D型肉毒毒素滅鼠劑對棕背雪雀危害機理的試驗研究

李生慶 李淑萍 胡國元 雷萌桐 韓生義 劉成錄 王林業

(1.青海大學畜牧獸醫科學院，西寧，810016；2.青海省動物疾病病原診斷與綠色防控技術研究重點實驗室，西寧，810016；3.青海省果洛州瑪沁縣獸醫站，瑪沁，814000；4.青海省互助縣紅崖子溝鄉畜牧獸醫站，互助，810500)

青藏高原草地生態系統由于氣候環境、人為干擾和家畜載畜量的超載等多方面因素而處于比較嚴重的退化狀態，同時顯現的還有草地沙化、黑土灘化的面積不斷加大，鼠密度極高，使得鼠害防治強度逐年增加。隨著D型肉毒毒素生物滅鼠劑在青藏高原牧區，尤其是被譽為“高原水塔”的三江源地區草地鼠害治理中的大面積應用，藥物對處于敏感生態地位中的有害靶動物的特異性靶向作用及對非靶環境動物的安全性備受生態學者的重視。

由于青藏高原牧區大都沒有樹木和高的灌木叢，隱蔽條件差，氣候寒冷，特別是在海拔4 000 m以上的地方幾乎終年無夏，夜間氣溫常在0 ℃以下，加上大風等不利自然因素，使褐背擬地鴉(Pseudopodoceshumilis)和棕背雪雀(Pyrgilaudablanfordi)等小型鳥類適應性地利用高原鼠兔(Ochotonacurzoniae)的洞穴棲息或繁衍后代，形成了“鳥鼠同穴”。

肉毒毒素作為一種生物滅鼠劑，在三江源地區草地鼠害防治中取得了良好的效果，有效控制了害鼠的種群密度，為黑土灘治理和草地植被恢復奠定了良好的基礎[1-2]。評價一種滅鼠藥物的好壞，不僅要關注其藥物效果，更要達到相關的藥物毒性分級標準，尤其是在青藏高原地區，獨特的自然環境孕育了豐富的生物資源，維持生態環境的健康發展對于該區域生態環境的保護利用至關重要[3]。隨著D型肉毒毒素滅鼠劑的廣泛使用，新的問題也不斷被發現，在生態環境敏感的區域大面積使用D型肉毒毒素滅鼠劑，呈現出了一定的敏感性差異現象，且在傳統的動物致死性試驗無法逐一對野生保護動物進行測定的情況下，如何對非靶動物的安全性進行評價，研究不同動物對D型肉毒毒素產生敏感性差異的內在機理和影響因子就顯得尤為重要。藉此建立毒素安全性評價模型，在更廣的范圍對不同動物的安全性實現快捷地安全性評價具有很高的理論研究及實際應用意義。

為了探究D型肉毒毒素對高原牧區小型鳥類的毒性作用，闡明D型肉毒毒素蛋白導致高原牧區小型鳥類死亡的真實原因，本研究采用霍恩氏法測定了D型肉毒毒素對青藏高原牧區野生高原鼠兔、高原鼢鼠(Myospalaxbaileyi)、青海田鼠(Lasiopodomysfuscus)和小型鳥類棕背雪雀的灌胃半數致死量(LD50)，并從分子角度開展了基于VAMP1蛋白的敏感性分析。研究結果可為鼠害防治區域內相關鳥類的安全性評價提供數據支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗用菌株和毒素

D型肉毒梭菌D8901株，由青海大學畜牧獸醫科學院獸醫研究所肉毒研究室提供。D型肉毒滅鼠劑2021001批和2021002批，毒價1 000萬MLD/mL(小白鼠靜注)，由青海綠原生物工程有限公司提供。

1.2 試驗用動物

大白鼠(Rattusnorvegicus)，購自中國農業科學院蘭州獸醫研究所小動物實驗中心，共計25只，體重130.32～150.64 g。

高原鼠兔，捕捉自青海省海北州祁連縣野牛溝鄉達玉村野外牧區，共計25只，體重125.26～153.31 g。在室內人工飼養1周后供實驗室用。

棕背雪雀，捕捉于青海省果洛州瑪沁縣草原，共計40只，體重21.66～43.62 g，在室內飼喂1周穩定后供試驗用。

高原鼢鼠，捕捉自青海省大通縣東峽鎮向華鄉農區，共計25只，體重245.62～283.24 g。在室內人工飼養1周后供實驗室用。

青海田鼠，捕捉自青海省海北州剛察縣青海湖農場，共計25只，體重23.50～34.60 g。在室內人工飼養1周后供實驗室用。

昆明系小鼠，購自蘭州獸醫研究所小動物實驗中心，體重16.00～18.00 g。

1.3 D型肉毒毒素對棕背雪雀灌胃LD50的測定

灌胃LD50的測定按霍恩氏法進行。根據鵪鶉(Coturnixjaponica)的灌胃半數致死量及前期預試驗結果，將試驗設為2個重復(2個批次的藥品)，每個重復20只棕背雪雀，各分為4個劑量組，每組5只，根據棕背雪雀的體重灌服系列濃度毒素0.05 mL/g，劑量分別為10 000、21 500、46 400、100 000 MLD/mL，按體重、組別逐一灌服。觀察7～10 d，記錄死亡情況。

1.4 棕背雪雀胃腸內容物對D型肉毒毒素蛋白的破壞強度分析

試驗用棕背雪雀乙醚麻醉致死后，取胃、腸內容物分別置于離心管中，加入4 mL生理鹽水稀釋搖勻，再加入D型肉毒毒素(2 000萬MLD/mL)1 mL，充分混勻，使其終濃度為40萬MLD/mL，室溫保存24 h后離心、稀釋并測毒(原液未處理組)。另取胃、腸內容物分別置于離心管中，加入4 mL生理鹽水稀釋搖勻，4 ℃放置2 h后，4 000 r/min離心20 min，轉移至另一離心管中，再加入毒素(2 000萬MLD/mL)1 mL，充分混勻，室溫保存24 h后離心、稀釋并測毒(離心處理組)。

1.5 VAMP1蛋白轉錄組測序分析

將棕背雪雀、高原鼠兔、高原鼢鼠及青海田鼠麻醉后，進行心臟采血致死和快速解剖，取新鮮腦組織置于采樣管中，加入適量干冰保存，送樣至北京百邁客生物科技有限公司，按標準流程進行樣本制備并上機構建文庫。使用Illumina Hiseq高通量測序平臺對cDNA文庫測序、組裝和序列比對，得到的mapped reads用于下游分析。從GenBank中下載小鼠(Musmusculus，NM-013090.2)和大白鼠(NM-009496)的VAMP1基因的編碼區序列，再用BLAST+軟件包中的Blastn程序調取各物種包含VAMP1基因的unigene序列。最后用DNA Star軟件包(http：//www.dnas-tar.com/)中的Megalign軟件分析DNA序列和氨基酸序列的相似性。

2 結果與分析

2.1 D型肉毒神經毒素對棕背雪雀灌胃LD50

兩批次D型肉毒毒素對棕背雪雀灌胃LD50分別為3.16萬MLD/kg(95%可信限為2.05萬～4.88萬MLD/kg)和2.71萬MLD/kg(95%可信限為1.69萬～4.41萬MLD/kg)，平均為2.94萬MLD/kg(表1)。

表1 棕背雪雀對D型肉毒毒素敏感性(LD50)

2.2 棕背雪雀與鼠類胃腸內容物對D型肉毒毒素的破壞強度

取1 mL原毒價為2 000萬MLD/mL的D型肉毒毒素分別置于加有4 mL生理鹽水的棕背雪雀、大白鼠及高原鼠兔胃腸內容物原液及離心上清液中，使其終濃度為40萬MLD/mL，作用24 h后，可發現不同處理組中肉毒毒素含量均有不同程度的降低，具有3個特點：(1)大白鼠胃腸內容物對D型肉毒毒素的破壞強度明顯高于高原鼠兔及棕背雪雀。(2)高原鼠兔及棕背雪雀胃腸內容物對D型肉毒毒素的破壞強度基本相當。(3)胃腸內容物離心后的上清液對肉毒毒素的破壞強度明顯低于胃腸內容物原液(表2)。

2.3 棕背雪雀與高原牧區部分害鼠VAMP1蛋白轉錄組的測序分析

通過采樣轉錄組測序得到高原鼠兔、青海田鼠、高原鼢鼠和棕背雪雀的VAMP1基因編碼區序列，長度均為357 bp，與小鼠VAMP1基因序列在DNA序列水平上進行逐一比對，結果顯示：高原鼠兔與小鼠的相似性為90.96%～94.44%；高原鼢鼠與小鼠的相似性為94.12%～96.44%；青海田鼠與小鼠的相似性為94.03%～98.35%；與高原鼠兔同穴而居的棕背雪雀的測序結果比對，發現與小鼠的序列同源性為83.72%～90.28%。在基因編碼區序列推導的氨基酸序列水平上，3種鼠類及棕背雪雀VAMP1氨基酸序列(GenBank No.GQ905710)與小鼠的完全相同，VAMP1氨基酸序列在第48號氨基酸位點(為48M型，而非48Ⅰ型)都屬于D型肉毒毒素敏感型氨基酸(圖1)。

圖1 棕背雪雀、高原鼠兔與部分嚙齒類動物體內VAMP1氨基酸序列比對結果Fig.1 Alignment of VAMP1 amino acid sequences between plain-backed snowfinch，plateau pika and rodents

3 結論與討論

本研究中，采用霍恩氏法測得與高原鼠兔同穴而居的棕背雪雀對兩批次D型肉毒毒素的半數致死量分別為3.16萬、2.71萬MLD/kg，平均半數致死量為2.94萬MLD/kg，敏感性介于高原鼢鼠(LD50為0.58萬MLD/kg)[4]與青海田鼠(LD50為5.64萬MLD/kg)之間[5]，表明在使用D型肉毒毒素進行草原鼠害防治時，同域分布的小型鳥類存在誤食毒餌引起死亡的危險，今后在毒餌投放精準性、餌料趨避方面有必要采取相應措施。

由于小分子靶向藥物多為口服制劑，生物利用度容易受到食物的影響[6-7]。食物可通過影響胃腸血流、胃排空、腸蠕動、胃腸pH以及P-蛋白來影響小分子靶向藥物的吸收，進而影響藥物的口服效果。不同動物胃腸內容物對D型肉毒毒素蛋白均有一定程度的破壞，胃腸內容物對毒素的破壞強度與毒素對害鼠的敏感性成正相關。本研究表明，大白鼠胃腸內容物對D型肉毒毒素的破壞強度明顯強于高原鼠兔及棕背雪雀，后兩者胃腸內容物對D型肉毒毒素的破壞強度基本相當，驗證了胃腸內容物的破壞作用是導致害鼠對藥物敏感性降低的原因之一。

D型肉毒毒素滅鼠劑自研制成功以來已推廣使用多年，累計防治面積已達1 686萬hm2，但主要用于高原鼠兔的大面積防治，雖然對高原鼢鼠、青海田鼠均開展了相應的研究工作，但在更大范圍及其他鼠種上還缺乏更多的數據支撐。肉毒毒素之所以能引起動物的中毒死亡，主要是因為能夠靶向切割其血清型相對應的底物蛋白[8]。鑒于此，國內外很多學者都開展了肉毒毒素活性體外分析的相關研究，如化學合成底物蛋白的多肽并應用于肉毒毒素活性的測定[9]，通過將肽段與GST標簽融合表達后得到重組多肽底物[10]等。根據羅森等[11]的研究可知，小鼠與人體內VAMP2基因編碼的氨基酸同源性大于99%，因此在研究中利用小鼠的VAMP基因序列作為替代進行了VAMP2蛋白的基因表達重組。利用肉毒毒素靶向切割重組VAMP1蛋白的方法可用于今后其他非靶向動物體內D型肉毒毒素底物蛋白的重組構建[12-13]，利用D型肉毒毒素進行靶向切割，間接證實D型肉毒毒素對不同動物的安全性。本研究利用轉錄組測序的方法，分析青藏高原地區草地生態系統中高原鼠兔、高原鼢鼠、青海田鼠和棕背雪雀的VAMP1序列信息，結果顯示高原鼠兔及棕背雪雀體內VAMP1蛋白的基因序列與小鼠VAMP1序列高度一致。大白鼠體內VAMP1蛋白氨基酸序列中的第48、60、61位氨基酸位點均發生突變，尤其是第48位點均為M型，而非Ⅰ型[14]，即高原牧區棕背雪雀對D型肉毒毒素具有一定的敏感性，在現地鼠害防治中應精準控制鼠藥投放劑量，建議采取藥物警戒色趨避鳥類采食毒餌，提高其環境動物安全性。通過底物蛋白的敏感性分析，可獲知鼠害防治區域內相關動物的安全性評價，并借助改良毒餌投放方法或可以在不傷害其他野生動物(肉毒毒素非靶動物)的前提下，指導區域鼠害防治規劃及具體實施。