野生疣鼻天鵝洛菲不動(dòng)桿菌的分離鑒定與藥物敏感性分析

彭志鋒 張 菡 高如意 朱亞博 董 青 王 軍 霍 軍 邊傳周*

(1.河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院動(dòng)物醫(yī)藥學(xué)院，鄭州，450046；2.三門(mén)峽天鵝湖國(guó)家城市濕地公園，三門(mén)峽，472100)

Acinetobacterlwoffii；Identification；Drug susceptibility tes洛菲不動(dòng)桿菌(Acinetobacterlwoffii)通常被認(rèn)為是一種條件性致病菌，普遍存在于土壤、水或干燥的環(huán)境中，對(duì)免疫力低的動(dòng)物或人來(lái)說(shuō)是一種潛在的病原，不僅可引起醫(yī)院內(nèi)感染，造成敗血癥、肺炎、腦膜炎、尿道感染、皮膚傷口感染或急性胃腸炎[1-6]，而且近年來(lái)感染嚙齒動(dòng)物、禽畜和水生動(dòng)物的報(bào)道增多，如鼠、鴨感染洛菲不動(dòng)桿菌死亡[7-8]、奶牛生乳中分離出洛菲不動(dòng)桿菌[9]、兔感染洛菲不動(dòng)桿菌死亡[10]，以及2016—2017年四川省普遍發(fā)生裂腹魚(yú)(Schizothoraxspp.)因感染洛菲不動(dòng)桿菌造成皮膚潰爛和內(nèi)臟出血[11]。目前為止，還沒(méi)有野生動(dòng)物感染洛菲不動(dòng)桿菌的報(bào)道。2020年8月，三門(mén)峽天鵝湖國(guó)家濕地公園的野生疣鼻天鵝(Cygnusolor)陸續(xù)發(fā)病，采食量嚴(yán)重下降，排水樣、白色和黃綠色糞便，不愿下水，站立不穩(wěn)，最終消瘦死亡。筆者從病死疣鼻天鵝臟器(肝臟和心臟)中分離到1株細(xì)菌，經(jīng)染色鏡檢、MALDI-TOF鑒定和16S rDNA序列分析，確定為洛菲不動(dòng)桿菌。對(duì)該分離菌株進(jìn)行藥物敏感性試驗(yàn)，依據(jù)試驗(yàn)結(jié)果選用敏感藥物治療，取得較好的效果，野生疣鼻天鵝陸續(xù)恢復(fù)健康。

1 材料與方法

1.1 病料和菌株來(lái)源

病料為河南省三門(mén)峽天鵝湖國(guó)家城市濕地公園送檢的病死疣鼻天鵝肝臟和心臟。藥敏試驗(yàn)質(zhì)控菌株大腸桿菌ATCC25922購(gòu)自中國(guó)普通微生物菌種保存中心。

1.2 分離純化及革蘭染色

無(wú)菌取病死疣鼻天鵝肝臟和心臟，放置在生物安全柜內(nèi)，用酒精棉球?qū)ζ浔砻嫦?，然后用無(wú)菌接種環(huán)接觸肝臟和心臟的新鮮切面，將接種環(huán)上物質(zhì)接種于鮮血瓊脂平板和LB平板，于恒溫培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)12～24 h后，挑取單菌落革蘭氏染色和鏡檢。取單菌落接種于LB液體培養(yǎng)基，于恒溫振蕩培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)12 h，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 MALDI-TOF鑒定

用無(wú)菌接種環(huán)將純化后的菌株接種于LB平板，于恒溫培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)12 h，取單菌落，通過(guò)MALDI-TOF(Bruker MALDI-Biotyper，購(gòu)自Bruker公司)進(jìn)行菌種鑒定。

1.4 16S rDNA鑒定1.4.1 基因組DNA的提取

取過(guò)夜培養(yǎng)的菌液0.5 mL于無(wú)菌EP管中，煮沸10 min；然后12 000 r/min離心5 min，取上清，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 PCR擴(kuò)增及構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)

用16S rDNA通用引物27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′和1492R：5′-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3′，采用50.0 μL PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系：基因組DNA 1.0 μL；27F和1492R各1.0 μL；10×Buffer 5.0 μL；Taq聚合酶1.0 μL；dNTP 1.0 μL，無(wú)菌ddH2O 40.0 μL。PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸7 min。取5 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送生工生物工程(上海)股份有限公司雙向測(cè)通測(cè)序。

用NCBI中的BLAST工具對(duì)比分析測(cè)得的序列。根據(jù)對(duì)比結(jié)果，選取參考菌株和同科不同屬菌株的16S rDNA序列，用MEGA-X軟件選擇Neighbor-joining法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

1.5 藥物敏感性試驗(yàn)

參照CLSI2020[12]規(guī)定的方法，采用K-B法檢測(cè)分離菌株對(duì)阿米卡星、加替沙星、多西環(huán)素、恩諾沙星、卡那霉素、新霉素、阿莫西林、環(huán)丙沙星、大觀霉素、頭孢噻肟、多黏菌素B、氨芐西林、林可霉素、慶大霉素、氟苯尼考、氧氟沙星、頭孢克肟和克林霉素18種抗菌藥物(購(gòu)自杭州濱和微生物試劑有限公司)的敏感性，用質(zhì)控菌株進(jìn)行質(zhì)控。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)菌分離培養(yǎng)

細(xì)菌分離菌株在LB平板中生長(zhǎng)出乳白色、半透明、表面光滑和邊緣整齊的小菌落。革蘭氏染色為革蘭陰性球桿菌，呈單個(gè)、成對(duì)或短鏈排列(圖1)。

圖1 細(xì)菌鏡檢結(jié)果(革蘭氏染色，1 000×)Fig.1 Bacterial microscopic examination results (Gram’s stain，1 000×)

2.2 MALDI-TOF鑒定

分離菌株蛋白質(zhì)譜與Bruker MBT臨床菌種主庫(kù)(DB8468_2969)中的洛菲不動(dòng)桿菌高度一致。

2.3 16S rDNA鑒定

分離菌株16S rDNA序列PCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果為1 458 bp(圖2)，經(jīng)BLAST比對(duì)，分離菌株16S rDNA序列與洛菲不動(dòng)桿菌16S rDNA序列相似度達(dá)到99.72%，確認(rèn)該分離菌株為洛菲不動(dòng)桿菌，將其命名為HeNSMX-1。系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析顯示：分離菌株HeNSMX-1與洛菲不動(dòng)桿菌處于同一分支，親緣關(guān)系最近(圖3)。

圖2 分離菌株16S rDNA擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果Fig.2 Electrophoresis results of 16S rDNA amplification of isolated strains 注：M.DL2000 DNA Ladder；1.分離菌株16S rDNA擴(kuò)增產(chǎn)物；2.陰性對(duì)照 Note：M，DL2000 DNA Ladder.1，The 16S rDNA amplification product of the isolated strain.2，Negative control

圖3 不動(dòng)桿菌屬細(xì)菌基于16S rDNA基因的進(jìn)化樹(shù)Fig.3 Phylogenetic tree of Acinetobacter spp.based on 16S rDNA genes

2.4 洛菲不動(dòng)桿菌分離菌株的藥敏試驗(yàn)

洛菲不動(dòng)桿菌分離菌株對(duì)阿米卡星、加替沙星、多西環(huán)素、卡那霉素、環(huán)丙沙星、頭孢噻肟、慶大霉素和氧氟沙星敏感，對(duì)克林霉素中度敏感，對(duì)阿莫西林、氨芐西林和頭孢克肟耐藥(表1)。

表1 洛菲不動(dòng)桿菌分離菌株HeNSMX-1的藥物敏感性

3 討論

據(jù)報(bào)道，洛菲不動(dòng)桿菌可造成羊駝(Lamaglama)呼吸系統(tǒng)感染[13]、狗腦部積水[14]、魚(yú)內(nèi)臟出血[11]和兔內(nèi)臟出血[10]等。本研究通過(guò)細(xì)菌形態(tài)學(xué)、MALDI-TOF鑒定和16S rDNA序列分析，確認(rèn)從病死野生疣鼻天鵝肝臟中分離得到的唯一菌株為洛菲不動(dòng)桿菌，首次報(bào)道了洛菲不動(dòng)桿菌感染導(dǎo)致野生疣鼻天鵝死亡。

近年來(lái)，不動(dòng)桿菌屬細(xì)菌的多重耐藥受到越來(lái)越多研究人員的關(guān)注。本研究中的洛菲不動(dòng)桿菌對(duì)阿莫西林、氨芐西林和頭孢克肟耐藥，魚(yú)源洛菲不動(dòng)桿菌也對(duì)上述藥物表現(xiàn)出耐藥性[11]。盡管抗生素治療是防控野生動(dòng)物細(xì)菌性疾病的重要策略，但隨著野生動(dòng)物病原菌耐藥性的增強(qiáng)及體內(nèi)抗生素的蓄積，洛菲不動(dòng)桿菌可能會(huì)危害環(huán)境，造成耐藥基因種間或跨種的傳播。因此，天鵝源洛菲不動(dòng)桿菌的感染防控策略研究應(yīng)該聚焦于抗生素替代方法上，如免疫接種和中藥療法[15]。

鑒于洛菲不動(dòng)桿菌普遍存在于土壤或水中，且近年來(lái)不斷有水生動(dòng)物感染洛菲不動(dòng)桿菌致病的報(bào)道[11，16]，野生疣鼻天鵝可能因接觸被洛菲不動(dòng)桿菌污染的水而感染致病。為避免該病的發(fā)生，建議三門(mén)峽天鵝湖國(guó)家城市濕地公園做好地表水洛菲不動(dòng)桿菌的監(jiān)測(cè)，改善水衛(wèi)生狀況。嚴(yán)禁周邊未經(jīng)處理的生活用水向地表水中排放，從源頭上減少含有洛菲不動(dòng)桿菌的污染水源。

洛菲不動(dòng)桿菌被認(rèn)為是醫(yī)院臨床中的一種條件性致病菌，通常與菌血癥、肺炎、腦膜炎、腹膜炎和胃腸炎等有關(guān)[1-3，17-18]。盡管目前沒(méi)有天鵝湖濕地公園員工感染洛菲不動(dòng)桿菌的報(bào)道，但隨著生態(tài)環(huán)境的改善，人們接觸野生天鵝的機(jī)會(huì)增多，應(yīng)加強(qiáng)對(duì)洛菲不動(dòng)桿菌感染因素的研究，盡量避免該菌在天鵝與人之間傳播。