菟絲子總黃酮對PCOS大鼠血清甲狀腺激素、排卵障礙的影響及機制研究*

趙千影，汪棟材，吳海濱，林基偉，宋曉容

（深圳市中醫院，廣東 深圳 518000）

多囊卵巢綜合征（polycystic ovarian syndrome，PCOS）是臨床常見的內分泌紊亂疾病，多發于育齡期及青春期女性[1]。流行病學調查顯示，我國PCOS發病率為5%～10%，且呈上升趨勢。PCOS可在早期影響患者生殖及內分泌系統，造成其不孕，后期則易誘發高胰島素血癥、子宮內膜癌、糖尿病、心腦血管疾病等并發癥[2]。口服避孕藥是目前臨床治療PCOS的首選方法，可調節月經周期、增加排卵，以恢復生育能力，但對部分患者效果并不理想，且易加重胰島素抵抗[3]。菟絲子總黃酮是中藥菟絲子的主要活性成分之一，具有抗癌、抗氧化、提升免疫力、保肝、調節生殖系統功能等多種藥理活性[4]。有研究[5]表明，菟絲子總黃酮可增加卵巢質量及卵泡數量、提高雌激素水平、提升卵巢功能，從而對卵巢早衰大鼠產生治療作用，但關于其對PCOS甲狀腺功能的影響及排卵障礙的治療作用研究尚少，且缺乏對應的機制研究。本研究通過建立PCOS大鼠模型，觀察菟絲子總黃酮對PCOS大鼠的治療作用，并探討其相關機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 7周齡雌性SPF級SD大鼠45只，體質量（170±10）g，健康狀況良好，購自北京科宇動物養殖中心，生產許可證號：SCXK（京）2018-0010。飼養于清潔、通風環境，溫度23 ℃左右，濕度60%左右，明暗周期12 h/12 h循環。本研究過程中處理動物時均符合2006年中華人民共和國科技部頒布的《關于善待實驗動物的指導性意見》，并經本院實驗動物倫理委員會批準。

1.2 藥物與試劑 菟絲子總黃酮（陜西昂威生物醫藥科技有限公司，批號：20090912）；絲裂原活化蛋白激酶（mitogenactivated protein kinase，MAPK）/細胞外信號調節激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）通路激動劑表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF）（北京華越洋生物科技有限公司，批號：62253-63-8）；脫氫表雄酮（dehydroepiandrosterone，DHEA）（上海滬震實業有限公司，批號：DKO124）；促甲狀腺激素（thyroid stimulating hormone，TSH）放射免疫試劑盒（批號：E-EL-R0976c）、游離三碘甲腺原氨酸（free triiodothyronine，FT3）放射免疫試劑盒（批號：E-EL-0079c）、游離甲狀腺素（free thyroxine，FT4）放射免疫試劑盒（批號：E-EL-0122c）均購自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司；三碘甲腺原氨酸（triiodothyronine，T3）放射免疫試劑盒（批號：SP12617）、甲狀腺素（thyroxine，T4）放射免疫試劑盒（批號：SP12618）、促卵泡生長激素（follicle stimulating hormone，FSH）微粒子酶免疫試劑盒（批號：SP12603）、黃體生成激素（luteinizing hormone，LH）微粒子酶免疫試劑盒（批號：SP12626）、雌二醇（estradiol，E2）微粒子酶免疫試劑盒（批號：SP12610）均購自武漢賽培生物科技有限公司；空腹胰島素（fasting serum lisulin，FINS）放射免疫試劑盒（中國臺灣Abnova公司，批號：KA3811）；兔抗大鼠p38 MAPK一抗（批號：ab221012）、兔抗大鼠p-p38 MAPK一抗（批號：ab284564）、兔抗大鼠ERK1/2一抗（批號：ab176640）、兔抗大鼠p-ERK1/2一抗（批號：ab126445）均購自美國Abcam公司。

1.3 主要儀器 CX33顯微鏡（日本奧林巴斯株式會社）；AIA-1800全自動熒光磁微粒酶免疫分析儀（日本東曹株式會社）；Gel SMART凝膠成像儀[大龍興創實驗儀器（北京）股份公司]。

1.4 造模與分組 35只大鼠建立PCOS模型。大鼠適應性飼養3 d后，頸背部皮下注射0.2 mL DHEA大豆油混合液（劑量：DHEA 60 mg/100 g體質量），1次/d，持續20 d，每日早上觀察陰道涂片，若連續兩個動情周期上皮細胞均未角化，則表明動情周期混亂，PCOS模型構建成功[6]。PCOS模型復制成功31只，采用隨機數字表法分為PCOS組（11只）、干預組（10只）、聯合組（10只）；另取10只正常大鼠注射0.2 mL大豆油，其余方法相同，設為對照組。

1.5 實驗給藥 確認建模成功次日，聯合組大鼠灌胃菟絲子總黃酮生理鹽水懸濁液（200 mg/kg）[7]，2 h后尾靜脈注射EGF PBS溶液（10 μg/kg）[8]；干預組大鼠灌胃菟絲子總黃酮生理鹽水懸濁液（200 mg/kg），2 h后尾靜脈注射等量PBS；對照組、PCOS組大鼠灌胃等體積生理鹽水，2 h后尾靜脈注射等量PBS，1次/d，持續21 d。

1.6 觀察指標 末次干預后，腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉大鼠，腹主動脈采血，4 ℃下3 000 r/min離心10 min（離心半徑8 cm），將獲取血清分成兩份，4 ℃冰箱保存，分別用于甲狀腺激素檢測及血糖指標檢測；采血后頸椎脫臼處死大鼠，開腹取其雙側卵巢，切取部分卵巢組織，一半固定于4%多聚甲醛24 h，脫水、透明、浸蠟、包埋，切為4 μm連續病理切片，用于HE染色，另一半投入液氮中保存，用于蛋白檢測。

1.6.1 血清甲狀腺激素水平 取4 ℃保存血清，采用放射免疫分析法檢測血清TSH、FT3、FT4、T3、T4水平，根據試劑盒說明書設計實驗步驟，計算血清TSH、FT3、FT4、T3、T4水平。

1.6.2 血清性激素水平 取4 ℃保存血清，采用微粒子酶免疫分析法及全自動熒光磁微粒酶免疫分析儀檢測FSH、LH、E2水平。

1.6.3 血清FINS、HOMA-IR 取4 ℃保存血清，經血糖儀檢測空腹血糖（fasting blood glucose，FBG）、放射免疫試劑盒檢測FINS，計算胰島素抵抗指數（homeostasis model assessment for insulin resistance，HOMA-IR）。HOMA-IR=FBG×FINS/22.5。

1.6.4 HE染色觀察卵巢組織病理學改變及排卵情況 取卵巢組織切片，二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化，移入蘇木精溶液浸泡8 min，自來水沖洗，鹽酸酒精分化液分化，自來水沖洗，促藍液反藍，移入伊紅溶液染色2 min，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，滴加中性樹脂封片，光鏡下觀察卵巢組織病理變化，記錄排卵數、囊樣擴張卵泡數。排卵率=有排卵大鼠數/該組大鼠數×100%。平均排卵數=黃體總數/該組大鼠數×100%。囊性擴張卵泡率=囊樣擴張卵泡總數/該組大鼠數×100%。

1.6.5 Western blotting法檢測卵巢組織p38 MAPK、p-p38 MAPK、ERK1/2、p-ERK1/2蛋白相對表達量 取液氮中保存的卵巢組織，剪碎并充分研磨，勻漿后加入RIPA液裂解細胞，移至離心管內，低溫離心機9 000 r/min離心15 min（離心半徑10 cm），經BCA試劑盒定量蛋白。取40 μg蛋白樣本，以1∶4的體積比混合上樣緩沖液，80 V電壓下行凝膠電泳分離，濕法轉至硝酸纖維素膜，5%脫脂牛奶封閉2 h，TBST清洗，混合工作濃度1∶500的兔抗大鼠p38 MAPK、p-p38 MAPK、ERK1/2、p-ERK1/2一抗，4 ℃搖床孵育過夜，TBST清洗，加入二抗（1∶2 000）混勻，室溫孵育40 min，ECL發光，暗盒顯影，采用凝膠成像分析儀分析蛋白條帶灰度值，p38 MAPK、p-p38 MAPK、ERK1/2、p-ERK1/2蛋白相對表達量分別為p38 MAPK、p-p38 MAPK、ERK1/2、p-ERK1/2蛋白條帶灰度值與內參GAPDH條帶灰度值的比值。計算p-p38 MAPK/p38 MAPK、p-ERK1/2/ERK1/2。

1.7 統計學方法 通過SPSS 23.0進行統計學分析，計量資料以（）表示，多樣本資料比較用單因素方差分析，以LSD-t行兩兩比較。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 各組大鼠血清甲狀腺激素指標比較 與對照組比較，PCOS組大鼠血清TSH水平明顯升高（P＜0.05），FT3、FT4、T3、T4水平均明顯降低（P＜0.05）；與PCOS組比較，干預組大鼠血清TSH水平明顯降低（P＜0.05），FT3、FT4、T3、T4水平均明顯升高（P＜0.05）；與干預組比較，聯合組大鼠血清TSH水平明顯升高（P＜0.05），FT3、FT4、T3、T4水平均明顯降低（P＜0.05）。（見表1）

表1 各組大鼠血清甲狀腺激素指標比較（）

表1 各組大鼠血清甲狀腺激素指標比較（）

注：與對照組比較，aP＜0.05；與PCOS組比較，bP＜0.05；與干預組比較，cP＜0.05

2.2 各組大鼠血清性激素水平比較 與對照組比較，PCOS組大鼠血清LH水平明顯升高（P＜0.05），FSH、E2水平均明顯降低（P＜0.05）；與PCOS組比較，干預組大鼠血清LH水平明顯降低（P＜0.05），FSH、E2水平均明顯升高（P＜0.05）；與干預組比較，聯合組大鼠血清LH水平明顯升高（P＜0.05），FSH、E2水平均明顯降低（P＜0.05）。（見表2）

表2 各組大鼠血清性激素水平比較（）

表2 各組大鼠血清性激素水平比較（）

注：與對照組比較，aP＜0.05；與PCOS組比較，bP＜0.05；與干預組比較，cP＜0.05

2.3 各組大鼠胰島素抵抗指標比較 與對照組比較，PCOS組大鼠FINS、HOMA-IR水平均明顯升高（P＜0.05）；與PCOS組比較，干預組大鼠FINS、HOMA-IR水平均明顯降低（P＜0.05）；與干預組比較，聯合組大鼠FINS、HOMA-IR水平均明顯升高（P＜0.05）。（見表3）

表3 各組大鼠胰島素抵抗指標比較（）

表3 各組大鼠胰島素抵抗指標比較（）

注：與對照組比較，aP＜0.05；與PCOS組比較，bP＜0.05；與干預組比較，cP＜0.05

2.4 各組大鼠卵巢組織病理改變情況 對照組大鼠卵巢組織中可觀察到處于不同發育階段的卵泡，黃體數量較多，卵泡囊性擴張極少；PCOS組大鼠卵巢結構紊亂，可觀察到較多卵泡囊性擴張，竇前卵泡、閉鎖卵泡數量增加，發育期卵泡與黃體數量明顯減少；與PCOS組比較，干預組、聯合組大鼠卵巢結構有所改善，可觀察到卵泡囊性擴張，以及一定數量的發育期卵泡及黃體，竇前卵泡、閉鎖卵泡數量有所減少，其中干預組改善效果優于聯合組。（見圖1）

2.5 各組大鼠排卵情況比較 與對照組比較，PCOS組大鼠排卵率明顯降低（P＜0.05），平均排卵數明顯減少（P＜0.05），囊性擴張卵泡率明顯升高（P＜0.05）；與PCOS組比較，干預組大鼠排卵率明顯升高（P＜0.05），平均排卵數明顯增加（P＜0.05），囊性擴張卵泡率明顯降低（P＜0.05）；與干預組比較，聯合組大鼠排卵率明顯降低（P＜0.05），平均排卵數明顯減少（P＜0.05），囊性擴張卵泡率升高（P＜0.05）。（見表4）

表4 各組大鼠排卵情況比較（）

表4 各組大鼠排卵情況比較（）

注：與對照組比較，aP＜0.05；與PCOS組比較，bP＜0.05；與干預組比較，cP＜0.05

2.6 各組大鼠卵巢組織p-p38 MAPK/p38 MAPK、p-ERK1/2/ERK1/2比較 與對照組比較，PCOS組大鼠卵巢組織p-p38 MAPK/p38 MAPK、p-ERK1/2/ERK1/2明顯升高（P＜0.05）；與PCOS組比較，干預組大鼠卵巢組織p-p38 MAPK/p38 MAPK、p-ERK1/2/ERK1/2明顯降低（P＜0.05）；與干預組比較，聯合組大鼠卵巢組織p-p38 MAPK/p38 MAPK、p-ERK1/2/ERK1/2明顯升高（P＜0.05）。（見表5、圖2）

表5 各組大鼠卵巢組織p-p38 MAPK/p38 MAPK、p-ERK1/2/ERK1/2 比較（）

表5 各組大鼠卵巢組織p-p38 MAPK/p38 MAPK、p-ERK1/2/ERK1/2 比較（）

注：與對照組比較，aP＜0.05；與PCOS組比較，bP＜0.05；與干預組比較，cP＜0.05

3 討 論

PCOS是由下丘腦-垂體-卵巢軸代謝紊亂引起的非器質性疾病，臨床表現為月經周期紊亂、排卵異常、胰島素抵抗、高雄激素血癥等，以雙側卵巢纖維化多囊性變，體積增大，膜下出現囊性擴張卵泡為主要病理改變[9]。肥胖、月經周期延長、缺乏運動、不良飲食習慣、母親孕期健康不佳等均是PCOS的危險因素，目前其發病機制尚未被完全闡明，多認為與胰島素抵抗、下丘腦內分泌失調、甲狀腺功能異常、遺傳及環境因素等相關，其中胰島素抵抗機制被更多學者認可[10]。甲狀腺激素可發揮胰島素拮抗作用，其水平異常可影響促性腺激素活性，促使卵巢增大，加速PCOS發病，胰島素抵抗加重可提升黃體生成素及雄激素水平，降低卵泡刺激素活性，從而減少排卵數量[11-12]。因此，尋找調節甲狀腺激素同時降低胰島素抵抗的新型治療手段，對于PCOS治療具有積極意義。

中醫學將PCOS歸于“月經不調”“閉經”“不孕”等范疇，認為“沖任起于胞宮，隸屬肝腎”。本病主要病機為稟賦不足、后天失養、腎陽不足、肝氣郁結、逆行犯脾，以致精血不足、血失流暢、任沖不通、天癸不至、胞宮虛寒、無血可下，子宮無法攝精成孕，終而發病。腎虛是其根本病因，故治療應以補腎填精、活血化瘀為主[13]。中藥菟絲子又稱豆寄生，是臨床常用補腎藥材，取自雙子葉寄生植物菟絲子干燥成熟種子，性平，味辛、甘，歸肝經、腎經、脾經，可補腎、固精、止瀉、明目。唐代名家甄權言其可治虛冷，填精益髓，去腰疼膝冷。現代中醫著作《山東中藥》記載，菟絲子可治婦人習慣性流產[14]。菟絲子總黃酮是菟絲子中黃酮類化合物的總稱，作為一種植物雌激素，可在人體雌激素水平較低時表現類雌激素效應，在雌激素水平較高時表現抗雌激素效應，發揮其雌激素平衡作用[15]。有學者[16]認為，菟絲子總黃酮可修復子宮內雙酚A誘導的小鼠后代卵巢功能障礙，提升促卵泡激素水平，促進排卵。本研究結果顯示，與PCOS組比較，干預組大鼠血清TSH、LH、FINS、HOMA-IR水平及囊性擴張卵泡率明顯降低，FT3、FT4、T3、T4、FSH、E2水平及排卵率明顯升高，平均排卵數明顯增加，提示菟絲子總黃酮可改善PCOS大鼠甲狀腺激素及性激素水平，降低胰島素抵抗，促進排卵。

MAPK/ERK通路是胞外至胞核信息傳遞的重要通路之一，廣泛參與細胞增殖、遷移、分化等過程。p38 MAPK、ERK是該通路重要調節因子，均屬于MAPK家族。細胞外刺激激活p38 MAPK后，磷酸化的p38 MAPK可進入細胞核，激活下游酶蛋白引發酶促反應，激活ERK1/2，p-ERK1/2激活下游相關基因轉錄，降低胰島素受體底物活性，從而增加胰島素抵抗[17-18]。YE H等[19]研究認為，抑制MAPK/ERK通路可改善PCOS大鼠卵巢形態，提升促卵泡激素水平，減輕胰島素抵抗。本研究結果顯示，與對照組比較，PCOS組大鼠卵巢組織p-p38 MAPK/p38 MAPK、p-ERK1/2/ERK1/2均明顯升高，干預組大鼠卵巢組織p-p38 MAPK/p38MAPK、-ERK1/2/ERK1/2均明顯降低，且聯合組大鼠血清TSH、LH、FINS、HOMA-IR水平、囊性擴張卵泡率升高，FT3、FT4、T3、T4、FSH、E2水平、排卵率均明顯降低，平均排卵數減少，提示MAPK/ERK通路在PCOS中異常激活，菟絲子總黃酮可能通過調節該通路對PCOS產生治療作用。

綜上所述，菟絲子總黃酮可改善PCOS大鼠甲狀腺激素及性激素水平，降低胰島素抵抗，促進排卵。其作用機制可能與抑制MAPK/ERK通路有關。