銀翹散UPLC指紋圖譜研究*

劉滿超，劉玉梅，張家俊，胡美忠，郁建生

(1.銅仁職業技術學院國家民委中獸藥重點開放實驗室，貴州 銅仁 554300；2.貴州健康職業學院健康管理系，貴州 銅仁 554300)

銀翹散出自清代名醫吳塘的《溫病條辨》，主要功效為辛涼透表、清熱解毒，主要用于外感風寒、發熱頭痛、口干咳嗽、咽喉疼痛、小便短赤等病癥[1]?；诰G色養殖的理念，加上養殖界的禁抗運動，近年來有不少動物養殖機構將銀翹散用于預防和治療養殖動物的高熱[2]、禽流感[3-4]、大腸桿菌感染[5-6]、保胎[7]等，且效果良好。其配方中有金銀花、連翹、桔梗、薄荷、淡豆豉、淡竹葉、牛蒡子、荊芥、蘆根和甘草共10味中藥材[1]?！吨腥A人民共和國藥典》中銀翹散的含量測定項下只對牛蒡苷的含量進行了規定，但銀翹散中有10味中草藥，且每種藥材中的化學成分都非常復雜，這就使得對銀翹散的質量控制(如果只測定牛蒡苷)是不夠的。中藥指紋圖譜技術基于其能從整體上把控中藥的質量，該技術在中藥質量控制中的地位日漸上升[8-9]。本研究主要應用UPLC技術對不同廠家的27批次銀翹散進行指紋圖譜分析，建立了該條件下銀翹散的標準指紋圖譜，并對所得譜圖數據進行相似度分析，主成分分析和聚類分析，為更為合理的評價銀翹散的質量提供了一定的實驗支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

Agilent 1290 UPLC 分析儀 ( 檢測器為 DAD，配置自動進樣器，Agilent LC 色譜工作站)，流動相所用乙腈為色譜純，產自德國默克公司；超純水；其余試劑均為分析純。27批次銀翹散均采購自自由市場，編號從S1到S9，產自廠家1；編號S10-S18產自廠家2；編號S19-S27產自廠家3。

1.2 UPLC采集條件

Agilent ZORBAX SB-C18(3.0 mm×100 mm，1.8 μm) 色譜柱，檢測波長 230 nm，柱溫 30 ℃，進樣量為 1 μL，以0.02% 磷酸水(A)-乙腈(B)，梯度洗脫(0～3 min，80% A; 3～3.1 min，80%～70% A; 3.1～6 min，70% A; 6～6.1 min，70%～60% A; 6.1～9 min，60% A；9～9.1 min，60%～50% A; 9.1～12 min，50% A; 12～12.1 min，50%～40% A; 12.1～15 min，40% A；15～15.1 min，40%～30% A; 15.1～18 min，30% A；18～18.1 min，30%～20% A; 18.1～21 min，20% A；21～21.1 min，20%～10% A; 21.1～24 min，10% A。流速 0. 3 mL/min)。

1.3 供試品溶液的制備

取銀翹散 5 g，研缽研細，過100目篩，精密稱取 0.2000 g，置 10 mL 離心管中。精密加入50% 甲醇水 10.00 mL，稱定質量。超聲提取 30 min (功率 300 W，溫度 50 ℃)，再稱定質量。用50% 甲醇水補足失重，搖勻，靜置 10 min，微孔濾膜(0. 22 μm)過濾至UPLC進樣瓶中，置 4 ℃ 冰箱中待測定。

1.4 UPLC譜圖采集

按照“1.3”項下方法制備所有的供試品溶液，按照“1.2”項下所列方法，對所有樣品進行UPLC色譜圖采集。

2 結果與討論

2.1 方法學考察

2.1.1 精密度試驗

取同一批次銀翹散1份，按照“1.3”項下所描述的方法制備供試品試液，然后按照“1.2”項下描述的方法進行UPLC色譜圖采集，連續進樣6次?？疾熘笜藶楣灿蟹宓谋Ａ魰r間、相對峰面積和各譜圖之間的相似度。經計算，結果顯示，各共有峰的相對保留時間RSD值小于1.2%；各共有峰的相對峰面積值的RSD值小于1.3%。應用中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統2012，以第一次進樣所得UPLC指紋圖譜為參照譜計算6次進樣所得UPLC譜圖的相似度，結果顯示相似度均大于0.99，符合指紋圖譜分析的要求。表明該儀器及方法的精密度良好。

2.1.2 重復性試驗

取同一批次銀翹散6份，按照“1.3”項下所描述的方法制備供試品試液，然后按照“1.2”項下描述的方法進行UPLC色譜圖采集。考察指標為共有峰的保留時間、相對峰面積和各譜圖之間的相似度。經計算，結果顯示，各共有峰的相對保留時間RSD值小于1.4%；各共有峰的相對峰面積值的RSD值小于1.5%。應用中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統2012，以第一次進樣所得UPLC指紋圖譜為參照譜計算6份銀翹散樣品的UPLC譜圖的相似度，結果顯示，相似度均大于0.99，符合指紋圖譜分析的要求，表明該儀器及方法的重復性良好。

2.1.3 穩定性試驗

取同一批次銀翹散1份，按照“1.3”項下所描述的方法制備供試品試液，然后按照“1.2”項下描述的方法于供試品溶液制備好的時間開始 0 h， 5 h， 10 h， 15 h， 20 h， 25 h 進行6次UPLC色譜圖采集?？疾熘笜藶楣灿蟹宓谋Ａ魰r間、相對峰面積和各譜圖之間的相似度。經計算，結果顯示，各共有峰的相對保留時間RSD值小于1.2%；各共有峰的相對峰面積值的RSD值小于1.3%。應用中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統2012，以第一次進樣所得UPLC指紋圖譜為參照譜計算6次進樣所得UPLC譜圖的相似度，結果顯示，相似度均大于0.99，符合指紋圖譜分析的要求。表明供試品溶液在 25 h 內其化學成分是穩定的。

2.2 銀翹散指紋圖譜的建立及相似度分析

分別取27批次銀翹散按照“1.3”項下描述的方法制備供試品試液，按照“1.2”項下描述的的方法進行UPLC指紋圖譜采集。將所得27個UPLC指紋圖譜數據以AIA文件的格式導出，再將所導出的AIA文件導入到中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統2012。以1號樣品所得UPLC色譜圖為參照譜，先對所有UPLC色譜圖進行多點校正，再進行自動匹配，然后生成對照指紋圖譜，對照指紋圖譜為圖1中的R，最后進行相似度計算。如圖2所示，27批次銀翹散在該條件下UPLC指紋圖譜有20個共有峰。各批次銀翹散樣品UPLC指紋圖譜與對照指紋圖譜比較，相似度在0.906～0.996之間。

2.3 共有峰峰面積主成分分析

應用中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統對UPLC指紋圖譜進行相似度計算時，其著重點在于計算各譜圖間的相似程度。該算法中共有峰的峰面積越大，其權重也越大，那么計算出來的相似度結果很大程度上是由那些含量高的成分決定的。但是，不同廠家不同批次之間樣品質量間存在的差異大多數時候是由一些含量不高的成分的不同而產生的，而這些細微的差別相似度評價系統就不能對其進行很好的評估。而主成分分析則可以對各樣品間存在的細微差別進行有效的評估。本研究應用27批次銀翹散UPLC指紋圖譜的20個共有峰的相對峰面積數據為評價參數，應用SPSS 23 軟件進行主成分分析。結果顯示，累積載荷平方和取前3個主成分的話，其值為83.46%，能夠很好的反應銀翹散20個共有峰數據的基本信息。于是，取前三個主成分做因子得分圖和因子載荷圖。27批次銀翹散所得數據的因子得分圖(圖3A)顯示，3個不同廠家的銀翹散能明顯區分開來，說明不同廠家銀翹散可能因為原材料的產地不同，其品質是存在差異的。因子載荷圖(圖3B)解釋了產生銀翹散品質差異的原因，20個共有峰對此都有一定的貢獻。其中，貢較大的有離原點較遠的共有峰4、共有峰10、共有峰11等，貢獻較小的是離原點最近的共有峰7、共有峰5等。該結果顯示，引起銀翹散品質差異的原因主要是不同廠家產品中各共有峰代表的化合物在產品中含量的差異，該差異最可能的產生原因是不同廠家原材料生產地的不同。

2.4 共有峰峰面積聚類分析

為印證主成分分析結果的可靠性，將27批次銀翹散指紋圖譜的20個共有峰峰面積數據導入到SPSS 23 軟件中，進行系統聚類分析。分析結果顯示，與主成分分析結果相呼應，三個不同廠家的產品是能夠明顯區分開來的。除此之外，聚類分析還可以得到更加詳細的組間及組內信息。從圖4看出，廠家3和廠家1產品之間的相似度更高一些，而廠家2的產品與以上兩家產品之間的差異要大一些。還能看出同一廠家不同批次產品之間存在的細微差異，如廠家3的產品23號與24號之間幾乎沒有差異，而它們與19號、20號、22號產品之間就有一定的差異。

3 結論

本研究考察了5種不同型號的色譜柱的分離效果，發現Agilent ZORBAX SB-C18(3.0 mm×100 mm，1.8 μm) 色譜柱的分離效能最好，能將樣品中的特征峰都洗脫出來且分離度良好，于是后續試驗都是用該色譜柱進行指紋圖譜采集的。

在流動相的選擇時，本研究考察了不同的流動相系統，最后采用了分離效能最好的0.02% 磷酸水(A)-乙腈(B)系統，進行梯度洗脫。該系統能將樣品中所有特征峰在 24 min 內全部洗脫出來，且基本能達到有效分離。

因銀翹散是由10味中草藥組成的中成藥，其中化學成分的復雜是不言而喻的，為了讓UPLC指紋圖譜能最大程度的反映出銀翹散中的各種化學成分，本研究應用DAD檢測器先對樣品進行全掃描，對比各峰在不同波長下的吸收強度，經綜合比較得出在 230 nm 處，各峰都能顯示出來且能達到有效分離效果，所以最終確定UPLC指紋圖譜的采集波長為 230 nm。

在對最終采集的UPLC圖譜進行分析的時候，本研究采用了三種方法。方法一為傳統的相似度法，應用中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統對所得譜圖進行多點校正、自動匹配后再進行相似度計算。結果顯示，產自3個廠家的27批次銀翹散相似度在0.906～0.996之間，相似度良好。該方法對于確定一個未知樣品到底是不是某一類物質有很好的辨識度，但是對于同一類物質之間存在的細微差異卻是無能為力的。而主成分分析結果顯示，來自不同廠家的樣品可以完全區分開來，該方法能夠將同類物質間存在的細微差異顯示出來，且還能根據載荷圖找到引起這些差異的原因，聚類分析的結果進一步驗證了主成分分析的結果。如此，在對中藥材進行質量評估的實際工作中，可以將三種分析方法結合起來，相似度法可以簡單有效的確定某一樣品到底是不是目標物，主成分分析法和聚類分析法可以用來辨別同類物質之間是否存在系統性差異。這樣就能在實際工作中有效的辨別中藥材的類別和品質。