鐵包金按摩膏聯合刮法對膝骨關節炎模型兔關節軟骨IL-1β、TNF-α及A20蛋白表達的影響*

熊 杰，匡浩銘，鐘秀遠，陳杰，沉琳玲，戎寬，匡建軍,3

（1.湖南中醫藥大學，湖南 長沙 410208；2.湖南省中醫藥研究院，湖南 長沙 410000；3.湖南中醫藥高等專科學校，湖南 株洲 412012）

膝骨關節炎（knee osteoarthritis，KOA）為臨床常見病[1]，其癥狀主要為膝關節腫脹、疼痛、活動障礙等。單純西醫治療該病效果欠佳，且無法緩解患者的伴隨癥狀。隨著對中醫藥治療KOA的深入研究，加之中醫藥治療該病有“簡、效、廉”的優點，應用中醫藥防治KOA越來越受到重視。藥刮療法具有顯著的中醫特色，對骨科疾病防治有較好的作用[2]。課題組前期臨床研究證明，鐵包金按摩膏聯合刮法治療不同部位的骨關節炎均有較好的療效。鐵包金藥物刮痧治療肩周炎的總有效率為92.50%（37/40）[3]。鐵包金按摩膏藥刮法治療膝骨關節炎的總有效率為86.67%（26/30）[4]。但其作用機制不明確，限制了其在臨床的進一步推廣與運用。本實驗以膝骨關節炎實驗兔為模型，探索鐵包金按摩膏聯合刮法對實驗兔膝關節軟組織中A20表達的影響，以探究鐵包金按摩膏聯合刮法的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 6個月齡健康新西蘭實驗兔40只，普通級，雌雄各半，體質量2.0～2.5 kg，購自湖南省中醫藥研究院實驗動物中心，生產許可證號：SCXK（湘）2020-0005。實驗兔飼養于開放式動物飼養室（湖南省中醫藥研究院動物房），室溫控制在20～25 ℃，濕度50%～60%，12 h/12 h明暗周期，標準營養顆粒飼料喂養，自由飲水。動物日常護理及實驗條件均符合《中華人民共和國實驗動物環境及設施標準》。實驗方案得到湖南省中醫藥研究院實驗倫理委員會批準。

1.2 藥物與試劑 鐵包金按摩膏由湖南省中醫藥研究院制劑室生產，方藥組成：鐵包金50 g，大黃50 g，川烏25 g，草烏25 g，木瓜25 g，白芷25 g，木鱉子25 g，三棱25 g，莪術25 g，血竭10 g，木通25 g，當歸25 g，肉桂25 g，赤芍25 g，透骨草25 g，乳香25 g，沒藥25 g，洋金花10 g。中藥材均采購于康美藥業股份有限公司，經湖南省中醫藥研究院附屬醫院藥劑科胥新元主任藥師鑒定均為2020年版《中華人民共和國藥典》收錄正品。木瓜蛋白酶（美國Genview公司，批號：GX-6024）；腫瘤壞死因子-α ELISA檢測試劑盒（北京百奧萊博科技有限公司，批號：ARB13479）；白細胞介素-1β ELISA檢測試劑盒（南京森貝伽生物科技有限公司，批號：SBJ-R0024）；RIPA裂解液（中國長沙維世爾生物，批號：RA19060）；兔抗鼠A20（英國abcam公司，批號：AB9234）。

1.3 主要儀器 TS-92型搖床（江蘇其林貝爾儀器制造有限公司）；DYY-6C型恒溫箱（北京六一生物科技有限公司）；M199型切片刀（德國徠卡顯微系統股份有限公司）；YD-315型切片機（浙江金華益迪醫療設備有限公司）；BMJ-A型包埋機（常州中威電子儀器）；BA210T顯微鏡（麥克奧迪實業集團有限公司）；H1650R型臺式冷凍離心機（湖南湘儀離心機有限公司）；DYY-6C型電泳儀、DYCZ-24DN型電泳槽、DYCZ-40D型轉膜儀均購自北京六一生物科技有限公司；GL-88B型旋渦混合器（江蘇其林貝爾儀器制造有限公司）；JB-13型磁力攪拌器、PHS-3C型精密pH計均購自中國雷磁；BioPrep-24型生物樣品均質儀（杭州奧盛儀器有限公司）。

1.4 造模與分組 采用隨機數字表法從40只實驗兔中選出8只（雌雄各半）作為正常組，僅常規飼養，不做處理。其余32只實驗兔制作兔KOA模型。具體操作：分別將0.5 mL的2%木瓜蛋白酶水溶液于實驗開始第1、4、7天注入實驗兔右后肢膝關節腔進行造模[5]。造模結束1周后，進行膝關節Lequesne MG評分[6]，總分≥4分表示造模成功。造模成功后再將32只實驗兔采用隨機數字表法分成模型組、刮法組、涂擦組、藥刮組，每組8只（雌雄各半）。

1.5 實驗給藥 各組實驗兔均常規飼養。根據《中藥藥理實驗方法學》中計算外用藥物等效劑量的方法，計算出涂擦組、藥刮組鐵包金按摩膏劑量為6.25 g/kg。造模后1周開始給藥，藥刮組實驗兔在固定狀態下，腿部剃毛，涂上約12.5 g鐵包金按摩膏后用特制牛角刮痧板沿肢體方向繞膝關節部順時針以約70次/min的頻率刮痧，約3 min或刮至皮膚微發紅；刮法組實驗兔在固定狀態下，以純凈水保持潤滑的前提下只行刮法，具體方法同藥刮法；涂擦組實驗兔在固定狀態下，腿部剃毛，涂上約12.5 g鐵包金按摩膏。以上3組每周周一、周三、周五的09:00:00進行干預，連續給藥4周。正常組、模型組實驗兔進行常規飼養，不予干預。

1.6 觀察指標

1.6.1 膝關節Lequesne MG評分 實驗過程中觀察記錄各組實驗兔的體毛色澤、飲食情況、活動量及精神狀態等。末次給藥結束后1 d，使用Lequesne MG的膝關節級別評估方法評估各組實驗兔右膝關節局部反應、步態改變、關節活動范圍及腫脹程度等情況。評分標準見表1。

表1 Lequesne MG 評分標準

1.6.2 Mankin評分 末次給藥結束后1 d，空氣栓塞法處死實驗兔[7]，打開關節腔觀察膝關節軟骨關節面的形態學改變、滑膜狀態、關節腔積液情況、關節軟骨狀態。采集各組實驗兔部分膝關節軟骨并制成切片，行番紅O-固綠軟骨染色法后，光鏡下觀測已切片、染色的內、外髁的軟骨，按Mankin評分標準對表層軟骨細胞分裂增生程度、細胞排列情況、染色程度、潮線及血管翳生成情況進行評分，并拍攝照片。評分標準見表2。

表2 Mankin 評分標準

1.6.3 軟骨組織中炎癥因子水平 末次給藥結束后1 d，取出-70 ℃保存的軟骨組織，在1 mg軟骨組織中添加9 mg/L的生理鹽水，置于勻漿器內制備勻漿液，5 000 g離心10 min后，收集上清液，利用ELISA試劑盒檢測TNF-α、IL-1β水平。

1.6.4 軟骨組織中A20表達水平 取軟骨組織，將50 mg軟骨組織放入研磨皿中裂解，將勻漿組織液12 000 g離心3 min，取上清液，95℃煮沸10 min變性，-20 ℃保存。采用BCA法檢測蛋白濃度。取20 μL蛋白樣品，加入5 μL的蛋白上樣緩沖液（6×）混勻，加熱5 min后冷卻；按預定的順序上樣、恒壓電泳，將目的蛋白轉移至PVDF膜上，脫脂牛奶封閉1 h，加入稀釋的一抗（兔抗鼠A20，稀釋度為1∶2 000）4 ℃孵育過夜；加入二抗羊抗兔IgG（稀釋度為1∶6 000）室溫孵育1 h，以β-actin為內參；ECL顯影、曝光。最后掃描曝光后底片，用Quantity One專業灰度分析軟件進行分析。

1.7 統計學方法 采用SPSS 26.0統計軟件進行分析，計量資料以“均數±標準差”（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 各組兔膝關節Lequesne MG評分比較 與正常組比較，模型組、刮法組、涂擦組及藥刮組兔膝關節Lequesne MG評分均明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，刮法組、涂擦組及藥刮組兔膝關節Lequesne MG評分均明顯降低（P＜0.05）；刮法組兔膝關節Lequesne MG評分與涂擦組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；藥刮組兔膝關節Lequesne MG評分明顯低于刮法組、涂擦組（P＜0.05）。（見表3）

表3 各組實驗兔膝關節Lequesne MG 評分比較（，分）

表3 各組實驗兔膝關節Lequesne MG 評分比較（，分）

注：與正常組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與刮法組比較，cP＜0.05；與涂擦組比較，dP＜0.05

2.2 各組兔膝關節軟骨病理學改變情況 正常組兔膝關節軟骨細胞分布均勻，呈紅染；模型組兔膝關節軟骨細胞分布不均勻，呈藍染；刮法組兔膝關節軟骨細胞分布欠均勻，呈紅藍相間染色；涂擦組兔膝關節軟骨細胞分布欠均勻，呈淡紅染；藥刮組兔膝關節軟骨細胞分布較均勻，呈紅染。（見圖1）

與正常組比較，模型組、刮法組、涂擦組及藥刮組兔膝關節軟骨Mankin評分均明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，刮法組、涂擦組及藥刮組兔膝關節軟骨Mankin評分均明顯降低（P＜0.05）；刮法組兔膝關節軟骨Mankin評分與涂擦組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；藥刮組兔膝關節軟骨Mankin評分明顯低于刮法組、涂擦組（P＜0.05）。（見表4）

表4 各組兔膝關節軟骨組織Mankin 評分比較（,分）

表4 各組兔膝關節軟骨組織Mankin 評分比較（,分）

注：與正常組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與刮法組比較，cP＜0.05；與涂擦組比較，dP＜0.05

2.3 各組兔膝關節軟骨組織中TNF-α、IL-1β水平比較 與正常組比較，模型組、刮法組、涂擦組及藥刮組兔膝關節軟骨組織中TNF-α、IL-1β水平均明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，刮法組、涂擦組及藥刮組兔膝關節軟骨組織中TNF-α、IL-1β水平均明顯降低（P＜0.05）；刮法組兔膝關節軟骨組織中TNF-α、IL-1β水平與涂擦組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；藥刮組兔膝關節軟骨組織中TNF-α、IL-1β水平明顯低于刮法組、涂擦組（P＜0.05）。（見表5）

表5 各組兔膝關節軟骨組織中TNF-α、IL-1β水平比較（，ng/L）

表5 各組兔膝關節軟骨組織中TNF-α、IL-1β水平比較（，ng/L）

注：與正常組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與刮法組比較，cP＜0.05；與涂擦組比較，dP＜0.05

2.4 各組兔膝關節軟骨組織中A20蛋白表達水平比較 與正常組比較，模型組、刮法組、涂擦組及藥刮組兔膝關節軟骨組織中A20表達均明顯下調（P＜0.05）；與模型組比較，刮法組、涂擦組及藥刮組兔膝關節軟骨組織中A20表達均明顯上調（P＜0.05）；刮法組兔膝關節軟骨組織中A20表達水平與涂擦組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；藥刮組兔膝關節軟骨組織中A20表達明顯高于刮法組、涂擦組（P＜0.05）。（見圖2、表6）

表6 各組兔膝關節軟骨組織中A20 蛋白表達水平比較（）

表6 各組兔膝關節軟骨組織中A20 蛋白表達水平比較（）

注：與正常組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與藥刮組比較，cP＜0.05

3 討 論

KOA的發病機制復雜，一般認為與遺傳、肥胖、勞動過度等因素密切相關，但其具體發病機制尚不明確，近年來炎癥因子等介質的表達成為主流學說之一。研究發現IL-1β和TNF-α表達的增加在KOA患者疾病發生發展的過程中起著重要作用[8]。IL-1β作為IL-1的一種亞型，是炎癥調節的起始因素。IL-1β通過與軟骨細胞膜上的IL-1受體相結合，干擾軟骨細胞的正常代謝活動；同時可刺激軟骨細胞及滑膜合成基質金屬蛋白酶，使軟骨基質內溶解蛋白分子的酶類數量增多，從而間接增強了對軟骨細胞的破壞。TNF-α可作用于軟骨細胞，阻止基質大分子如蛋白多糖的生成，刺激軟骨降解酶如中性蛋白酶的生成、分泌，增加軟骨聚蛋白多糖的分解，從而誘發關節軟骨破壞。且IL-1β與TNF-α可相互協同裂解蛋白多糖及降解膠原片段，促進軟骨基質剝脫于骨質而暴露[9]，從而加重關節炎癥反應。核因子-κB（nuclear factorκB，NF-κB）是細胞內一條重要信號通路，對于維持細胞的正常生理功能具有重要意義。其廣泛參與炎癥反應的調節，是導致KOA發生發展的關鍵環節[10-11]。而鋅指蛋白A20可降低NF-κB抑制蛋白激酶復合物活性、抑制NF-κB抑制蛋白磷酸化過程，干預NF-κB激活合成釋放，影響下游炎癥通路[12-13]，從而影響KOA的疾病進程。

KOA現代中醫命名為膝痹，《素問·痹論篇》有相關原文記載。現代研究亦認為骨關節痹證多為風寒濕邪乘虛襲入骨節所致[14]。寒性凝滯，濕性重著，故易引起局部氣血運行不暢，邪氣聚于骨節、肌肉、經脈，以致痰瘀，瘀則不通，不通則痛。中醫治法則以祛風除濕、散寒止痛、活血通絡等為主。

鐵包金按摩膏[15]是匡建軍臨床近三十年的經驗膏方，君藥為鐵包金，《中華本草》謂其根、莖、葉入藥有祛風除濕、活血止痛的功效。鐵包金主要含有黃酮、苷類、木脂素、醌類及二聚體等化學成分。藥理研究表明其根與藤莖的提取物具有較好的保肝和清除自由基的生物活性[16]。川烏、草烏為臣藥，具有祛風散寒除濕的功效。烏頭中的烏頭堿具有顯著抗炎、鎮痛作用[17-18]。肉桂亦為臣藥，能夠溫中補腎、散寒止痛，《本草綱目》謂其能堅筋骨、通血脈、導百藥。肉桂揮發油主要成分桂皮醛有明顯的擴張皮膚血管作用，可增加體表血流，升高體表溫度[19]。木瓜為佐藥，能舒筋活絡、祛風除痹，是治療筋脈拘急的要藥。木瓜中的多糖能夠抗炎、抗氧化[20]。木鱉子亦為佐藥，能消腫散結。木鱉子皂苷有抗炎作用[21]。諸藥共奏祛風除濕、活血通絡止痛之功效。刮法是中醫特色療法之一，通過刮法的物理作用，溫通局部腠理、脈絡[22]，再加以膏藥，增強藥物吸收的同時，加強療效。

本研究結果顯示鐵包金按摩膏聯合刮法可以改善KOA模型兔膝骨關節炎的癥狀，降低Lequesne MG、Mankin評分及軟骨組織TNF-α、IL-1β的水平，提高實驗兔膝關節軟骨組織中A20的表達，為鐵包金按摩膏聯合刮法治療KOA提供了實驗。其作用機制可能與抑制TNF-α、IL-1β表達和促進A20蛋白表達有關。但鐵包金按摩膏成分復雜，其有效成分及具體作用機制需進一步探索研究。