一種新型近紅外熒光探針用于Aβ40聚集體的檢測

徐蘊澤，堯雨斯，呂光磊，李春霞

（1.山東大學前沿交叉科學青島研究院，分子科學與工程研究院，山東 青島 266237；2.浙江師范大學 化學與生命科學學院，浙江 金華 321004）

1 引 言

阿爾茨海默癥（Alzheimer's disease，AD）是一種常見的神經退行性疾病，與癌癥、心腦血管疾病一起成為當下危害人類健康的最主要的三大疾病[1]。阿爾茨海默癥主要發病于老年人群體，嚴重威脅著老年人的身心健康[2]。由于阿爾茨海默癥的發病機制尚不清楚，因此至今沒有有效的藥物能夠徹底地根除這一病癥，只能對該疾病的前期和中期的癥狀實現一定的抑制和緩解治療效果。β-淀粉樣蛋白（Aβ）作為阿爾茨海默癥病理性標志物之一，與AD的發病之間有著密切的關系。因此，對于Aβ蛋白的檢測對AD的診療具有重要的意義。目前用于Aβ檢測的手段主要有：正電子發射斷層掃描成像（PET）、磁共振成像（MRI）、光聲成像（PA）以及熒光成像（FI）等。相對于其他成像方法來說，熒光成像方法具有設備低廉、檢測方便、響應快速、靈敏度高等特點[3-6]，因此被廣泛應用于蛋白檢測。

近幾年來，關于Aβ聚集體的檢測性熒光探針報道較多。最主要的分為苯并噻唑類熒光探針[7-9]、姜黃素類熒光探針[10-15]、BODIPY類熒光探針、花菁類熒光探針[16-19]、香豆素類熒光探針[20-21]以及喹啉二腈類熒光探針[22-24]等。這些探針均具有良好的熒光發射波長以及較強的蛋白結合能力，但是大部分用于檢測Aβ42聚集體，而用于檢測Aβ40聚集體的熒光探針報道則比較少。Aβ40在AD早期患者大腦中是含量最多的一種Aβ物種，而且在AD的發病過程中，Aβ40聚集體發揮著重要作用[25]。因此，能夠實現對Aβ40聚集體的特異性檢測就顯得非常重要。

本工作中基于甲氧基喹啉結構設計的熒光探針C-1，能夠實現對Aβ40聚集體的特異性檢測，該探針對Aβ40展現出良好的選擇性和結合能力（Kd=3.072 μmol/L）。除此之外，該探針與Aβ40聚集體響應速度快，與目標蛋白結合后幾秒鐘就可發出強烈的熒光，并且能夠保持長時間的熒光穩定性，具有在生物組織成像上的良好應用前景。

2 實 驗

2.1 試劑和儀器

實驗過程中用到的各種原料藥品均為分析純，購買自上海百靈威化學技術有限公司，純化用的有機溶劑均為分析純，購買自國藥集團藥業股份有限公司。液相核磁共振波譜儀AV-600 NMR，AV-400 NMR，Bruker；高分辨率質譜儀MicroTOF10257，Bruker；熒光分光光度計Hitachi F-4600，日本日立高新技術公司；紫外-可見吸收光譜儀UH-5300，上海森信實驗儀器有限公司；冷凍干燥機SCIENTZ-10N，寧波新芝生物科技有限公司。

2.2 探針C-1的合成及表征

圖1為探針C-1的合成路線，具體合成方法及表征數據如下。

圖1 探針C-1的合成路線Fig.1 Synthetic route for the probe C-1

化合物KL-1的合成：稱取6-甲氧基-2-甲基喹啉（1.73 g,10 mmol）溶解到10 mL乙腈溶液中，再加入碘甲烷（2.13 g，15 mmol），加熱回流8 h，待冷卻到室溫，觀察到有白色固體析出，抽濾得到產物KL-1（白色固體，94.6%）。1H NMR（400 MHz，DMSO）δ=8.94（d,J=8.6 Hz,1H）,8.51（d,J=9.4 Hz,1H）,8.05（d,J=8.6 Hz,1H）,7.84（dt,J=5.1,2.8 Hz,2H）,4.42（s,3H）,4.00（s,3H）,3.02（s,3H）。

化合物NH-1的合成：稱取6-羥基-2-萘甲醛（0.86 g，5 mmol）和焦亞硫酸鈉（1.90 g，10 mmol）于100 mL的圓底燒瓶中，加入30 mL的蒸餾水作為溶劑，再加入二甲胺水溶液10 mL，140℃條件下加熱回流反應72 h，待到反應結束后冷卻至室溫，飽和食鹽水洗滌，用乙酸乙酯萃取粗產物，加入無水硫酸鈉除水，旋干后上樣進行柱純化，用乙酸乙酯/石油醚=1∶10做洗脫劑，得到純的產物NH-1（黃綠色，12.5%）。1H NMR（400 MHz,CDCl3）δ=10.03（s,1H）,8.17（s,1H）,7.88～7.85（m,1H）,7.84（d,J=2.0 Hz,1H）,7.69（d,J=8.6 Hz,1H）,7.20（dd,J=9.1,2.6 Hz,1H）,6.91（d,J=2.5 Hz,1H）,3.15（s,6H）。

化合物C-1的合成：稱取化合物NH-1（39.8 mg，0.2 mmol）和化合物KL-1（63.0 mg，0.2 mmol）加 入到無水乙醇溶液中，再加入幾滴哌啶，回流反應8h，待反應冷卻后用甲醇/二氯甲烷=1∶50作洗脫劑，進行柱純化，旋轉蒸發后得到產物C-1（紅色固 體，28.3%）。1H NMR（400 MHz,DMSO）δ=8.72（d,J=8.9 Hz,1H）,8.37（dd,J=18.6,9.2 Hz,2H）,8.17～8.04（m,2H）,7.95（d,J=8.4 Hz,1H）,7.69（dt,J=18.2,8.7 Hz,5H）,7.14（d,J=10.2 Hz,1H）,6.81（s,1H）,4.43（s,3H）,3.97（s,3H）,3.02（s,6H）。13C NMR（150 MHz,DMSO）δ=158.91,153.96,150.20,147.03,142.27,136.77,134.92,132.01,130.35,129.73,128.71,127.07,126.01,125.66,125.05,121.48,121.33,116.81,116.46,109.01,105.66,56.64,55.38。HRMS（ESI,m/z）:calcd for C25H25N2O+,369.196 1;f ound:369.196 7。

2.3 各種蛋白的制備

Aβ40單體的制備：稱取Aβ40單體蛋白1 mg，溶解于2 mL pH=7.4的磷酸緩沖溶液（PBS）中，搖晃均勻，配制成為100 μmol/L的溶液，放入冰箱冷凍備用。

Aβ42單體的制備：稱取Aβ42單體蛋白1 mg，溶解于2 mL PBS溶液中，搖晃均勻，配制成為100 μmol/L的溶液，放入冰箱冷凍備用。

VQIVYK短肽蛋白的制備：稱取VQIVYK短肽蛋白1 mg，溶解于2 mL的PBS溶液中，再加入1.44 mg的肝素鈉，磁力攪拌2～3 d，配制成為600μmol/L的溶液，放入冰箱冷凍備用。

Aβ40聚集體的制備：稱取Aβ40單體蛋白1 mg，溶解于2 mL PBS溶液中，磁力攪拌2～3 d，配制成為100 μmol/L的溶液，放入冰箱冷凍備用。

Aβ42聚集體的制備：稱取Aβ42單體蛋白1 mg，溶解于2 mL PBS溶液中，磁力攪拌2～3 d，配制成為100 μmol/L的溶液，放入冰箱冷凍備用。

Amylin蛋白的制備：類似于Aβ蛋白的制備，取0.78 mg溶解于2 mL PBS溶液中，磁力攪拌2～3 d，配制成為100 μmol/L的溶液，放入冰箱備用。

2.4 活性物質的制備

ROS/RNS溶 液 的 配 制：取20.24 μL的30%H2O2溶液定容至10 mL去離子水中，配制成為20 mmol/L的H2O2溶液。取有效氯含量為5%的Na-ClO溶液10 μL定容于2 mL去離子 水 中，配制 成為5 mmol/L的HOCl溶液。取27.7 μL的叔 丁 基過氧化氫定容于10 mL的去離子水中，配制成為20 mmol/L的TBHP溶液。稱取59.59 mg的亞硝基鐵氰化鈉定容于10 mL去離子水中，配制成為20 mmol/L的NO溶液。取54.24 mg的偶氮二異丁脒鹽酸鹽定容于10 mL去離子水中，配制成為20 mmol/L的ROO·溶液。用1 mmol/L的Fe2+溶液和200 μmol/L的H2O2溶液配 制 成 為200 μmol/L的·OH溶液。用1 mmol/L的Fe2+溶液和200 μmol/L的TBHP溶液配制成200 μmol/L的TBO·溶液。

陰陽離子溶液的配制：稱取4 mg的無水乙酸鈉定容于5 mL去離子水中，配制成為10 mmol/L的CO3COO-溶液。同理，稱取5.3 mg的無水碳酸鈉配制成CO32-溶液。稱取12.3 mg的硫酸鎂配制成SO42-溶液。稱取2.9 mg的氯化鈉配成Cl-溶液。稱取2.1 mg的氟化鈉配制成F-溶液。稱取8.3 mg的碘化鉀配制成I-溶液。稱取3.4 mg的亞硝酸鈉配制成NO2-溶液。稱取8.7 mg的低亞硫酸鈉配制成S2O42-溶液。稱取8.8 mg的乙酸鎳配制成Ni2+溶液。稱取10.2 mg的氯化鎂配制成Mg2+溶液。稱取12.1 mg的六水氯化鋁配制成Al3+溶液。稱取8.8mg的乙酸鈣配制成Ca2+溶液。稱取3.7 mg的氯化鉀配制成K+溶液。稱取13.9 mg的七水合硫酸亞鐵配制成Fe2+溶液。稱取8.6 mg的氯化銅配制成Cu2+溶液。稱取3.9 mg乙酸銨配制成NH4+溶液。稱取10.97 mg的乙酸鋅配制成Zn2+溶液。

氨基酸溶液的配制：分別稱取5.8 mg的L-脯氨酸、5.3 mg的L-絲氨酸、4.5 mg的丙氨酸、12.3 mg的 谷 氨酰 胺、5.9 mg的 纈 氨 酸、6.0 mg的蘇 氨酸、6.6 mg的異亮氨酸、9.1 mg的酪氨酸、7.5 mg的甲硫氨酸、10.2 mg的色氨酸、9.0 mg的苯丙氨酸、6.1 mg的半胱氨酸、7.4 mg的谷氨酸和7.3 mg的賴氨酸定容于5 mL的PBS溶液中，配制成對應的10 mmol/L氨基酸溶液。

還原性物質溶液的配制：分別取N-乙酰半胱氨酸8.2 mg、谷胱甘肽15.4 mg、葡萄糖9.9 mg以及37%～40%的甲醛水溶液3.7 μL定容至5 mL的PBS溶液中，配制成10 mmol/L的相應溶液。

2.5 結合常數（Kd）的測定

采用固定的蛋白濃度，用不同濃度的探針對其進行熒光滴定的方法，得出相應的熒光值，再通過非線性擬合計算得出探針對目標蛋白的結合常數Kd值，以此來進行評估探針與蛋白的結合能力。

2.6 檢出限（LOD）的測定

首先，對探針的PBS溶液進行空白測定，用熒光分光光度計連續測11次，得出方差σ，作為儀器的誤差校正，再根據蛋白對探針濃度滴定的線性方程斜率k，代入檢出限（LOD）計算公式D=3σ/k，計算得出檢出限。

3 結果與討論

3.1 選擇性和結合力

首先，測定了探針C-1的吸收、熒光激發和發射光譜（圖S1），得出其光譜屬性，C-1的發射波長在640 nm處。之后對該探針的性能進行測定，首先測定了C-1對各種蛋白的選擇性。選用VQIVYK短肽（Val-Gln-Ile-Val-Tyr-Lys，又稱PHF6，Tau蛋白R3序列中一段關鍵蛋白）、Aβ40單體、Aβ40聚集體、Aβ42單體以及Aβ42聚集體進行測試。探針的濃度為2 μmol/L（PBS溶液，pH=7.4），VQIVYK短肽濃度為50 μmol/L，其余各種蛋白的濃度均為5 μmol/L（PBS溶液，pH=7.4）。由圖2（a）可以明顯地看出，探針C-1與Aβ40聚集體結合后表現出的熒光強度最強，對其他各種蛋白的響應很弱。我們測試了探針結合Aβ40前后的絕對熒光量子產率變化。未與Aβ40結合時，探針的量子產率為ΦC-1=0.6%；與Aβ40結合后，其量子效率得到了較大的提升，ΦC-1+Aβ=2.4%。以上結果說明探針C-1可以與Aβ40聚集體有良好的熒光響應和選擇性。除此之外，我們還測試了探針C-1對人血清白蛋白以及Amylin蛋白的選擇性，由圖S2可以看出，人血清蛋白和Amylin蛋白同樣不會對探針C-1的選擇性造成影響。研究了探針C-1與Aβ40聚集體的結合能力。使用固定的蛋白濃度，采用探針對其進行熒光滴定的方法，得出相應的熒光值，再通過非線性擬合得出探針對Aβ40聚集體的結合數值，以此來評估探針與蛋白的結合能力。由圖2（b）可見，結合常數Kd=3.072 μmol/L，R2=0.973 2，探針C-1與Aβ40聚集體有著較強的結合能力。進一步探究探針C-1與Aβ40聚集體濃度的關系，由圖2（c）可見，固定探針濃度為2 μmol/L，用Aβ40聚集體對探針進行濃度滴定。隨著Aβ40聚集體濃度由0～7 μmol/L逐漸增加，探針C-1的熒光強度也隨之逐漸增強，且強度增幅較大，使探針能夠對目標蛋白的定性檢測更加明顯。通過對熒光數值進行定量的數據處理，能夠得出探針C-1與Aβ40聚集體結合的線性關系，R2=0.96（圖2（d））。除此之外，探針C-1表現出較高的靈敏度，檢出限D=2.77 μmol/L。

圖2 探針C-1對Aβ40的響應特性。（a）C-1對各種蛋白的選擇性；（b）C-1的結合常數；（c）Aβ40對C-1的濃度滴定；（d）C-1與Aβ40濃度的線性關系以及檢出限。Fig.2 Response characteristics of probe C-1 to Aβ40.（a）Selectivity of C-1 for proteins.（b）Binding constant of C-1.（c）Concentration titration of Aβ40 to C-1.（d）Linearity of C-1 and Aβ40 concentrations and detection limits.

3.2 抗干擾性

熒光探針的亮度和穩定性是決定熒光成像技術的靈敏度和檢測限的重要因素[26]。因此，我們研究了探針C-1的抗干擾穩定性測試，分別測試了探針C-1在多種氨基酸、RNS/ROS、各種陰陽離子以及還原性物質存在下的抗干擾能力。首先測定探針C-1與Aβ40聚集體結合后在多種氨基酸存在下的抗干擾性，在2 μmol/L（PBS溶液，pH=7.4）的探針和5 μmol/L（PBS溶液，pH=7.4）的Aβ 40聚集體存在的條件下，分別加入5 μmol/L（PBS溶液，pH=7.4）的L-脯氨酸（Pro）、L-絲氨酸（Ser）、丙氨酸（Ala）、谷氨酰胺（Gln）、纈氨酸（Val）、蘇氨酸（Thr）、異亮氨酸（Ile）、酪氨酸（Tyr）、甲硫氨酸（Met）、色氨酸（Trp）、苯丙氨酸（Phe）、半胱氨酸（Cys）、谷氨酸（Glu）和賴氨酸（Lys）。通過熒光分光光度計測定熒光強度變化，在多種氨基酸存在下，Aβ40聚集體與探針C-1結合后的熒光強度無明顯變化，各種氨基酸的存在不會對探針的檢測作用造成干擾（圖3（a））。

圖3 探針C-1的抗干擾性測試。（a）A～P：探針、Aβ40、Ala、Cys、Gln、Glu、Ile、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、Val；（b）A～I：探針、Aβ40、ROO·、HOCl、H2O2、TBO·、TBHP、NO、·OH；（c）A～I：探針、Aβ40、Al3+、Ca2+、Fe2+、Zn2+、K+、Mg2+、NH4+、Ni2+；（d）A～J：探針、Aβ40、Cl-、CO32-、CO3COO-、F-、I-、NO2-、S2O42-、SO42-。Fig.3 Interference resistance of the probe C-1.（a）A-P：probe，Aβ40，Ala，Cys，Gln，Glu，Ile，Lys，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr，Val.（b）A-I：probe，Aβ40，ROO·，HOCl，H2O2，TBO·，TBHP，NO，·OH.（c）A-I：probe，Aβ40，Al3+，Ca2+，Fe2+，Zn2+，K+，Mg2+，NH4+，Ni2+.（d）A-J：probe，Aβ40，Cl-，CO32-，CO3COO-，F-，I-，NO2-，S2O42-，SO42-.

選用ROO·、HOCl、H2O2、TBO·、TBHP、NO以及·OH等多種ROS/RNS來測定熒光探針C-1在該類活性物質存在條件下的抗干擾性。探針濃度2 μmol/L（PBS溶液，pH=7.4），Aβ40聚集體和各種活 性 物 質 的 濃 度 均 為5 μmol/L（PBS溶 液，pH=7.4）,進行相關的實驗測試。由圖3（b）可見，探針C-1在多種活性氧和活性氮物質存在下，其熒光強度仍然能夠維持一個穩定的狀態，說明探針C-1的熒光成像不受該類物質的干擾。

然后，我們測定了探針C-1在不同陰陽離子存在條件下的抗干擾能力。分別選用Al3+、Ca2+、Fe2+、Zn2+、K+、Mg2+、NH4+和Ni2+等陽離子（圖3（c））,以 及Cl-、CO32-、CO3COO-、F-、I-、NO2-、S2O42-和SO42-等陰離子（圖3（d））來測定探針C-1在生物環境溶液中的抗干擾能力。探針的濃度為2 μmol/L（PBS溶液，pH=7.4），目標蛋白和各種離子的濃度均為5 μmol/L（PBS溶液，pH=7.4）。實驗結果表明，探針C-1同樣表現出了良好的抗干擾性。

3.3 穩定性

接下來，我們測定了探針在谷胱甘肽（GSH）、N-乙酰-L-半胱氨酸（NAC）、甲醛（HCHO）以及葡萄糖（Glucose）四種還原性物質存在下的穩定性。探針濃度為2 μmol/L（PBS溶液，pH=7.4），目標蛋白的濃度為5 μmol/L（PBS溶液，pH=7.4），還原性物質的用量分別為目標蛋白的0，1，2.5，5，10個當量。探針C-1在谷胱甘肽（圖4（a））、NAC（圖4（b））、甲醛（圖4（c））以及Glucose（圖4（d））的0～10個當量存在條件下，依舊能夠與Aβ40聚集體結合且保持良好的熒光穩定。探針C-1在生物體系溶液環境中，完全不受多種還原性物質的干擾。

圖4 探針C-1與Aβ40在GSH（a）、NAC（b）、HCHO（c）和葡萄糖（d）存在情況下的穩定性測試。Fig.4 Stability of the probe C-1 with Aβ40 in the presence of GSH（a），NAC（b），HCHO（c）and Glucose（d）.

我們還測定了探針C-1隨時間變化以及在不同pH值下的穩定性。由圖S3（a）可以看出，探針C-1與Aβ40響應極快，加入后幾秒鐘就可發出強熒光，且隨時間延長能夠保持較強的穩定性，經過30 min后仍然能保持熒光穩定。配制pH值范圍為2～11的磷酸緩沖溶液。由圖S3（b）可以清晰地看出，無論是在酸性或者是堿性條件下，探針C-1自身以及與Aβ 40結合后，均能夠保持熒光穩定性。最后，我們測定了該探針的生物相容性，通過MTT法[27]進行評估。選用Hela細胞在37℃條件下與探針共同孵育24 h，由圖S4可以看出，即使探針的濃度達到了40 μmol/L，細胞的存活率仍然能夠達到80%以上，證明了該探針的低毒性。

4 結 論

在本工作中，我們設計合成了近紅外熒光探針C-1，實現了對Aβ40聚集體良好的特異性檢測。探針C-1具有640 nm的熒光發射波長，且與Aβ40聚集體的結合能力強，響應速度快，抗干擾能力強，穩定性好，并且背景干擾小，在溶液測試中表現出較好的性能。除此之外，該探針的生物相容性良好。綜上所述，探針C-1具備的這些優點可能會使其在生物成像上具有一定的應用潛力。

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