基于HPLC-QAMS多指標成分定量測定聯合化學計量學的津力達顆粒質量評價*

王玉娟，董玉波，孫莎莎，寧麗麗，任強，周金輝

（1.中國人民解放軍第960醫院，山東 濟南 250031；2.濟寧醫學院藥學院，山東 日照 276826）

糖尿病是以慢性高血糖為特征的代謝性疾病，可導致眼、腎、神經等多種組織器官出現慢性進行性病變、功能減退甚至衰竭，是危害人類生命健康的常見疾病之一。部分中藥能夠有效改善糖尿病患者的臨床癥狀，其有效活性成分能夠抑制ɑ-葡萄糖苷酶活性和糖異生，促進糖原合成和胰島素分泌，增加血清胰島素含量，通過多靶點調控血糖，不良反應小，且近年來已廣泛應用于糖尿病的治療中[1-2]。津力達顆粒由人參、黃精、麥冬、葛根、生地黃、炒蒼術、苦參、制何首烏等中藥材加工而成，主要用于治療2型糖尿病氣陰兩虛證。現代研究表明津力達顆粒能有效改善糖尿病腎病患者腎功能，調節VEGF和IGF-1水平[3]，通過激活FGF21/AMPK信號通路改善肝臟、脂肪組織脂質及高脂飲食誘導的代謝紊亂[4]。研究表明，津力達顆粒治療2型糖尿病臨床療效顯著[5-6]，臨床應用廣泛，為臨床常用藥物。津力達顆粒收載于2020年版《中華人民共和國藥典》一部[7]，質量標準和現有文獻[8-9]僅對該制劑所含苦參堿等成分進行定量分析。對多成分、多靶點的中成藥復方制劑而言，現有的控制措施難以確保產品質量的穩定性和臨床治療效果的一致性。而多指標質控模式能夠較為全面地體現中成藥復方制劑的整體性和系統性，近年來得以廣泛應用，同時化學計量學也越來越多地應用于中藥制劑的分析[10-11]。本研究參考中藥質量標志物選取原則，以葛根素為內參物，采用高效液相一測多評（high performance liquid chromatographyquantitative analysis of multi-components by single-marker，HPLC-QAMS）法同時檢測對津力達顆粒中人參皂苷Rb1、人參皂苷Rb3、人參皂苷Rd、3′-羥基葛根素、葛根素、3'-甲氧基葛根素、毛蕊花糖苷、焦地黃苯乙醇苷B1、蒼術素醇、白術內酯Ⅱ和蒼術素的含量，建立津力達顆粒多指標質量評價模式，同時對15批津力達顆粒含量數據采用化學計量學方法進行聚類分析和主成分分析，以期為藥品生產企業和監管部門全面評價和提升津力達顆粒的內在質量提供實驗數據。

1 材 料

1.1 試藥 人參皂苷Rb1對照品（批號：110704-202129，含量：94.3%）、人參皂苷Rb3對照品（批號：111686-202005，含量：96.5%）、人參皂苷Rd對照品（批號：111818-202104，含量：97.3%）、葛根素對照品（批號：110752-201816，含量：95.4%）、毛蕊花糖苷對照品（批號：111530-201914，含量：95.2%）、白術內酯Ⅱ對照品（批號：111976-201501，含量：99.9%）和蒼術素對照品（批號：111924-201806，含量：99.5%）均購自中國食品藥品檢定研究院；3′-羥基葛根素對照品（批號：PRF21101341，含量：98.0%）、3'-甲氧基葛根素對照品（批號：PRF9092003，含量：97.1%）、焦地黃苯乙醇苷B1對照品（批號：PRF7041822，含量：98.5%）均購自成都普瑞法科技開發有限公司；蒼術素醇對照品（批號：JD1227180626，含量：98.5%）購自上海珈得爾化學技術有限公司；津力達顆粒（9 g/袋，批號：B1908001，B1909002，B1910009，B1910012，B2003031，B2004002，B2007025，B2010007，B2011012，B2011015，B2102004，B2103009，B2104012，B2106002和B2108001）購自石家莊以嶺藥業股份有限公司，編號依次為S1～S15。乙腈選用色譜級，其他試劑均選用分析純。

1.2 主要儀器 UltiMate 3000型高效液相色譜儀（美國Thermo Fisher Scientific公司）；Perkin Elmer Series 200型高效液相色譜儀（Perkin Elmer公司）；Waters HSST3 C18柱、Phenomenex Luna C18柱和Unitary C18柱（規格：250 mm×4.6 mm，5 μm）；SB3200DT型超聲波清洗機（寧波新芝生物科技股份公司）；XP205型電子天平（瑞士Mettler Toledo公司）。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 選用Waters HSST3 C18色譜柱（250 mm×4.6mm，5 μm），柱溫為30 ℃；檢測波長分別為203 nm（0～20 min測定人參皂苷Rb1、人參皂苷Rb3、人參皂苷Rd）[12-16]、254 nm（20～34 min測定3′-羥基葛根素、葛根素、3'-甲氧基葛根素）[17-19]、330 nm（34～75 min測定毛蕊花糖苷、焦地黃苯乙醇苷B1、蒼術素醇、白術內酯Ⅱ、蒼術素）[20-25]；流動相選用乙腈-0.2%磷酸，梯度洗脫（0～10 min，13.0%乙腈；10～20 min，13.0%→26.0%乙腈；20～34 min，26.0%→45.0%乙腈；34～48 min，45.0%→52.0%乙腈；48～67 min，52.0%→68.0%乙腈；67～75 min，68.0%→13.0%乙腈），流速為1.0 mL/min，進樣量為10 μL。

2.2 混合對照品溶液的制備 精密稱取人參皂苷Rb1、人參皂苷Rb3、人參皂苷Rd、3′-羥基葛根素、葛根素、3'-甲氧基葛根素、毛蕊花糖苷、焦地黃苯乙醇苷B1、蒼術素醇、白術內酯Ⅱ和蒼術素對照品適量，用50%甲醇制成混合對照品貯備液，每1 mL 含上述11 種成分依次為0.712、1.198、0.814、1.970、6.372、1.516、0.430、0.172、0.118、0.294、0.538 mg。再將貯備液用50%甲醇稀釋20倍制得混合對照品溶液（人參皂苷Rb1為35.6 μg/mL，人參皂苷Rb3為59.9 μg/mL，人參皂苷Rd為40.7 μg/mL，3′-羥基葛根素為98.5 μg/mL，葛根素為318.6 μg/mL，3'-甲氧基葛根素為75.8 μg/mL，毛蕊花糖苷為21.5 μg/mL，焦地黃苯乙醇苷B1為8.6 μg/mL，蒼術素醇為5.9 μg/mL，白術內酯Ⅱ為14.7 μg/mL，蒼術素為26.9 μg/mL）。

2.3 供試品溶液的制備 取津力達顆粒適量，研細，取細粉約3 g，精密稱定于25 mL量瓶中，加50%甲醇20 mL，超聲提取30 min，放至室溫，用50%甲醇定容，搖勻，濾過，續濾液作為津力達顆粒供試品溶液。

2.4 陰性對照溶液的制備 取按津力達顆粒質量標準項下處方和制法制備的缺葛根，缺生地黃，缺蒼術，缺人參、黃精、麥冬的4種陰性供試品各適量，按上述方法依次制得相應的陰性對照溶液。

2.5 專屬性試驗 取“2.2”項下混合對照品溶液、“2.3”項下供試品溶液及“2.4”項下陰性對照溶液，在“2.1”項下色譜條件下進樣，記錄色譜圖。（見圖1）結果顯示津力達顆粒供試品溶液中人參皂苷Rb1、人參皂苷Rb3、人參皂苷Rd、3′-羥基葛根素、葛根素、3'-甲氧基葛根素、毛蕊花糖苷、焦地黃苯乙醇苷B1、蒼術素醇、白術內酯Ⅱ和蒼術素與相鄰色譜峰的分離度均≥1.5；理論板數按葛根素色譜峰計≥5 500；陰性對照不干擾各成分檢測。

2.6 線性關系的考察 分別精密吸取“2.2”項下混合對照品貯備液適量，用50%甲醇分別稀釋4、10、20、40、100和200倍，搖勻制得6個混合對照品溶液（序號依次為1～6），依照“2.1”項下色譜條件進樣，以所測人參皂苷Rb1、人參皂苷Rb3、人參皂苷Rd、3′-羥基葛根素、葛根素、3'-甲氧基葛根素、毛蕊花糖苷、焦地黃苯乙醇苷B1、蒼術素醇、白術內酯Ⅱ和蒼術素的質量濃度（X）對峰面積（Y）進行線性回歸。（見表1）

表1 津力達顆粒中11 種成分的線性關系考察結果

2.7 精密度試驗 在“2.1”項下色譜條件下，取津力達顆粒供試品溶液連續進樣6次，得人參皂苷Rb1、人參皂苷Rb3、人參皂苷Rd、3′-羥基葛根素、葛根素、3'-甲氧基葛根素、毛蕊花糖苷、焦地黃苯乙醇苷B1、蒼術素醇、白術內酯Ⅱ和蒼術素峰面積的RSD值依次為1.25%、1.16%、1.19%、1.03%、0.54%、1.10%、1.36%、1.49%、1.51%、1.38%和1.32%，表明儀器精密度良好。

2.8 穩定性試驗 取津力達顆粒同一份供試品溶液，在“2.1”項下色譜條件下于制備后0、2、5、9、15、24 h進樣分析，得人參皂苷Rb1、人參皂苷Rb3、人參皂苷Rd、3′-羥基葛根素、葛根素、3'-甲氧基葛根素、毛蕊花糖苷、焦地黃苯乙醇苷B1、蒼術素醇、白術內酯Ⅱ和蒼術素峰面積的RSD值依次為1.23%、1.19%、1.22%、0.99%、0.56%、1.08%、1.39%、1.52%、1.49%、1.36%和1.28%，表明津力達顆粒供試品溶液24 h內穩定。

2.9 重復性試驗 取津力達顆粒適量，按照“2.3”項下方法制備供試品溶液6份，再在“2.1”項下色譜條件下進樣檢測分析，并計算含量，得人參皂苷Rb1、人參皂苷Rb3、人參皂苷Rd、3′-羥基葛根素、葛根素、3'-甲氧基葛根素、毛蕊花糖苷、焦地黃苯乙醇苷B1、蒼術素醇、白術內酯Ⅱ和蒼術素含量的RSD值依次為1.64%、1.41%、1.50%、1.27%、0.96%、1.38%、1.73%、1.80%、1.91%、1.78%和1.85%，表明建立的方法重復性良好。2.10 加樣回收率試驗 取已知待測成分含量的津力達顆粒適量，研細，取細粉9份，每份1.5 g，精密稱定后均分成3組，精密加入混合對照品溶液（人參皂苷Rb1為0.549 mg/mL，人參皂苷Rb3為0.872 mg/mL，人參皂苷Rd0.636 mg/mL，3′-羥基葛根素1.372 mg/mL，葛根素4.795 mg/mL，3'-甲氧基葛根素1.131 mg/mL，毛蕊花糖苷0.289 mg/mL，焦地黃苯乙醇苷B1為0.124 mg/mL，蒼術素醇0.089 mg/mL，白術內酯Ⅱ0.212 mg/mL，蒼術素0.407 mg/mL）0.8、1.0和1.2 mL，再按“2.3”項方法制成加樣供試品溶液。在上述色譜條件下檢測，得以上11種成分的平均加樣回收率分別為98.96%、99.68%、98.03%、100.02%、100.12%、99.06%、96.77%、96.96%、97.90%、97.66%和98.76%，RSD分別為1.08%、1.28%、1.56%、0.67%、0.74%、1.30%、0.82%、1.21%、1.41%、1.18%和0.72%。2.11 相對校正因子（f）的計算 在上述色譜條件下進樣“2.5”項下6個混合對照品溶液，用對照品質量濃度與峰面積之比計算各成分f，即fk/s=fk/fs=（Wk/Ak）/（Ws/As）=（Wk×As）/（Ws×Ak）。其中f、W和A依次代表RCF、質量濃度和峰面積，下標k和s分別代表內參物和其他待測成分。以葛根素為內參物，分別計算其他10種成分的f。（見表2）2.12 儀器及色譜柱對f的影響 分別選用儀器（UltiMate 3000型高效液相色譜儀和Perkin Elmer Series 200型高效液相色譜儀）和色譜柱（Waters HSST3 C18柱、Phenomenex Luna C18柱和Unitary C18柱），在上述色譜條件下進樣“2.2”項下混合對照品溶液。結果測得各成分f的RSD在1.04%～1.93%之間，表明儀器與色譜柱對所建立的f無顯著影響。（見表3）2.13 流速對f的影響 分別選用不同實驗流速（0.8、1.0、1.2 mL/min），在上述色譜條件下進樣“2.2”項下混合對照品溶液。結果測得各成分f的RSD在0.86%～1.91%之間，表明流速對所建立的f無顯著影響。（見表4）2.14 柱溫對f的影響 分別選用不同實驗柱溫（25、30、35 ℃），在上述色譜條件下進樣“2.2”項下混合對照品溶液。結果測得各成分f的RSD在0.76%～1.94%之間，表明柱溫對所建立的f無明顯影響。（見表5）2.15 色譜峰定位 在上述色譜條件下進樣“2.2”項下混合對照品溶液，采用相對保留時間值法對待測成分色譜峰進行定位，考察儀器（UltiMate 3000型高效液相色譜儀和Perkin Elmer Series 200型高效液相色譜儀）和色譜柱（Waters HSST3 C18柱、Phenomenex Luna C18柱和Unitary C18柱）對相對保留時間值（t）的影響。結果測得人參皂苷Rb1、人參皂苷Rb3、人參皂苷Rd、3′-羥基葛根素、3'-甲氧基葛根素、毛蕊花糖苷、焦地黃苯乙醇苷B1、蒼術素醇、白術內酯Ⅱ、蒼術素與葛根素相對保留時間值（t）的RSD在0.81%～1.83%之間，表明目標化合物色譜峰的準確定位可采用相對保留時間值法。（見表6）2.16 含量測定 取15批津力達顆粒（編號：S1～S15），依“2.3”項下方法制備津力達顆粒供試品溶液，再按照“2.1”項下方法進樣分析，分別運用外標法（ESM）和一測多評（QAMS）法計算津力達顆粒中各成分的含量，并采用t檢驗比較兩種方法所得結果，差異無統計學意義（P＞0.05）。（見表7）

表2 津力達顆粒中各成分的f

表3 不同儀器及色譜柱對f的影響

表4 不同流速對f的影響

表5 不同柱溫對f 的影響

表6 儀器及色譜柱對t 的影響

表7 津力達顆粒中11 種成分含量測定結果（mg/g，n=3）

3 化學計量學方法分析津力達顆粒質量

3.1 聚類分析 采用組間聯接法，測度為歐氏距離，運用SPSS 26.0軟件對15批津力達顆粒含量數據進行聚類分析。結果顯示，15批津力達顆粒供試品聚為3類，S1、S3、S2、S4聚為第Ⅰ類，S9、S10、S6、S7、S8、S5 聚為第Ⅱ類，S11、S15、S12、S14、S13聚為第Ⅲ類。（見圖2）

3.2 主成分分析 將表7中QAMS法所測得11種成分含量數據導入SPSS 26.0統計軟件及微生信在線作圖系統（www.bioinformatics.com.cn），進行主成分分析。表8顯示前3個主成分特征值為7.303、1.168、1.074（均＞1），對方差的貢獻率分別為66.389%、10.616%、9.760%，累計方差貢獻率為86.765%（＞85%），表明前3個主成分即可代表津力達顆粒86.765%的質量信息。表9顯示人參皂苷Rb1、人參皂苷Rb3、人參皂苷Rd、3′-羥基葛根素、葛根素、3'-甲氧基葛根素、毛蕊花糖苷、焦地黃苯乙醇苷B1和蒼術素對第一主成分的貢獻度較大；白術內酯Ⅱ在第二主成分有明顯正負荷值；蒼術素醇對第三主成分影響較大。圖3顯示15批津力達顆粒聚為3類，S1～S4聚為第Ⅰ類，S5～S10聚為第Ⅱ類，S11～S15聚為第Ⅲ類，與聚類分析結果一致。

表8 主成分特征值和貢獻率

表9 成分矩陣表

4 討 論

4.1 指標性成分及內參物的選擇 津力達顆粒由人參、黃精、麥冬、葛根、生地黃、炒蒼術、苦參、制何首烏等17味中藥材加工而成。方中人參補氣固脫，補脾益肺，生津養血，為其君藥；炒蒼術燥濕健脾，黃精補氣養陰、健脾益腎，苦參清熱燥濕，三藥合用，養脾陰、化脾濕、瀉脾熱、運脾氣，共為臣藥；生地黃、麥冬養陰生津，制何首烏補肝腎、益精血，山茱萸補腎澀精，茯苓滲濕健脾，佩蘭芳香醒脾，黃連、知母清熱瀉火、滋陰潤燥，炙淫羊藿扶腎陽、溫脾土，丹參祛瘀生新、調經順脈，地骨皮涼血除蒸，合為佐藥；葛根生津止渴、升陽通經、引經上升，荔枝核行氣散結、調暢氣機，使益氣滋陰之藥直達病所，為使藥。諸藥共奏益氣養陰、健脾運津之效。人參皂苷Rb1、人參皂苷Rb3和人參皂苷Rd等皂苷類成分為君藥人參主要藥效成分，同時臣藥黃精、佐藥麥冬亦含人參皂苷Rb1等皂苷類成分。現代藥理研究表明人參皂苷Rb1可通過JNK信號通路改善糖尿病大鼠肝損傷及糖脂代謝異常，降低炎癥反應[26]；人參皂苷Rb3可以明顯抑制HepG2細胞肝糖異生途徑關鍵轉錄因子FOXO1和HNF4α蛋白表達，從而抑制磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶和葡萄糖-6-磷酸酶的酶活性及糖異生作用，以達到降低血糖的目的[27]。蒼術素醇、白術內酯Ⅱ和蒼術素等為臣藥炒蒼術的主要活性成分。現代研究表明蒼術具有顯著的降糖增效作用[28]。毛蕊花糖苷和焦地黃苯乙醇苷B1為佐藥地黃的特征成分。現代藥理研究表明毛蕊花糖苷可能通過下調鋅指轉錄因子1的表達，抑制機體的過度免疫應激從而抑制上皮細胞-間質轉化，從而延緩糖尿病腎臟功能惡化[29]。3′-羥基葛根素、葛根素和3'-甲氧基葛根素等為佐藥粉葛代表性成分。現代藥理研究表明葛根素通過激活GLP-1R/Wnt/mTOR信號通路，改善海馬神經可塑性，從而改善高脂誘導的糖尿病小鼠抑郁癥狀[30]。故本研究參考中藥質量標志物選取原則，以君藥人參所含成分為首選，同時兼顧臣藥黃精和炒蒼術，佐藥麥冬和生地黃，以及使藥葛根所含上述11種成分為定量控制目標成分，同時選取質量穩定、價格較低、含量較高且出峰時間適中的葛根素為內參物。

4.2 流動相的選擇 本研究首先比較了乙腈-水、甲醇-水對津力達顆粒供試品檢測的影響。結果表明，發現甲醇-水系統檢測時，基線嚴重漂移，目標成分不能正常積分，且檢測用時較長；乙腈-水系統檢測時，色譜峰葛根素峰出現拖尾現象，與3'-甲氧基葛根素峰不能分離，通過調節柱溫、流速、更換色譜柱等條件均不能改善此現象，考慮流動相中加入酸類溶液以改善峰形，進而對乙腈-0.1%磷酸、乙腈-0.2%磷酸、乙腈-0.1%甲酸流動相體系進行考察。發現使用乙腈-0.2%磷酸流動相時，各成分可以獲得更好的響應值與分離度，且基線相對平穩，故選用乙腈-0.2%磷酸為流動相。

4.3 提取溶劑與方式的選擇 津力達顆粒組方復雜，所含成分繁多。為較全面反映所含化學成分信息，本試驗在供試品溶液制備時，以甲醇和乙醇為溶劑，采用操作簡便的振蕩提取，依法進樣檢測提取樣品。結果顯示，以甲醇為溶劑時，指標成分提取效果較好。故本試驗考察了振蕩、超聲和加熱回流，不同的提取時間（30、40、50、60 min），同時摸索了甲醇溶液的濃度（25%、50%、80%、100%）。結果顯示，以50%甲醇超聲提取30 min為供試品溶液制備方法時，指標成分綜合提取效果最佳，雜質干擾較小。

4.4 含量測定結果及化學計量學評價分析 15批津力達顆粒所含人參皂苷Rb1、人參皂苷Rb3、人參皂苷Rd、3′-羥基葛根素、葛根素、3'-甲氧基葛根素、毛蕊花糖苷、焦地黃苯乙醇苷B1、蒼術素醇、白術內酯Ⅱ和蒼術素含量存在一定的批間差異，尤其是葛根素、蒼術素醇、人參皂苷Rb1等成分較為顯著，表明建立津力達顆粒多指標成分質控模式對穩定該制劑產品質量具有重要意義；同時高效液相一測多評法與外標法所得含量結果無明顯差異（P＞0.05），表明本研究所建立的HPLC-QAMS法結果可靠，可用于津力達顆粒中11種成分含量的同時測定；聚類分析和主成分分析結果顯示，15批津力達顆粒聚為3類，聚類結果與產品生產期間存在一定的關聯性，有助于藥品生產企業不斷完善原藥材種屬來源、產地初加工等直接影響產品質量的源頭控制，以及生產過程質量控制，為穩定該制劑產品質量提供了參考依據。

本研究采用HPLC-QAMS法同時測定了津力達顆粒中人參皂苷Rb1、人參皂苷Rb3、人參皂苷Rd、3′-羥基葛根素、葛根素、3'-甲氧基葛根素、毛蕊花糖苷、焦地黃苯乙醇苷B1、蒼術素醇、白術內酯Ⅱ和蒼術素含量，建立了津力達顆粒多指標成分質控方法，同時對15批次樣品進行了含量測定。所建立的方法操作便捷、數據結果準確。同時本研究采用聚類分析和主成分分析等化學計量學方法對檢測結果進行了評價分析，可為進一步提升津力達顆粒質控水平，優化產品質量，確保臨床用藥療效一致性及合理指導臨床用藥提供支持。