大熊貓糞便皮質醇激素分布與取樣對策

楊 波 賴燕舞 周 強 杜 鍇 羅秋琪 周 莉 魏 明 張 樂 譚成彬 任志均 徐亞琳 林冰森 羅 波*

(1.中國大熊貓保護研究中心，大熊貓國家公園珍稀動物保護生物學國家林業和草原局重點實驗室，邛崍山、岷山瀕危野生動植物保護生物學國家長期科研基地，都江堰，611830；2.丹巴縣農牧農村和科技局，丹巴，626300；3.四川農業大學土木工程學院，都江堰，611830)

動物糞便是非損傷性取樣法中易獲得、易保存的樣本，被應用于瀕危野生動物的種群動態監測、遺傳結構、寄生蟲、微生物與繁殖生理等研究[1-2]，大熊貓(Ailuropodamelanoleuca)糞便被廣泛應用于種群生態與遺傳、食性與消化、類固醇激素、寄生蟲和微生物等多方面的研究[3]。糞便類固醇激素是一種較好衡量動物繁殖狀態和應激反應程度的指標[4-5]。腎上腺糖皮質激素常用來衡量動物所受的脅迫程度，用于指示應激源對動物產生的干擾應激效應[6-7]，而皮質醇作為一種糖皮質激素的主要生理活性成分，它參與機體多項生理功能的調節和影響行為的表達[8]。目前，常用糞便皮質醇激素(可的松cortisol)水平來評估某些環境因子如高溫[6-7，9]、噪音[10-12]、光照[13]或特殊事件如麻醉[6]、運輸[14-15]等對大熊貓產生的短期應激反應，也可以用于大熊貓應激生理的長期監測與環境壓力分析[16-17]。

大熊貓主食竹類，糞便尺寸較大，為采集、保存及處理帶來諸多不便，同時也為類固醇激素測定造成一定的影響。于小杰等[18]早已證實大熊貓糞便表層中類固醇激素含量明顯高于糞便內部，糞便激素的分布存在內外差異；還有研究也證實了大熊貓糞便的取樣量、保存方式、激素提取方式及檢測方法等因素會影響類固醇激素的測定結果[5，8，19-20]。由于野生個體難以尋覓，很難采集到新鮮糞便或者采集量受到限制，同時考慮到糞便的多用途性，節約使用糞便很有必要，于小亞等[18]發現大熊貓糞便激素的內外差異，提出部分取樣(1/2取樣或1/4取樣)的建議。本研究進一步對1/2取樣或1/4取樣的可行性進行驗證，還對糞便重量估測及取樣量做了研究，以期為大熊貓糞便類固醇激素研究的取樣對策提供參考。

1 研究材料

試驗對象為中國大熊貓保護研究中心都江堰基地7只大熊貓(成年雌∶成年雄∶亞成體=2∶2∶3)。每日以新鮮竹子、竹筍為食，并以胡蘿卜、蘋果和人工精飼料(主要由黃豆粉、玉米粉、雞蛋和菜油等混合后蒸制所成)為輔食，采食良好，身體健康。于2021年10月某一周，在圈舍打掃前收集舍內所有完整糞便，糞便新鮮程度在24 h以內，共采集糞便103份，包括竹節便62份、竹葉便29份和混合便12份(竹葉與竹節混合，各占比情況未計算)。

2 研究方法

2.1 樣品采集與處理

利用一次性PE手套采集糞便，采集后首先測量外部尺寸(圖1)、稱量濕重，測量完畢后裝入自封袋，-20 ℃凍存。糞樣采用凍干技術(真空冷凍干燥機為北京亞星儀科LGJ-100FG)干燥，按照唐丹等[15]操作方法篩取和保存。

圖1 大熊貓糞便尺寸測量與分割Fig.1 The schematic diagram of fecal size measurement and segmentation

2.2 激素提取與測定

糞便皮質醇激素提取與測定參考唐丹等[15]的方法，分析樣品量每次約為0.1 g。

2.3 數據處理與統計

3 結果與分析

3.1 糞便皮質醇分布

將18份糞便(竹節便∶竹葉便∶混合便=5∶9∶4)分割成A、B、C、D 4個等分(圖1)，并測定72份小型糞便皮質醇含量，結果(圖2)表明：A、B、C、D部分皮質醇分別為(97.7±39.6)、(95.9±37.8)、(98.2±28.4)、(99.7±38.8) ng/g。ANOVA方差分析得出這4個區組整體無顯著差異性(df=3，F=0.033，P=0.992)，多重比較也表明4個區組間均無顯著差異(P=0.756～0.970)。隨后，將A+B視為一個整體，C+D為另一個整體，二者的皮質醇分別為(96.8±37.1)、(98.9±31.6) ng/g，兩區組間不存在顯著差異(P=0.855)；同樣的，A+D[(98.7±37.6)ng/g]與B+C[(97.0±32.3)ng/g]也不存在顯著差異(P=0.886)。

圖2 糞便取樣方式與皮質醇含量的關系Fig.2 Relationship between fecal sampling method and cortisol concentration

3.2 取樣方式對皮質醇的影響

不同取樣方式如1/4取樣(A/B/C/D)和1/2取樣(橫向A+B/C+D、縱向A+D/B+C)分別對皮質醇測定準確性的影響(以Cv值作為指標)如圖3所示，1/4取樣A/B/C/D的Cv值[(13.7±7.1)%]要稍大于橫向1/2取樣A+B/C+D[(10.2±6.4)%]，兩者差異不顯著(Z=-1.550，P=0.121)，但1/4取樣A/B/C/D的Cv值要顯著大于縱向1/2取樣A+D/B+C[(8.7±9.2)%，Z=-2.769，P=0.006]。考慮到單一值對Cv值的整體影響，對數據優化，將Cv>15%中的最大影響值剔除，共剔除4個數據(竹節便1個，竹葉便2個，混合便1個)。結果表明：優化后的Cv值整體小于優化前，優化前后的差異均不顯著(-0.998≤Z≤-0.514，0.318≤P≤0.608)。此外，優化后1/4取樣A/B/C/D的Cv值[(10.9±4.3)%]仍然大于橫向A+B/C+D[(8.1±4.4)%，Z=-1.596，P=0.111]，且顯著大于縱向1/2取樣A+D/B+C[(6.3±4.3)%，Z=-2.830，P=0.005]。縱向1/2取樣A+D/B+C的Cv值在優化前和優化后均是最小的。

圖3 不同取樣方式對糞便皮質醇測定準確性的影響Fig.3 Influence of different sampling methods on the measurement accuracy of fecal cortisol 注(Note)：**.P<0.01

3.3 糞便濕重與尺寸的關系

圖4顯示，3種糞便類型(竹節便、竹葉便與混合便)均不存在特殊分布，故對所有數據整合分析。基于103份糞便測量數據，發現糞便濕重與尺寸存在顯著正相關性(r=0.897，P<0.001)；回歸分析顯示，它們之間符合線性回歸關系(R2=0.804，F=418.846，P<0.001)，回歸直線方程為y=2.3x-29.3(y為糞便濕重，x為糞便尺寸大小即S值)。

3.4 糞便含水率與出粉率

不同類型糞便的含水率有差異，如表1所示，竹節便的含水率最低，為(67.4±3.8)%，顯著低于竹葉便與混合便(Z≤-2.626；P≤0.009)；竹節便的出粉率也是最高，為(2.4±0.9)%，顯著高于另外兩者(Z≤-3.977；P<0.001)。

表1 糞便含水率與出粉率情況

4 討論

大熊貓非損傷性取樣一直是熱點研究，野生大熊貓的糞便逐漸成為珍貴、重要的科研資源，糞便的有效、合理利用是未來大熊貓非損傷性取樣研究的重要方向。對于大型哺乳動物而言，糞便尺寸較大，為了取樣方便、節省樣品存放空間便于運輸與保存，往往采取部分取樣的方法[4，18]。本研究旨在分析大熊貓糞便皮質醇激素的分布情況，進一步驗證部分取樣的準確性與可行性，以及探討在不同條件下(糞便類型、尺寸、取樣量)的取樣對策。結果顯示，對糞便進行橫縱向分割后的每部分(1/4取樣)間的皮質醇含量均不存在顯著差異(圖2)，表明糞便在該處理下的激素分布是比較均勻的，即每部分糞便激素水平均能在一定程度上代表整團糞便，但前提是所取糞樣的表層與內部比例要能代表整團糞便[18]，否則會導致較大偏差，影響檢測準確性。本研究還發現，糞便1/2取樣所產生的Cv值要明顯小于1/4取樣，并且縱向1/2取樣的Cv值小于橫向1/2取樣(圖3)，表明1/2取樣的準確性比1/4取樣高，結果更具有代表性，縱向取樣比橫向取樣更有效。究其原因，可能是糞便不是完美的橢球體，取樣時較難保證糞便外層與內部比例一致；大熊貓糞便中含有較多、較大的竹節或竹葉，況且竹節或竹葉也不是均勻分布，很難實現糞便的均勻分割。優化前后Cv值的差異情況也可以說明，取樣分割的均勻性會影響測定結果的準確性。因此，取樣方式是影響大熊貓糞便皮質醇激素測定的主要因素之一[18]，盡可能提高取樣的均勻性，所取樣品才更具代表性。

Hayward等[21]研究表明，糞便經過干燥后，0.001～0.100 g樣品量可用于激素的提取與檢測，所以0.5 g大熊貓糞干粉量足以滿足相關試驗，此時大概需要25 g濕重的竹節便或50 g以上的竹葉/混合便(表1)，考慮到大熊貓糞便濕重在50～200 g(圖4)，因此1/2取樣或1/4取樣均可以滿足取樣條件，它們都是比較有效的取樣方式。在野外環境下，根據3.3中的回歸方程估測大熊貓糞便的濕重，進而采取相應的取樣對策。若樣品比較稀少且可以保證均勻取樣的前提下，1/4取樣具有可行性；否則，建議采取縱向1/2取樣。由于本研究僅測定了糞便皮質醇含量，對于其他類固醇激素如雌激素、孕激素和睪酮等未做相關分析，需要進一步驗證。考慮到這些激素均屬于類固醇激素，激素代謝途徑相似，因此可以參考該取樣方式。本研究明確了大熊貓糞便皮質醇激素分析的取樣對策，對野外采樣工作具有一定的指導意義，為大熊貓糞便類固醇激素研究提供一定的方法參考。

致謝：感謝中國大熊貓保護研究中心周世強高級工程師在數據處理及分析上的幫助，感謝魏榮平主任及吳凱、劉藝、胡蘭和楊欣等同事在樣品采集上的大力支持。