PCA-TTC顯色法測定工業循環水中異養菌的實驗研究

婁紅杰

（國能榆林化工有限公司，陜西 神木 719300）

異養菌是一種利用環境中的有機物進行氧化發酵得到細胞所需的營養物質的菌種[1]。在工業循環冷卻水中，以異養菌的生長繁殖最快，數量也最多，它基本上代表了水中全部細菌的數量[2]。可以說是在循環冷卻水中具有指示性和代表性的細菌種類，這類細菌能產生致密的黏液，粘附水中細小的懸浮物及其他絲狀菌、霉菌、藻類和原生動物等，從而形成黏泥，堵塞管道、腐蝕設備、影響換熱效率[3-4]。因此，準確測定循環水中異養菌含量對于控制微生物危害具有重要意義。我國工業循環冷卻水處理設計規范[5]要求異養菌監控指標小于等于1×105CFU/mL，通過對其監測可以了解微生物危害的總趨勢。

目前，國內循環冷卻水系統中異養菌的檢測方法，多采用標準平皿計數法[6-7]，即將待測水樣用10倍稀釋法稀釋至需要的稀釋度，用吸量管將不同稀釋度試樣1 mL分別接種到無菌培養皿中，將冷卻至（45±1）℃滅菌后的營養瓊脂培養基（以下簡稱NA，基本組成為蛋白胨1%，牛肉膏0.3%，氯化鈉0.5%，瓊脂1.5%～2.0%）10～15 mL灌入培養皿內，混合均勻；待固化后置于（29±1）℃生化培養箱中培養72 h，培養期滿后按照計數方法進行計數。但此方法主要存在兩方面問題[8]，一是由于有些菌落微小或菌落蔓延，菌落與NA的反差不明顯（都呈現黃色），培養皿內出現氣泡，肉眼或放大鏡難于識別和計數的情況，易導致人為讀數誤差。二是此法所得的菌落數可能要低于其正常存活的活細胞的數目，檢出率低，檢測準確度有待提高。

平板計數培養基（以下簡稱PCA，基本組成為胰蛋白胨0.5%，酵母浸粉0.25%，葡萄糖0.1%，瓊脂1.5%）是國際公認的菌落計數培養基，此種培養基不但不會損害水中的微生物細胞，還能夠修復受損細胞并在不影響細菌本身的情況下促進其生長繁殖。筆者通過用PCA替代NA，并在PCA中加入2，3，5-氯化三苯基四氮唑（又名紅四氮唑，以下簡稱TTC），使細菌菌落長成紅顏色，易于辨別，建立PCA-TTC顯色法測定水中異養菌含量，為循環冷卻水水質監控提供可靠依據。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

密里博純水機：Milli-Q Advantage A10型，法國密理博公司。

超凈工作臺：含紫外燈，GAT-2DC型，濟南格艾特公司。

高壓蒸汽滅菌器；WAC-47型，韓國大韓公司。

生化培養箱：（0～50）℃±1℃，LRH-150F型，上海天呈有限公司。

電熱鼓風干燥箱：溫度可控制在（60～280）℃±2℃，上海博迅醫療生物儀器股份有限公司。

自動菌落計數器：icount 30型，杭州迅數有限公司。

電子分析天平：MSA224S-1CE-DU型，感量0.1 mg，德國賽多利斯公司。

2，3，5 -氯化三苯基四氮唑（TTC）：又名紅四氮唑，分析純，上海麥瑞爾化學技術有限公司。

市售平板計數瓊脂（PCA）：生化試劑，北京奧博星生物技術有限責任公司。

濃鹽酸：分析純，ρ=1.19 g/mL，北京化工廠。

氯化鈉：分析純，天津北聯精細化學品開發有限公司。

硫代硫酸鈉：分析純，天津北聯精細化學品開發有限公司。將適量的硫代硫酸鈉放入超凈工作臺內，并均勻地攤在離紫外燈30 cm處，滅菌30 min。脫除水樣中的余氯用。

醫用乙醇：75%（體積分數），天津風船化學試劑科技有限公司。

牛皮紙：衡水凱盛源醫療器械有限公司。

醫用脫脂棉：衡水凱盛源醫療器械有限公司。

醫用脫脂紗布：衡水凱盛源醫療器械有限公司。

玻璃培養皿：d 90 mm，（160±2）℃滅菌2 h，四川蜀玻（集團）有限責任公司。

刻度吸管：1 mL，5 mL，10 mL。（160±2）℃滅菌2 h。天津市天玻玻璃儀器有限公司。

試管：做鹽水管用，d 20 mm×200 mm，四川蜀玻（集團）有限責任公司。

磨口試劑瓶：500 mL，天津市天玻玻璃儀器有限公司。做采樣瓶用，將洗凈并烘干后的500 mL磨口試劑瓶瓶口和瓶頸用牛皮紙包好，扎緊，置電熱干燥箱中，于（160±2）℃滅菌2 h。

搪瓷量杯：1 000 mL，廣西南寧融儀實驗儀器有限公司。

錐形瓶：250 mL，500 mL，1 000 mL。天津市天玻玻璃儀器有限公司。

試驗用水為超純水，由純水機直接制備。

1.2 溶液配制

TTC水溶液（質量分數）：0.5%，1.0%，2.0%。分別稱取0.5、1.0、2.0 gTTC，溶解于100 mL無菌水中，放于無菌棕色試劑瓶中，置于冰箱備用；

PCA-TTC培養基：稱取PCA瓊脂23.5 g，加入純水約950 mL，攪拌加熱煮沸至完全溶解，趁熱用醫用脫脂棉和脫脂紗布過濾于搪瓷量杯中，用熱水補充至1 000 mL，用氫氧化鈉溶液調節pH 7.2～7.4，然后加入一定濃度的TTC水溶液1 mL，混勻，（121±1）℃高壓滅菌15 min，備用。

生理鹽水：0.85%，稱取8.5 g氯化鈉，溶解在1 000 mL水中。

無菌稀釋水：將生理鹽水分裝在試管中，每管9 mL，塞上棉塞，用牛皮紙把試管口包好，（121±1）℃高壓滅菌15 min，備用。

氫氧化鈉溶液：40 g/L，稱取40 g氫氧化鈉，溶于1 000 mL水中。

1.3 實驗方法

1.3.1 不同TTC濃度下PCA培養基的制備

配制5 000 mL的PCA瓊脂，并分成9份（3×100 mL、3×500 mL、3×1 000 mL），然后按照正交試驗表分別對應加入0.5%、1.0%、2.0%的TTC水溶液各1 mL，混勻，制備成不同TTC濃度下的PCA-TTC培養基，并分裝在不同錐形瓶中，塞上棉塞，用牛皮紙把瓶口包好，（121±1）℃高壓滅菌15 min，備用。

1.3.2 樣品選取

某煤制烯烴企業循環冷卻水系統一循氧化型殺生劑連續投加的是三氯異氰尿酸+次氯酸鈉，非氧化型殺生劑沖擊投加的是異噻唑啉酮CW-8803。二循氧化型殺生劑連續投加的是活性溴（JH-714），非氧化型殺生劑沖擊投加的是異噻唑啉酮CW-8803和有機胍類，交替投加。選取一循和二循水樣進行試驗。

1.3.3 樣品測試

將待測試樣（硫代硫酸鈉脫氯后的）放入超凈工作臺中，無菌操作，用10倍稀釋法稀釋至需要的稀釋度，用無菌吸量管將不同稀釋度試樣分別接種到無菌培養皿中，每個稀釋度重復接種2個皿，每皿接種1 mL，每接種一個稀釋度更換一支無菌吸管。將冷卻至（45±1）℃滅菌后的PCA-TTC培養基10～15 mL灌入培養皿內，混合均勻。待固化后置于（29±1）℃生化培養箱中培養相應的時間，培養期滿后按照計數方法進行計數，同時做空白對照。

2 結果與討論

2.1 TTC最適濃度的選擇

TTC是一種化學試劑，無色的TTC作為氫的受體，在細菌脫氫酶作用下，還原后成為紅色的三苯基甲月替，使菌落呈紅色[9]，培養基與菌落顏色反差明顯，能有效去除本底顆粒物、氣泡等干擾。因此常用于食品[10-11]、化妝品[12]、水[13]中等菌落顯色中。其不耐熱，一般與培養基使用時，都是用“過濾除菌”的方法來滅菌。TTC同時也具有抑菌性[14]，筆者利用其不耐熱的性質，采用高溫高壓滅菌，并結合TTC水溶液適宜濃度，達到既能降低TTC抑菌性能又能顯色的目的。

考察因素A PCA用量（L）、因素B TTC水溶液濃度（%）、因素C培養時間（d）三個主要因素，根據3因素3水平，設計不交互正交試驗[15]L9（34），結果見表1。

表1 正交試驗因素水平

按1.3實驗方法分別對表1中各因素水平進行測定，正交試驗顯色和計數結果見表2。其中試樣為一循+二循的混合水樣，每個稀釋度分別接種2個皿，培養基為經過（121±1）℃高壓滅菌后的PCA-TTC培養基。混合水樣于NA平皿計數法異養菌測定結果為9.6×103CFU/mL。

表2 正交試驗顯色和計數結果

正交試驗結果采用數據直觀分析[16]，并結合菌落生長顏色和PCA-TTC培養基經過高溫高壓滅菌后是否變色，尋找最佳因子組合，確定優方案，選擇TTC最適濃度。

從表2可以看出，各因素極差RA＞RC＞RB，所以各因素的從主到次的順序為A，C，B。不同濃度的TTC水溶液1 mL加入到PCA瓊脂中，制備的PCA-TTC培養基經高溫高壓滅菌后，有4種培養基變成紫紅或紅色，培養基變色不可取。首選不變色的培養基，在其余5種不變色的培養基中，再優選生長成紅色菌落所對應的培養基，易于識別。二次篩選后，只有A2B2C3和A3B3C2兩種方案菌落顏色為紅色。2種方案對應的培養基中的B/A值均為0.002%（相當于2%的TTC水溶液1 mL加入到1 000 mL培養基中或1%的TTC水溶液1 mL加入到500 mL培養基中）。A2B2C3和A3B3C2 2種方案的PCA-TTC顯色法，異養菌總數測定結果分別為1.3×104CFU/mL（3 d）和1.2×104CFU/mL（2 d），經t值檢驗，雖然都與傳統NA平皿計數法測定結果9.6×103CFU/mL（3 d）無顯著差異，但均高于NA平皿計數法測定結果，說明PCA-TTC顯色法能對受損細菌恢復并進行有效促進，便于菌落生長、識別和計數。

考慮到不同因素對異養菌含量的影響程度，通過綜合平衡法確定優方案，具體平衡過程如下。

因素A和B：對異養菌含量來說，B/A值（TTC顯色劑在培養基中的濃度）不可過小也不可過大。結合顏色，本著提高工效原則，所以取B2/A2或B3/A3為最佳水平。

因素C：對異養菌含量來說，培養時間（d）水平越大越好。所以取C3為最佳水平。

綜合上述分析，確定優方案為A2B2C3或A3B3C3，且B2/A2=B3/A3=0.002%，其中A2B2C3方案正好是正交表中的第5號試驗，其是已作過的9個試驗中異養菌菌落長成紅顏色、異養菌含量最多的試驗方案，因此也是最優方案，即TTC在培養基中的最適濃度為0.002%（質量分數），培養時間為3 d。

2.2 精密度試驗

分別取不同時段的一循和二循循環水水樣，按照PCA-TTC顯色法進行試驗，每個樣品/稀釋度，使用2個平行皿，同時做空白對照，根據計數方法進行報告，報告結果見表3。

表3 精密度試驗結果

由表3可知，用PCA-TTC顯色法檢測循環水樣品中異養菌，每個樣品/稀釋度下的平行皿菌落數，置信度達到95%時，經t值檢驗，測定結果彼此間均無顯著差異，滿足原標準分析質控要求。

其中例次1和2，按照HG/T 4207—2011《工業循環冷卻水異養菌菌數測定平皿計數法》中的選擇平均菌落數在30～300之間的稀釋度，立即進行計數，求得平均菌落數，并修約成兩位有效數字，報告結果分別為一循1.3×105CFU/mL和二循8.9×104CFU/mL。例次3和4，按照HG/T 4207—2011《工業循環冷卻水異養菌菌數測定平皿計數法》計數方法中的若有2個稀釋度，其生長菌落數均在30～300之間，則視二者之比值來決定，若其比值小于2，應報告其平均數；若大于2則報告其中較小的數字。例次3和4均屬于比值大于2則報告其中較小的數字情況，因此報告結果分別為一循2.7×103CFU/mL和二循2.6×105CFU/mL。

2.3 對比和驗證試驗

在TTC最適濃度（0.002%）下，將一循和二循水樣各30份，分別用PCA-TTC顯色法與NA平皿計數法培養3 d，每個稀釋度分別接種2個平行皿，測定異養菌含量，根據計數方法進行報告，并按照監控指標（小于等于1×105CFU/mL）進行判定是否合格。一循2種方法測定結果見表4，二循2種方法測定結果見表5，歸納總結表4和表5數據，2種測定方法的結果比較見表6。

從表4、表5和表6可知，一循PCA-TTC顯色法合格異養菌數份數28例，取得93.33%的合格率；NA平皿計數法合格異養菌數份數29例，取得96.67%的合格率。二循PCA-TTC顯色法合格異養菌數份數27例，取得90.00%的合格率；NA平皿計數法合格異養菌數份數29例，取得96.67%的合格率。2種檢測方法測定異養菌，經卡方檢驗[17]，P＞0.05，2種方法雖均無顯著差異，但PCA-TTC顯色法檢出率高于NA平皿計數法，說明PCA-TTC顯色法更適合循環水異養菌生長，準確度更高，可以替代NA平皿計數法測定異養菌。

表4 一循2種方法測定結果

表5 二循2種方法測定結果

表6 2種測定方法的結果比較

2.4 培養時間對異養菌結果的影響

異養菌的培養時間規定為72 h，由于PCA瓊脂具有修復和促進細菌生長作用，因此可以縮短培養時間。用PCA-TTC顯色法分別測定一循[8.0×103CFU/mL（72 h）]和二循[2.2×104CFU/mL（72 h）]水樣中異養菌含量。培養48 h后，每隔3 h/次計數，觀察異養菌的增長情況，結果如圖1所示。

從圖1可以看出，在培養66 h的時候一循和二循都達到了平臺期，而72 h時異養菌總數已經很穩定，所以選擇66 h作為培養時間就可以得到比較準確的結果。

圖1 培養時間對異養菌測定結果的影響

3 結論

（1）建立PCA-TTC顯色法測定異養菌，不僅對受損細菌恢復并進行有效促進，還能加快計數速度，并縮短培養時間，由原來的72 h縮短至66 h，省時省力，提高工效。

（2）與標準NA平皿計數法對比，2種方法雖無顯著差異，但PCA-TTC顯色法檢出率高，數據準確性和可靠性有效提升，可以替代標準平皿計數法測定異養菌。滿足工業循環冷卻水水質檢測、水質控制和殺菌劑評定性能等方面的實際工作需求，可適用于工業循環冷卻水、原水、生活用水及其他水中異養菌菌數的測定。

（3）在普遍認為TTC不適合高溫高壓滅菌的前提下，筆者通過控制TTC溶液濃度（0.002%），配合高溫高壓滅菌，降低了TTC滅菌操作難度和抑菌性，取得了良好的技術效果，具有一定的應用前景。