，RSD為1.55%，表明該樣品及供試品制備方法可行。

2.5.3.10 加樣回收率試驗(yàn) 分別稱取成分含量已知的黃芩苷口腔貼片粉末約6 mg，分別加入等量對(duì)照品，。按“2.5.3.3”項(xiàng)制備供試品，按“2.5.3.1”項(xiàng)下方法測(cè)定，記錄峰面積和含量，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果黃芩苷口腔貼片平均加樣回收率為97.39%，RSD為1.43%。（見表6）

表6 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.5.3.11 樣品含量測(cè)定 分別精密吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液各10 μL進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算各批樣品中每片黃芩苷的平均含量，最終確定每片黃芩苷口腔貼片中黃芩苷的含量不得少于8 mg。（見表7）

表7 含量測(cè)定結(jié)果

2.5.4 黏附力和釋放性能的測(cè)定 按照“2.4.5”項(xiàng)下最優(yōu)處方制備3批黃芩苷口腔貼片，測(cè)定黏附力不得小于10 g，擴(kuò)散系數(shù)不得小于10。由表5可知，該制劑黏附力與擴(kuò)散系數(shù)均大于10，且偏差均在規(guī)定值之內(nèi)，可初步確定最終制備的黃芩苷口腔貼片具有良好的黏附力和釋放性能。

3 討 論

本實(shí)驗(yàn)先采用玉米淀粉和微晶纖維素作為填充劑，但在實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)所得片劑易碎且周身伴有粉末，可能是玉米淀粉成片粉末性嚴(yán)重，故棄用玉米淀粉。雖棄用玉米淀粉，但微晶纖維素用量不可增量過多，仍須控制在合適范圍內(nèi)，因其為疏水性輔料，用量過多會(huì)影響溶出擴(kuò)散。此時(shí)，原料藥黃芩苷、微晶纖維素、矯味劑甘露醇均可起到填充劑的作用。本實(shí)驗(yàn)所得黃芩苷口腔貼片外表面光滑，入口略苦，但矯味劑甘露醇不宜過多，為改善口感，加入微量薄荷腦起消炎清涼作用。然而，成片后易碎，黏附力下降，后采用增加羥丙甲基纖維素和卡波姆增強(qiáng)黏附性，成效不佳，故排除黏附劑用量不足的原因。因微晶纖維素吸水性強(qiáng)，薄荷腦為油性物質(zhì)，成片松軟疑為含水量不足，故先用淀粉適當(dāng)吸附薄荷腦，將兩者混合物取微量加入藥片，并將所稱輔料混合均勻后靜置一晚后再進(jìn)行壓片，效果較好。測(cè)定黏附力時(shí)所采用的雞蛋殼膜，用雙面膠、液體膠黏附于貼片時(shí)，遇水或人工唾液極易脫落。故將浸泡在人工唾液中有一定時(shí)間的雞蛋殼膜，內(nèi)層滑面自然黏附于玻片，待其自然風(fēng)干，即可使用。測(cè)定黏附力，須將藥片兩面黏附于玻片和雞蛋殼膜，注意不可馬上測(cè)定，須靜置15～20 min。時(shí)間過短，黏附不當(dāng)，藥片易滑落；時(shí)間過長，潮濕藥片風(fēng)干中部易裂片且兩面不易脫落。

質(zhì)量評(píng)價(jià)方面采用了片重均勻度、薄層色譜鑒別、高效液相含量測(cè)定、黏附力及擴(kuò)散系數(shù)的測(cè)定，可以對(duì)黃芩苷口腔貼片的質(zhì)量進(jìn)行初步評(píng)價(jià)。后期可采用溶出擴(kuò)散儀對(duì)其溶出度進(jìn)行測(cè)定，并對(duì)該制劑的滯留時(shí)間、口腔吸收情況進(jìn)行考察，對(duì)其質(zhì)量進(jìn)行更深一步的考察，以期為新藥的開發(fā)奠定基礎(chǔ)。