基于微衛(wèi)星復合擴增的馬來穿山甲個體識別研究

李嘉昊 王 辰 雷 行 逯金瑤 李 立* 李 波，3*

(1.東北林業(yè)大學野生動物與自然保護地學院，哈爾濱，150040；2.湖南省生物多樣性保護中心，長沙，410209；3.國家林業(yè)和草原局野生動植物檢測中心，哈爾濱，150040)

據(jù)CITES的統(tǒng)計數(shù)據(jù)，2014—2018年繳獲的穿山甲非法貿易個體數(shù)量超過14萬只；另據(jù)UNODC的統(tǒng)計數(shù)據(jù)，2015年穿山甲肉類緝獲量占比為15%，2016—2018年占比為1%～2%，但鱗片占比超過95%[3]。1998—2019年，馬來穿山甲和菲律賓穿山甲的數(shù)量急劇下降，馬來穿山甲的種群數(shù)量減少了約80%。穿山甲及其制品非法走私案件頻發(fā)使穿山甲個體識別的法醫(yī)學技術變得尤為重要。

目前，穿山甲個體識別由微衛(wèi)星技術實現(xiàn)[4-5]。最早的微衛(wèi)星位點是2007年基于馬來穿山甲開發(fā)的34個雙核苷酸重復位點[6]，這為亞洲穿山甲個體識別提供了研究基礎。高賽飛[4]從中選出6個多態(tài)性較高的位點，對50份穿山甲鱗片進行個體識別，認定其來自45只個體，但由于樣本質量不高和未進行物種鑒定影響了個體識別的準確率。Sun等[7]從中篩選出10個高多態(tài)性位點，成功對54只中華穿山甲進行了基因分型，組合7個位點即可實現(xiàn)無關個體基因型匹配概率(probability of identity，P(ID))小于0.001，同胞個體基因型匹配概率(probability of identity for siblings，P(ID)sib)小于0.01[8]。Singh等[5]利用其中8個位點構建中華穿山甲和印度穿山甲個體識別體系(pangolin indexing system，PIS)，使用細胞色素b(Cytb)基因確認待測樣本的來源物種，排除了引物對物種適應度的影響。

目前亞洲穿山甲個體識別使用的是雙核苷酸重復的微衛(wèi)星位點，擴增過程中TaqDNA聚合酶的滑動容易導致雙核苷酸重復位點出現(xiàn)影子峰而干擾基因分型，但使用較長重復單位的位點可減少影子峰[9]。同時，微衛(wèi)星復合擴增能夠提升鑒定效率，節(jié)約鑒定成本。根據(jù)國際法醫(yī)遺傳學會(International Society for Forensic Genetics，ISFG)對非人類個體識別的建議[10]，需要優(yōu)先使用四核苷酸重復、復合擴增方法和新引物標準化來重構馬來穿山甲個體識別體系。

1 材料與方法

1.1 樣本采集與DNA提取

收集中華穿山甲、馬來穿山甲、印度穿山甲、樹穿山甲、大穿山甲的肌肉、鱗片和皮膚樣本總計156份，以及非穿山甲對照樣本21份(表1)，將樣本置于冰箱內-20 ℃保存。樣本預處理后利用蛋白酶K消化，后用基因組提取試劑盒(上海百賽生物工程技術股份有限公司)提取和純化總DNA。使用紫外分光光度計(NanoPhotometer-N50，德國Implen)檢測DNA濃度。

表1 試驗樣本信息

1.2 位點篩選和PCR擴增

使用的微衛(wèi)星位點包括6個雙核苷酸重復馬來穿山甲位點[6]；從長尾穿山甲和南非穿山甲中篩選的4個三、四核苷酸重復位點[11-12]，其重復單元經(jīng)測序已確認；以及利用SSRHunter軟件從馬來穿山甲基因組(GCF_014570535.1)[13]中篩選的四核苷酸重復位點(MJL04、MJL05)，這2個位點經(jīng)Primer premier 5.0軟件設計成新引物后加入復合體系中(表2)。

PCR反應采用20.0 μL體系：2×EasyTaqSuperMix(TransGen，北京)10.0 μL，正、反向引物(10 pmol/μL)各0.2 μL，DNA模板2.0 μL，滅菌去離子水7.6 μL。正向引物分別用FAM、HEX和TAMRA熒光染料標記。擴增采用PE9700型DNA擴增儀(PE，美國)。擴增產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳分離(90V，25 min)，并以此檢查所有引物的特異性。

1.3 復合擴增體系優(yōu)化和評估

為優(yōu)化復合擴增體系，使用梯度PCR測試最適退火溫度(60～72 ℃設置15個梯度)。PCR擴增選擇3個反應體積(40、30、20 μL)測試最適體系。PCR產(chǎn)物送生工生物工程(上海)股份有限公司進行毛細管電泳分型，根據(jù)毛細管電泳的信號峰強度調整和確定引物的最終濃度。

選用3份樣本在3種不同的PCR儀器上用相同方案重復3次來測試復合體系的再現(xiàn)性。盲測試驗時選用30份樣本，當所選位點的P(ID)足夠小(0.000 1～0.001 0)時，對比各自基因型，具有相同基因型的樣本認定為同一個體。

利用DNA質量濃度梯度檢測該體系的靈敏性和有效性。DNA質量濃度梯度分為20.0、10.0、5.0、2.0、1.0、0.5 ng/μL。在上述PCR條件下，將DNA稀釋液添加到20.0 μL反應體系中復合擴增。利用7種非穿山甲物種(表1)評估該復合擴增體系的物種特異性。影子峰是雙核苷酸重復位點基因分型分析中常見的現(xiàn)象，分析影子峰峰強度與目的產(chǎn)物峰強度的比例，可更準確地進行基因分型。

1.4 數(shù)據(jù)分析

使用GeneMarker 3.5進行基因分型，Cervus計算等位基因頻率、等位基因數(shù)(number of allele，Na)、有效等位基因數(shù)(Ne)、觀測雜合度(Ho)和期望雜合度(He)[14]。多態(tài)性信息含量(polymorphism information content，PIC)和哈迪-溫伯格平衡(Hardy-Weinberg equilibrium，H-W)用Genepop 4.2計算[15]。基因流使用Popgene 3.2計算。用STRUCTURE分析馬來穿山甲種群的遺傳結構，建系方法與評判標準參照Pritchard等[16]與Evanno等[17]的研究。具體參數(shù)設置：種群個數(shù)(K)預設為1～10，每一個K都運行10次，初始不作數(shù)的迭代為10 000次，MCMC運行100 000次，利用在線軟件STRUCTURE HARVESTER統(tǒng)計馬來穿山甲種群的最佳K值。根據(jù)分型結果使用Population 1.2.32構建基于Nei氏遺傳距離[18]的NJ系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結果與分析

2.1 構建復合擴增體系

通過引物篩選、設計和PCR反應條件優(yōu)化，獲得12個微衛(wèi)星位點的3個復合擴增體系(MP1、MP2和MP3；圖1)，每個位點的熒光產(chǎn)物峰強度大于1 000相對熒光單位(relative fluorescent units，RFU)。PCR擴增的最適程序：94 ℃預變性3 min；94 ℃變性45 s，56 ℃退火45 s，72 ℃延伸60 s，30個循環(huán)；94 ℃變性45 s，60 ℃退火45 s，72 ℃延伸60 s，25個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。

圖1 復合擴增體系Fig.1 Multiplex amplification system

2.2 復合擴增體系的驗證

12個微衛(wèi)星位點在馬來穿山甲種群(n=135)中共檢出155個等位基因，所有等位基因組合成分型標準物。PAN_12和PAN_28位點的等位基因數(shù)量≤4個，而MJA05、MJA07、MJA13、MJA15和MJA27位點的等位基因數(shù)量均大于15個(附錄1)。

附錄1 12個微衛(wèi)星位點等位基因及基因頻率

非父排除概率(probability of exclusion，PE)指非親子關系能被遺傳標記排除的概率。PE-1P指兩個親本的基因型未知時的排除概率；PE-2P指當一個親本的基因型已知的排除概率；PE-PP指兩個親本的基因型均已知時的排除概率。12個位點的累計P(ID)為6.48×10-16，P(ID)sibs為9.65×10-6，累計PE為0.999 8～0.999 9(表3)。體系內的6個三、四核苷酸重復位點累積P(ID)為3.48×10-6，P(ID)sibs為9.7×10-3，便可滿足法醫(yī)非人類判別標準(P(ID)<0.001 0)[8]。

新構建的復合擴增體系在相同條件下進行重復性測試，所有馬來穿山甲樣本均能成功基因分型。在不同PCR儀器上擴增的每個樣本在12個多態(tài)性位點上的基因型完全一致。盲測結果可以準確地將30份樣本判定為源自20個不同個體，所有樣本僅需1次分型，準確率為100%。

使用DNA濃度梯度進行靈敏度測試。當DNA質量濃度為0.5 ng/μL時，所有位點均能獲得準確分型，最低峰強度為180 RFU，表明該復合擴增體系內所有位點能在微量的DNA檢材中得到準確的分型結果(圖2)。

圖2 靈敏度測試Fig.2 Sensitivity test

對于穿山甲科其他物種，MJA12、MJL05和MJA15位點在樹穿山甲樣本中未檢測到信號；所有位點在大穿山甲樣本中檢測到信號；MJA12和MJA15位點在中華穿山甲樣本中未檢測到信號。對于非穿山甲科物種，馬(Equuscaballus)和白犀(Ceratotheriumsimum)有2個位點檢測到信號；家豬(Susscrofadomestica)有3個位點檢測到信號，牛(Bostaurus)、賽加羚羊(Saigatatarica)和東北兔(Lepusmandshuricus)都沒有檢測到信號(表4)。

表4 物種特異性分析

影子峰分析表明，三、四核苷酸重復位點相較于雙核苷酸重復位點在基因分型時更加保守、可靠性更高(表5)。分析影子峰產(chǎn)生的概率和影子峰占目的峰強度的平均值，可有效篩除峰強度明顯偏低的影子峰，從而最大限度消除影子峰對基因分型的影響。

表5 影子峰分析

2.3 種群遺傳分析

12個位點共檢測到155個等位基因(附錄1)，各位點有效等位基因(Ne)為1.219～10.602，平均值為6.462，其中PAN_12位點有效等位基因數(shù)量最少，MJA15位點有效等位基因數(shù)量最多。各位點期望雜合度(He)為0.180～0.912，其中PAN_12位點最小，MJA15位點最大。各位點觀測雜合度(Ho)為0.140～0.822，其中PAN_12位點最小，MJA27位點最大(表6)。

表6 12個微衛(wèi)星位點多態(tài)性

分析135只涉案馬來穿山甲的種群遺傳結構，結果如圖3所示。隨著假設種群數(shù)(K)增加，lnP(D)逐漸增加，而變化率逐漸減小，當K在2～3變化時幅度最大。當K=3時，lnP(D)的衍生值ΔK取最大值(25.6)，結合lnP(D)的變化趨勢和ΔK值，最終確定：K=3為最佳值，能反映待測種群的真實情況。將全部涉案個體劃分為3個種群：MJ1、MJ2和MJ3。MJ3種群遺傳結構較為單一，MJ1和MJ2種群則相對復雜，說明MJ1和MJ2種群間的基因交流相對較多，MJ3與其他種群間的基因交流較少。

圖3 馬來穿山甲結構聚類Fig.3 Structure cluster diagram of 135 Malay pangolins 注：紅色表示MJ1種群；綠色表示MJ2種群；藍色表示MJ3種群 Note：The red individuals are from the population of MJ1.The green individuals are from the population of MJ2. The blue individuals are from the population of MJ3

NJ系統(tǒng)發(fā)育樹有類似結果(圖4)。MJ2和MJ3種群形成了獨立的亞支系，MJ1種群無獨立的亞支系，但與MJ2種群個體混雜一起，表明MJ1與MJ2種群間遺傳距離較近，MJ3與MJ1、MJ2種群間遺傳距離相對較遠。

圖4 基于12個微衛(wèi)星位點遺傳距離構建NJ系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 NJ tree based on genetic distance of 12 microsatellite locus 注：紅色表示MJ1種群；綠色表示MJ2種群；藍色表示MJ3種群 Note：The red individuals are from the population of MJ1.The green individuals are from the population of MJ2.The blue individuals are from the population of MJ3

MJ1種群有2個位點顯著偏離H-W平衡(P<0.01)，10個位點符合H-W平衡(P>0.05)。MJ2種群有5個位點顯著偏離H-W平衡(P<0.01)，6個位點符合H-W平衡(P>0.05)，1個位點偏離H-W平衡(0.010.05)，1個位點偏離H-W平衡(0.01

附錄2 哈迪-溫伯格平衡檢測

固定指數(shù)(fixation index，F(xiàn)ST)可以體現(xiàn)種群間的遺傳分化程度：FST<0.05表示弱分化，0.05≤FST≤0.25表示中度分化，F(xiàn)ST>0.25表示高度分化。結果表明，MJ1和MJ2種群處于弱分化水平，MJ1和MJ2與MJ3種群分化程度較高，屬于中度分化(表7)。MJ1和MJ2種群的遺傳距離較近，二者與MJ3種群的遺傳距離較遠，這與NJ系統(tǒng)發(fā)育樹的結果相同。

表7 MJ1、MJ2和MJ3種群間固定指數(shù)和種群間遺傳距離

3 討論

3.1 位點篩選和個體識別體系重構

ISFG建議非人類個體識別時優(yōu)先使用四核苷酸重復和復合擴增方法[10]。本研究篩選了6個雙核苷酸重復位點和6個三、四核苷酸重復位點組成3個復合擴增體系(MP1、MP2和MP3)。盡管雙核苷酸重復位點出現(xiàn)影子峰的概率較高，增加了基因分型的難度，但是分析影子峰峰強度與目的產(chǎn)物峰強度的比例，可以消除影子峰對分型的影響，提高基因分型的準確度[19]。同時，MP1體系相對于MP2和MP3靈敏度更高，包含三、四核苷酸重復位點更多，其基因分型的優(yōu)勢更大。若檢材DNA質量不佳，推薦優(yōu)先使用MP1進行個體識別鑒定。

本研究重構的馬來穿山甲個體識別體系具有較高的鑒別力，其P(ID)值和P(ID)sibs值遠大于已發(fā)表的個體識別系統(tǒng)[5，7]。該體系內6個三、四核苷酸重復位點組合便可滿足非人類個體識別的法醫(yī)學標準(P(ID)<0.001)[8]。物種特異性分析表明，中華穿山甲和大穿山甲樣本中檢測出10個位點以上的特異峰，說明該體系經(jīng)大樣本驗證后可適用于中華穿山甲和大穿山甲的個體識別和親緣關系鑒定。

鱗片是穿山甲非法貿易的主要部位，占比超過95%[3]。目前，在處理穿山甲鱗片非法貿易案件時，如何認定個體數(shù)量是一大難題，主要通過穿山甲鱗片干重來評估盜獵個體數(shù)量，但鑒定結果不準確。本研究重構的馬來穿山甲個體識別體系可有效對鱗片樣本進行個體識別，為解決上述難題提供了新方案。

3.2 種群遺傳分析

本研究計算的馬來穿山甲種群遺傳多樣性水平與前人的研究結果[4]相近，各位點He、Ho和PIC平均值的細微差異可能與選擇的位點和樣本數(shù)量差異有關(表8)。同時，馬來穿山甲種群遺傳多樣性水平與印度穿山甲[5]類似，大于中華穿山甲[5-6]和非洲的4種穿山甲[11-12]。非洲4種穿山甲種群遺傳多樣性水平與其分布范圍和種群數(shù)量呈正相關[12]。亞洲穿山甲中的中華穿山甲種群遺傳多樣性較低，應該與其瀕危狀況和種群數(shù)量密切關聯(lián)。

表8 穿山甲科物種種群遺傳多樣性對比

Nash等[20]使用全基因組篩選的單核苷酸多態(tài)性位點(single nucleotide polymorphism，SNPs)分析了83只馬來穿山甲的種群遺傳結構，結果表明這些馬來穿山甲可分為3個種群，分別來自婆羅洲、印度尼西亞爪哇島和新加坡或蘇門答臘島。本研究的馬來穿山甲種群遺傳結構分析也得出了類似結果。但是，由于所用樣本為非法貿易查獲，無法追溯樣本來源地，不能據(jù)此推測該批樣本的原產(chǎn)地。依據(jù)非洲象牙的微衛(wèi)星個體識別體系可用于象牙產(chǎn)地追蹤[21]，可在國際上推廣利用本研究的馬來穿山甲個體識別體系構建已知樣本數(shù)據(jù)庫，為非法貿易案件中穿山甲各類檢材來源地的鑒定奠定基礎。

總之，由12個微衛(wèi)星位點重構的馬來穿山甲個體識別體系具有可靠性強、準確率及靈敏度高和成本低等優(yōu)點，可適用于多種類型的檢材。同時，該體系可用于評估馬來穿山甲種群遺傳多樣性和遺傳結構。

致謝：本研究試驗樣本的采集得到了國家林業(yè)和草原局野生動植物檢測中心的徐艷春教授、金煜教授、白素英副教授、馬躍工程師、王震工程師和劉微工程師的大力支持與幫助，在此一并致謝。