光周期對雄性哺乳動物季節性精子發生的影響及其調控機制

楊 笛 陳婉依 宮澤儒 楊 明

(沈陽師范大學生命科學學院，沈陽，110034)

季節性繁殖是哺乳動物適應環境變化的一種策略，以最大限度地提高繁殖成功率。當周圍環境發生變化，如氣溫或食物供應等不再適宜動物的生長發育，會使動物的繁殖成功率顯著降低。光照周期是季節性繁殖的主要影響因子，也是動物預測未來環境變化的信號[1]。按照動物對不同季節日照周期長短的生殖反應差異，大致分為長日照繁殖和短日照繁殖。長日照繁殖的哺乳動物如小毛足鼠(Phodopusroborovskii)等，在春季日照時間逐漸延長的情況下發情并交配[2]；短日照繁殖的哺乳動物如綿羊(Ovisaries)等，隨著日照逐漸變短而進入生殖期，交配發生在秋季，幼崽出生在食物充足的春天[3]。

季節性繁殖的物種，雌性和雄性哺乳動物的繁殖策略不同。雌性哺乳動物的季節性繁殖策略主要是保證后代在食物資源豐富的季節出生，排卵后受孕及胚胎的發育情況是影響其生殖能力的關鍵。雄性哺乳動物的季節性繁殖策略是在繁殖期產生成熟的精子并成功交配，生殖能力與精子發生、性欲強弱以及交配能力等因素有關，其中精子發生對物種繁殖和延續非常重要。精子發生過程中，精原細胞的分裂和分化、精母細胞減數分裂及精子細胞變態等任何一個步驟的停滯，都無法產生成熟的精子，使最終的生殖水平下降[4-5]。

光周期是調節精子發生的主要環境因子[6]。季節性精子發生受控于精原細胞分化水平，繁殖期的雄性動物睪丸生精小管除支持細胞外，還含有精原細胞、精母細胞和精子細胞并具有明顯的管腔，附睪內有精子。非繁殖季節，高原鼢鼠(Eospalaxbaileyi)和長毛犰狳(Chaetophractusvillosus)的生精小管主要含有支持細胞和精原細胞[7-8]，高原鼠兔(Ochotonacurzoniae)和高原鼢鼠中還可見未分化型的精原細胞[7，9]，金色中倉鼠(Mesocricetusauratus)和伊比利亞鼴鼠(Talpaoccidentalis)的精子發生停滯在精母細胞階段[10-11]，大林姬鼠(Apodemusspeciosus)生精小管內只有精原細胞和大量凋亡的精母細胞[5]。

睪丸生精細胞的季節性變化是在復雜的神經和體液調節下實現的，褪黑激素介導的TSH-DIO2/DIO3-T3通路[1]和HPG軸—睪酮—視黃酸通路[9]可能是光周期調節季節性精子發生的主要機制。本文從光周期對繁殖的影響出發，分析雄性哺乳動物季節性繁殖的生理機制及其調節通路，了解季節性繁殖的發展規律，為動物的人工繁殖提供參考和支持。

1 光周期對哺乳動物繁殖的影響

光周期是許多野生嚙齒動物(Rodent)季節性繁殖的重要同步因子[12]。長日照繁殖動物如長尾小囊鼠(Perognathusformosus)和長爪沙鼠(Merionesunguiculatus)，在長光周期下雄性的睪丸發育和恢復受到刺激，睪丸質量明顯增加，睪丸體積和生精小管直徑更大；但在短光周期下表現出明顯的性腺退化，睪丸的發育和恢復受到抑制，生殖上皮細胞耗竭，生精小管直徑減小，隨后睪丸縮小繁殖停止，避免不利環境對其后代的影響[12-13]。短日照繁殖動物則表現為相反的變化，如和田羊在長日照條件下，睪丸表皮皺縮，生精小管之間界限明顯，管壁較薄且細胞層數少[14]。

許多對光周期敏感的哺乳動物都表現出明顯的睪丸大小與體內激素水平的年度周期變化。在器官水平上，與繁殖活躍的雄性相比，非繁殖期的雄性高原鼠兔的睪丸和附睪都明顯變小[9]；在激素水平上，季節性繁殖的哺乳動物在繁殖期血清褪黑激素含量下降，促性腺激素釋放激素(GnRH)、黃體生成素(LH)、睪酮含量顯著上升，非繁殖季節顯著下降[7]，如延長光照時間或增加光照強度會導致雄性金色中倉鼠睪酮含量顯著上升[15]；內蒙古絨山羊血清褪黑素和睪酮隨著光照周期的變化呈現季節性周期變化，短日照條件下褪黑激素和睪酮含量升高，長日照條件下變化則相反[16]。對季節性繁殖物種的研究表明，雄激素分泌的減少可能是導致季節性生殖細胞耗竭的激素信號[8]。

2 光周期影響繁殖的調控機制

2.1 光周期影響松果體褪黑激素的合成和分泌

哺乳動物季節性繁殖內在機制的研究主要集中在光周期調節通路上[17]，環境光周期信息會通過視網膜—視交叉上核(SCN)—松果體機制，調節動物的生理功能，即光周期信號通過視網膜感光細胞轉化為電信號，傳入視交叉上核的自主神經節細胞，通過多突觸連接傳遞到松果體中，松果體細胞合成和釋放褪黑激素的節律性形式將日照的長度變化轉為內分泌信號，啟動對繁殖活動的調控[3，17](圖1A)。在黑暗時段褪黑激素的合成和分泌增加，明亮的條件會抑制褪黑激素的分泌。因此，褪黑激素分泌的持續時間反映了日照時間和年光照周期的變化，但是物種之間的差異較大[18]。褪黑激素對不同動物繁殖產生的作用并不一定完全相同，在長日照動物中，褪黑激素會抑制繁殖，而在短日照動物中會對繁殖產生促進作用。也有些動物對日照的變化不敏感，褪黑激素對繁殖無作用[19]。

2.2 褪黑激素通過HPG軸影響季節性繁殖

褪黑激素通過下丘腦—垂體—性腺(hypothalamic-pituitary-gonadal，HPG)軸調節性腺生成配子、合成性腺激素[18]。光周期引起高原鼠兔松果體分泌褪黑激素傳遞到HPG軸，對繁殖期的高原鼠兔注射褪黑激素會引起睪丸質量下降，生精小管管腔縮小；對非繁殖期高原鼠兔注射褪黑激素受體拮抗劑，睪丸質量顯著增加，生精小管內可見各級生精細胞，精子發生恢復[20]。可見，褪黑激素能使長日照繁殖的雄性哺乳動物的生殖功能受到抑制。褪黑激素對短日照繁殖動物的作用與長日照動物相反，公羊在非繁殖季節春季和夏季松果體釋放的褪黑激素減少，精液質量和生育能力下降，這與下丘腦—垂體—睪丸軸的活動減少有關[16]。非繁殖季節給予外源性褪黑激素，可以逆轉公羊的激素水平，導致睪酮、雌二醇(E2)水平升高[21]，增加精子發生和提高生育能力[14，22]，表明褪黑激素是短日照動物繁殖的活性因子。

2.3 TSH-DIO2/DIO3-T3通路

褪黑激素可作用在垂體結節部促甲狀腺激素(TSH)細胞介導光周期信號，使TSH細胞產生季節性二相性轉變，改變促甲狀腺激素β(TSHβ)合成和分泌[23]。TSHβ通過逆行通路，作用于第三腦室內側室管膜伸長細胞的TSH受體(TSHR)，刺激垂體TSH細胞分泌TSH[24]。在長光周期下眼缺失基因3 (eyes absent 3，Eya3)表達增高，合成TSHβ[25]。對黑線倉鼠(Cricetulusbarabensis)的研究表明，TSHβ/TSHR與季節性繁殖有關，在長日照條件下，促進TSHβ/TSHR表達，短日照條件下抑制TSHβ/TSHR表達，外源注射褪黑激素也會抑制TSHβ/TSHR表達，并發生性腺退化，褪黑激素可能通過抑制TSHβ/TSHR系統來抑制黑線倉鼠的繁殖活動[26]。但對小鼠的研究表明，注射褪黑激素會誘導TSHβ的mRNA表達增加[27]。

TSH逆行與下丘腦第三腦室內側的室管膜伸長細胞的TSHR結合，刺激伸長細胞的旁分泌[24]，從而調節脫碘酶的表達。研究表明，光周期引起的脫碘酶變化調節了下丘腦甲狀腺激素的生物活性和有效性，在長光周期中，脫碘酶Ⅱ(DIO2)基因表達上調，DIO2使四碘甲腺原氨酸(T4)脫碘產生活性更高的三碘甲腺原氨酸(T3)，下丘腦局部T3水平提高(圖1B)；當處于短光周期時，DIO2表達下調，脫碘酶Ⅲ(DIO3)表達上調，靜脈注射TSH也會誘導室管膜細胞中的DIO2表達并降低DIO3表達[28]，DIO3的作用是使T3分解失活，下丘腦局部T3水平下降[29]。褪黑激素產生類似非繁殖期短光照的效果，導致鼠類的體質量下降、性腺抑制，如外源注射褪黑激素抑制布氏田鼠(Lasiopodomysbrandtii)的體質量和性腺發育，同時上調Dio3基因的表達[30]，說明褪黑激素信號是 TSH-DIO-T3級聯反應的主要調節因子。

2.4 T3通過HPG軸調節睪酮的分泌

T3是下丘腦GnRH脈沖分泌的有效調節因子之一[1，29]，下丘腦注射T3可以防止短日照條件下的西伯利亞倉鼠(Phodopussungorus)性腺退化和體質量減輕[31]。在GnRH刺激下，垂體產生并分泌的FSH和LH進入血液循環，前者對精原細胞的分化和增殖具有重要的作用，而后者作用于睪丸間質細胞分泌雄激素[5]，通過多種類固醇激素合成酶的持續影響，最終將游離的膽固醇逐步轉化形成睪酮[32](圖1C)。睪酮進入靶細胞內可直接或轉化為雙氫睪酮后與雄激素受體結合，作用于支持細胞和睪丸肌樣細胞來保證生精小管正常生長發育[33]。雄激素受體存在于間質細胞、支持細胞、肌樣細胞和血管壁平滑肌細胞，在睪丸的支持細胞中敲除雄激素受體會導致生精小管結構破壞、緊密連接消失以及精原干細胞減少[33]。睪酮在維持雄性生殖器官以及第二性征的發育中具有重要作用，有利于精子生成，使雄性動物保持較高的繁殖能力[32]。

2.5 睪酮對睪丸退化的影響

季節性繁殖使哺乳動物睪丸的結構和功能也發生變化[11]，在對伊比利亞鼴鼠和長毛犰狳的研究中發現，當睪丸內睪酮水平下降，支持細胞和生殖細胞之間的細胞黏附分子喪失，使非凋亡的減數分裂細胞和生殖細胞大量脫落[8，11]，如生精上皮中的β-連環蛋白(β-catenin)和鈣黏蛋白(E-cadherin)是胞質特化結構和其他支持細胞黏附的多蛋白復合物的組成部分，非繁殖期表達降低，使生殖細胞與生精小管分離，導致睪丸縮小退化[34]，這些分子的表達可能在控制季節性繁殖的機制中發揮重要作用。

支持細胞之間通過緊密連接形成穩定結構，并與基部外胞質特殊結構和細胞橋粒連接共同構成血睪屏障(blood-testis barrier，BTB)，既保證生精細胞在生精小管內遷移方向的正確性，又將減數分裂的生殖細胞抗原與體循環分離，為精子發生提供特殊的免疫屏障[35]。在哺乳動物的繁殖期，初級精母細胞必須通過BTB才能進入減數分裂的腔室，有效調控各級生精細胞不斷地由生精小管基底部向管腔的遷移[34]；而非繁殖期BTB喪失屏障功能，生殖細胞發育和分化通常會失敗[36]，使有害物質滲透到達生精上皮的腔室[11，37]。這種功能的喪失與參與緊密連接形成的細胞黏附蛋白的重組有關，其中Claudin-11(Cldn11)蛋白僅在支持細胞中表達，在非繁殖期的成年倉鼠和伊比利亞鼴鼠退化的睪丸中分布異常，Cldn11的mRNA在倉鼠中的表達增加[37]，在伊比利亞鼴鼠體內的表達顯著降低[11]。

支持細胞之間緊密連接形成的BTB破損，發生滲透作用，脫落的生殖細胞透過BTB，由附睪和尿道排出體外或通過凋亡而死亡[8，11]。細胞凋亡(細胞程序性死亡)是介導季節性睪丸退化的主要過程[5，38-39]。細胞凋亡能夠保護雄配子的遺傳完整性，以及精原細胞和精母細胞周期的同步性，并清除受損、患病或多余的細胞[40]；伊比利亞鼴鼠凋亡以季節依賴的方式變化，在非繁殖期主要影響偶線期精母細胞，但不影響支持細胞[11]。金色中倉鼠生殖細胞凋亡率在睪丸退化期間達到峰值[10]，凋亡的生殖細胞被支持細胞吞噬[4]。

3 視黃酸對繁殖的調控機制

3.1 視黃酸對繁殖的影響

光周期是影響植被類型的重要因子，光周期引起季節變化直接導致環境中動物的食物資源發生變化[41]。哺乳動物自身不能合成維生素A，只能通過食物獲得，嚙齒類動物如果日常維生素A攝入不足，很難完成睪丸生精小管中精原細胞的分化[42]。視黃酸是維生素A在體內的代謝產物，維生素A又名視黃醇，能在一定程度上提高精原細胞分化，促進精母細胞的減數分裂以及完成精子變形等[43]。高原鼠兔視黃酸缺失的典型癥狀表現為精子發生停止在尚未分化的精原細胞階段，注射視黃酸后精子發生恢復正常[9]。季節性繁殖的動物進入非繁殖時期，視黃酸的合成效率會處于較低的水平，精原細胞的分化也會受到一定影響，導致精子發生的過程中斷。促進精原細胞分化的視黃酸是由支持細胞合成的，一方面通過調節血睪丸屏障維持生精上皮完整性[44]，另一方面控制周期性的精原細胞分裂和生殖細胞分化[42，45]。

3.2 視黃酸代謝途徑

血漿中的維生素A與生精細胞中的維生素A結合蛋白相結合形成復合物，該復合物與細胞膜上的視黃酸激活基因6(STRA6)結合進入到細胞內部。維生素A必須轉化為視黃酸才能對繁殖進行調控，維生素A先在乙醇脫氫酶和視黃醇脫氫酶的共同作用下轉變為視黃醛，再經過視黃醛脫氫酶的催化形成視黃酸，細胞質內的視黃酸與視黃酸結合蛋白(cellular RA binding protein，CRBP)相結合進入到細胞核中，與其核受體結合形成異源二聚體，啟動靶基因的轉錄表達而發揮作用[46-47](圖1D)。視黃酸的降解也至關重要，由細胞色素P450 26系酶降解失活[48]。

圖1 光周期通過褪黑激素和視黃酸對繁殖的調控通路[1，7，9，47]Fig.1 Photoperiod regulates reproduction through melatonin and retinoic acid[1，7，9，47] 注：SCN.視交叉上核；3v.第三腦室；TSH.促甲狀腺激素；TSHR.促甲狀腺激素受體；DIO2.脫碘酶Ⅱ；T4.四碘甲腺原氨酸；T3.三碘甲腺原氨酸；GnRH.促性腺激素釋放激素；FSH.卵泡刺激素；LH.黃體生成素；T.睪酮；ROL.視黃醇；RBP4.視黃醇結合蛋白；STRA6.視黃酸激活基因6；RDH.視黃醇脫氫酶；ADH.乙醇脫氫酶；RAL.視黃醛；RALDH.視黃醛脫氫酶；RA.視黃酸；RAR.視黃酸受體；RXR.視黃酸X受體 Note：SCN，Suprachiasmatic nuclei.3v，Third ventricle.TSH，Thyroid-stimulating hormone.TSHR，TSH receptor.DIO2，Deiodinase type 2.T4，Thyroxine.T3，Triiodothyronine.GnRH，Gonadotrophin-releasing hormone.FSH，Follicle-stimulating hormone.LH，Luteinising hormone.T，Testosterone.ROL，Retinol.RBP4，Retinol-binding protein.STRA6，Stimulated by retinoic acid gene 6.RDH，Retinol dehydrogenases.ADH，Alcohol dehydrogenases.RAL，Retinal.RALDH，Retinal dehydrogenases.RA，Retinoic acid.RAR，Retinoic acid receptor.RXR，Retinoic acid receptor

3.3 睪酮—視黃酸信號調控季節性精子發生

類固醇生成功能和配子發生功能在許多動物中都表現出季節性節律[6，45]。對睪丸的轉錄組學研究結果表明，類固醇激素生物合成和視黃醇代謝均為與繁殖有關的顯著富集的代謝途徑[9]，精原細胞分化的關鍵誘導因子視黃酸水平及其調控基因表達均呈季節性變化[7]。外源注射睪酮通過調節視黃酸合成酶和降解酶的表達直接影響視黃酸水平[7，9]。非繁殖期高原鼠兔注射睪酮會使視黃酸合成酶的關鍵基因表達上調，降解酶則表達下調，全反式視黃酸(ATRA)水平顯著提高[9](圖1E)。非繁殖期雄性高原鼠兔和高原鼢鼠的睪酮濃度低，精原細胞分化過程受阻[7，9，49]。當睪酮的濃度很高時，提高視黃酸的合成速率，抑制視黃酸的降解，使視黃酸達到細胞分化所需要的濃度[9]。低劑量的睪酮可以維持生殖細胞生存，高劑量的睪酮調控精子發生和動物的繁殖行為[7，50]。給非繁殖期的雄性高原鼠兔注射睪酮或視黃酸，睪丸質量顯著增加，生殖細胞數量增加，大多數生精小管中觀察到完整的精子發生，附睪內有精子[9]。睪酮和視黃酸對非繁殖期雄性動物性腺恢復的效果不同，在非繁殖期給高原鼢鼠注射視黃酸，可提高精原細胞分化能力，促進精子發生的恢復；注射睪酮使高原鼢鼠睪丸質量顯著增加，精原細胞分化啟動[7]，表明睪酮—視黃酸信號是調控繁殖活動和生殖細胞發育的關鍵途徑。

4 結語

光照周期的變化一方面引起松果體分泌褪黑激素改變作用于垂體結節部細胞，經過THS-DIO2/DIO3-T3逆行通路以及下丘腦—垂體—性腺軸起作用，調節季節性繁殖的雄性哺乳動物的性腺變化、繁殖相關激素的分泌以及精子發生過程；另一方面通過影響植被間接影響動物所攝取的食物資源來啟動或抑制繁殖。哺乳動物季節性繁殖受到光周期的影響，但繁殖策略各有不同，受到多種激素的調控，激素之間如何協調啟動繁殖的機理有望進一步解析。高通量測序技術在季節性發情中的應用，可以更深入地了解繁殖的內在分子機制，為研究野生動物季節性繁殖節律提供指導依據。