敲低miR-34c-5p抑制低氧誘導的大鼠骨髓間充質干細胞的凋亡

董 揚，張 芬，李幸幸，吳 杰，徐忠誠

(金華市人民醫院 心內二科， 浙江 金華 321099)

間充質干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)具有臨床獲取容易、增殖迅速和基因修飾簡便等優點，是組織工程的理想種子細胞。因此，MSCs移植在臨床治療方面具有廣闊的應用前景[1]。但是，MSCs移植后，其存活率較低，已成為當前臨床應用的最大障礙。有研究表明，移植環境中局部組織低氧環境是造成MSCs生存率低的主要原因之一[2]。

微RNA(microRNA，miRNA)是一類非編碼短鏈RNA，可與靶基因 mRNA的3′非翻譯區(3′-UTR)互補結合，抑制其翻譯，調控細胞增殖、分化、遷移和凋亡[3]。研究顯示miR-34c過表達可導致細胞凋亡和細胞周期停滯[4]。miR-34c-5p作為miR-34c家族的重要一員，對細胞的凋亡也具有重要的調控作用[5]。但鮮有關于miR-34c-5p在低氧條件下對細胞凋亡作用的研究。

本文通過構建miR-34c-5p敲低的大鼠骨髓MSCs(bone marrow derived MSCs, BM-MSCs)系，建立低氧誘導模型，探究敲低miR-34c-5p對低氧誘導的BM-MSCs凋亡的作用。為進一步的實驗研究提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料

6周齡雄性清潔級SD大鼠30只，體質量180～220 g(武漢大學中國典型培養物保藏中心，動物許可證：20170005024712)，實驗過程中對動物的處置符合動物倫理學標準。DMEM培養基、胎牛血清、ELISA kit、TRIzol reagent、RT-qPCR kit、DAPI和LipofectamineTM2000(Invitrogen公司)；Caspase-3和caspase-9抗體、Bcl-2和Bax兔單抗抗體、HRP標記羊抗兔IgG二抗、RIPA裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒、極超敏ECL化學發光試劑盒、TUNEL凋亡檢測試劑盒(上海碧云天生物技術有限公司)；ADP/ATP rate分析試劑盒(Abnova公司)；熒光標記的2-脫氧葡萄糖類似物：2-deoxy-2-[(7-nitro-2,1,3-benzoxadiazol-4-yl) amino]-D-glucose，2-NBDG(Amgicam公司)。

1.2 方法

1.2.1 MSCs的分離、培養及轉染:按以往建立的方法分離和培養大鼠BM-MSCs[6]，分離后進行傳代培養，取第3代以后的BM-MSCs 進行相關實驗。

敲低miR-34c-5p轉染BM-MSCs按照已建立的方法進行[7]。

1.2.2 細胞的處理及分組:BM-MSCs低氧誘導模型參照已有方法進行構建[8]。建模后，將MSCs分為常氧組(normoxia組)、低氧組(hypoxia組)、常氧抑制劑陰性對照組(normoxia inhibitor NC組)、低氧抑制劑陰性對照組(hypoxia inhibitor NC組)、常氧miR抑制劑組(normoxia miR inhibitor組)和低氧miR抑制劑組(hypoxia inhibitor miR組)。

1.2.3 RT-qPCR檢測miR-34c-5p mRNA相對表達:Trizol試劑裂解細胞提取總RNA，然后反轉錄為cDNA，稀釋10倍后按20 μL反應體系擴增。反應條件: 95 ℃預變性25 s；95 ℃變性10 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸40 s，40個循環；72 ℃再延伸10 min。以GAPDH為內參，用2-△△Ct計算目的基因相對表達量。

1.2.4 流式細胞測量術檢測細胞凋亡率:對數期細胞接種于6孔板上，培養48 h后，根據annexin V-APC/7-AAD試劑盒說明書，采用FACS Calibur流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.2.5 TUNEL法檢測細胞凋亡:4%多聚甲醛固定細胞45 min，PBS洗滌3次，加入TUNEL檢測液，37℃避光孵育1 h。PBS洗滌細胞3次，滴加DAPI避光孵育5 min。PBS洗滌細胞5 min，共3次。最后在熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。

1.2.6 Western blot檢測調亡相關蛋白質:RIPA裂解液提取細胞總蛋白質，BCA蛋白質檢測試劑盒測定總蛋白含量。蛋白質樣品進行SDS/PAGE。然后將樣品轉移到PVDF膜上。加入5%脫脂奶粉封閉緩沖液孵育1 h。添加兔抗cleaved caspase-3(1∶1 000稀釋)、cleaved caspase-9(1∶1 000稀釋)、Bcl-2(1∶1 000稀釋)、Bax(1∶1 000稀釋)和 β-actin(1∶500稀釋)單克隆抗體(一抗)，4 ℃孵育過夜。加入HRP標記的二抗(1∶1 500稀釋)室溫下孵育1.5 h。顯影，對蛋白質表達水平進行分析。β-actin作為內參。

1.2.7 RT-qPCR檢測IGF、HGF、bFGF和VEGF mRNA相對表達:培養細胞48 h，Trizol試劑裂解細胞提取總RNA，反轉錄為cDNA，稀釋10倍后按20 μL反應體系擴增。反應條件: 95 ℃預變性5 min；95 ℃變性1 min，58.5 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，30個循環; 72 ℃再延伸10 min。以GAPDH為內參，用2-△△Ct計算目的基因相對表達量。

1.2.8 ELISA檢測IGF、HGF、bFGF、VEGF的分泌量:培養細胞48 h，根據相應的ELISA試劑盒操作說明書檢測IGF、HGF、bFGF和VEGF的分泌量。

1.2.9 生化試劑盒檢測ATP/ADP:根據ADP/ATP ratio分析試劑盒操作說明書，分別測量ADP和ATP發光值，計算ATP/ADP的比值。

1.2.10 流式細胞測量術檢測細胞攝取葡萄糖能力：細胞與100 μmol/L 2-NBDG混合[9]，37 ℃培孵育30 min。克雷布斯林格緩沖液(Krebs Ringer buffer，KRB)洗3次，0.25% 胰蛋白酶消化，收集每組細胞，使用流式細胞儀檢測細胞內平均熒光強度，并記錄實驗數據。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 miR-34c-5p在低氧誘導后MSCs內的表達情況

Hypoxia 組中miR-34c-5p表達水平為2.241±0.238，明顯高于Normoxia組的1.000±0.519。

2.2 敲低miR-34c-5p對細胞凋亡的影響

Hypoxia inhibitor NC組細胞凋亡率顯著高于normoxia inhibitor NC或normoxia miR inhibitor組(P<0.01)。與hypoxia inhibitor NC組相比，miR inhibitor可明顯降低細胞凋亡率(P<0.01)(圖1A)。TUNEL結果和流式細胞結果一致，紅色熒光代表凋亡細胞，藍色熒光代表活細胞(圖1B)。Hypoxia inhibitor NC組cleaved caspase-3,-9和Bax蛋白表達量明顯高于normoxia inhibitor/miR NC組。Hypoxia miR inhibitor組的cleaved caspase-3,-9和Bax的蛋白表達量明顯低于hypoxia inhibitor NC組(P<0.01)。而Bcl-2蛋白表達量的變化與此相反，差異顯著(P<0.01)(圖1C)。

A.apoptosis was detected by flow cytometry; B.cell apoptosis was detected by TUNEL(×200); C.expression levels of cleaved-caspase-3,9, Bcl-2 and Bax by Western blot; *P<0.01 compared with normoxia inhibitor NC/miR inhibitor group; #P<0.01 compared with hypoxia inhibitor NC group

2.3 敲低miR-34c-5p對低氧誘導后MSCs 內IGF、HGF、bFGF和VEGF表達的影響

Hypoxia inhibitor NC組IGF、HGF、bFGF和VEGF表達水平明顯低于normoxia inhibitor NC或normoxia miR inhibitor(P<0.01)。與hypoxia inhibitor NC組比較，miR inhibitor可顯著提高IGF、HGF、bFGF和VEGF表達水平(P<0.05，P<0.01)(圖2A，B)。

A.relative expression of VEGF, bFGF, HGF and IGF by RT-qPCR; B.expression of VEGF, bFGF, HGF and IGF by ELISA; *P<0.01 compared with normoxia inhibitor NC/miR inhibitor group; #P<0.05, ##P<0.01 compared with hypoxia inhibitor NC group

2.4 敲低miR-34c-5p對低氧誘導后MSCs能量代謝的影響

Hypoxia inhibitor NC組ATP/ADP比率和葡萄糖的攝取率均明顯低于normoxia inhibitor NC或normoxia miR inhibitor組(P<0.01)。與hypoxia inhibitor NC組比較，miR inhibitor可顯著提高ATP/ADP比率和葡萄糖的攝取率(P<0.05，P<0.01)(圖3A，B)。

A.effect of miR-34c-5p knockdown on ATP/ADP; B.extraction of glucose by flow cytometry; *P<0.01 compared with normoxia inhibitor NC/miR inhibitor group; #P<0.05, ##P<0.01 compared with hypoxia inhibitor NC group

3 討論

MSCs移植到體內，所處生存環境因損傷導致氧濃度變低，這種低氧環境極大的影響 MSCs存活率，這也是決定移植治療效果的重要因素[10]。因此，通過改變移植細胞自身抗凋亡能力以提高存活率成為了重點研究方向。miR-34c-5p作為miR-34c家族的重要一員，對細胞的凋亡具有重要的調控作用。但鮮有關于miR-34c-5p在細胞凋亡中作用的研究。本研究發現miR-34c-5p可促進低氧誘導后BM-MSCs凋亡。

細胞凋亡是受基因嚴格控制的細胞程序性死亡表現，受多種信號通路和基因調控。Caspase信號級聯通路是細胞凋亡的主要介導途徑，其中caspase-3,-9是促凋亡調節基因，激活后可誘導多種細胞凋亡[11]。Bcl-2基因家族與細胞凋亡密切相關，根據功能和結構分為兩類，一類是起抗凋亡作用的基因，如Bcl-2。另一類是具有促凋亡作用的基因，如Bax。本研究證實敲低miR-34c-5p可明顯降低低氧誘導后BM-MSCs的凋亡率，顯著下調cleaved caspase-3,-9和Bax蛋白的表達，同時明顯上調Bcl-2的表達。此結果與相關研究結果類似[12]。

有研究表明，通過基因修飾而促進 MSCs在低氧環境下存活的機制，主要是通過Akt通路和VEGF等達到。而Akt通路的激活與IGF、HGF、bFGF和VEGF密切相關[13]。本研究結果表明，敲低miR-34c-5p可顯著上調低氧誘導后BM-MSCs內IGF、HGF、bFGF和VEGF分泌量，說明敲低miR-34c-5p可能通過提高IGF、HGF、bFGF和VEGF表達量激活Akt通路，進而增強MSCs在低氧環境下的存活能力。

葡萄糖攝取充足時，MSCs可通過糖酵解途徑維持其在低氧環境中的存活[14]，因此，MSCs可存活較長時間。本研究證實敲低miR-34c-5p可顯著提高ATP/ADP比率和葡萄糖攝取率。miR-34c-5p敲低可以提高低氧誘導后BM-MSCs中能量代謝水平，進而提高存活率。

本研究只是在體外初步探索了miR-34c-5p在低氧誘導的BM-MSCs凋亡中的調控作用，其在體內是否具有相應的作用還需進一步深入探究。希冀為早日實現臨床上高效移植MSCs提供新的線索及研究思路。