洗滌血小板制備及相關質量功能指標的研究

李曉華 李建民 鮑雪臨 楊寧 郭敏 李玉秋 馬媛媛 孫瑞玲 白蘭蘭

264003 煙臺市中心血站1，山東煙臺

050071 河北省血液中心2，河北石家莊

264003 煙臺山醫院3，山東煙臺

隨著血站行業新標準中“少血漿血小板、洗滌血小板等” 的確定以及貫徹實施，給血站行業提出了新的要求與挑戰。因此，洗滌血小板制備及臨床應用得到重視，本文在借鑒國內外洗滌血小板制備等經驗的基礎上加以改進，旨在摸索出以1個治療量去白細胞混合濃縮血小板和1個治療量去白細胞單采血小板為起始血液，用于制備洗滌血小板的工藝流程，現將兩種起始血小板制備的66 例洗滌血小板的相關情況報告如下。

資料與方法

起始血小板來源：400 mL 全血白膜法制備的濃縮血小板，并以滿足1個治療量要求合并制備的去白細胞混合濃縮血小板36 例；單采去白細胞血小板30例；血小板外觀檢查色澤正常，無紅染現象。

設備及試劑：KUBOTA-9942 離心機(生產廠家：日本久保田公司)，TSCD-Ⅱ無菌接駁機(生產廠家：日本泰爾茂公司)，MCS+血細胞單采機(生產廠家：美國血液技術公司)，ABL800FLEX 血氣分析儀(生產廠家：雷度米特醫療設備有限公司)，ABL800 血氣沖洗液、ABL800 定標液、XS-500i 全自動血液分析儀(生產廠家：煙臺恒泰生物科技有限公司)，XS-500i試劑包、Photometer 4040 半自動生化分析儀(生產廠家：北京瑞爾達生物科技有限公司)，總蛋白測定試劑盒、分漿夾板(生產廠家：蘇州醫療器械廠)，生理鹽水(生產廠家：石家莊四藥集團)。

洗滌血小板制備方法：將兩類起始血小板通過無菌連接含2個空轉移袋和1個含400 mL 生理鹽水的三聯袋為一體，整體平衡后以3 000 G，10 min，20～24℃，剎車為9 的離心條件置離心機進行離心(離心機的剎車設置固化程序中有0～9 檔次選擇，數字越大剎車時間越快，反之越慢)。離心完畢，取出起始血小板置分漿夾板，除袋底沉淀物外，將血漿全部轉移至一空轉移袋中，將100 mL 生理鹽水緩慢加入沉淀袋中，靜態沖洗1～2 次，清除袋中殘存血漿，然后再將上清液轉移至另一空轉移袋中，注意避免沉淀物的流失。將余下的200 mL 生理鹽水加入有沉淀物的袋中，分別做熱合處理，視起始血小板的不同，含血漿的袋子可作為普通冰凍血漿(單采者，混合者因無標準可依，按報廢處理)，含沉淀物的袋子即為制備的洗滌血小板。洗滌血小板置室溫下自然解聚1 h，然后置20～24℃振蕩箱中充分振蕩解聚1～2 h。簡易制備流程如圖1 所示。洗滌前后的血小板分別留樣進行檢測。

圖1 洗滌血小板簡易制備流程圖

血細胞計數方法：按全自動血液分析儀的要求完成紅細胞、白細胞及血小板計數。血漿蛋白含量檢測方法：按半自動生化分析儀要求完成血漿蛋白含量的測定。pH 及氧分壓檢測：按血氣分析儀要求完成氧分壓、二氧化碳(CO2)分壓及pH 值測定。血小板聚集試驗檢測方法：采用經典比濁法(11.2 μmol/LADP 誘導)測定血小板最大聚集率。血小板黏附試驗檢測方法：采用經典玻球法測定血小板黏附率。

統計學方法：數據均用SPSS 17.0 統計學軟件予以處理；計量資料以(±s)表示，比較采用t檢驗；P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

兩種起始血液制備的洗滌血小板的質量指標檢測情況：去白細胞單采血小板洗滌后血小板容量、血小板計數、白細胞殘留量、紅細胞混入量、血漿蛋白含量低于洗滌前，差異有統計學意義(P＜0.05)；去白細胞混合濃縮血小板洗滌后血小板容量、血小板計數、白細胞殘留量、紅細胞混入量、血漿蛋白含量低于洗滌前，差異有統計學意義(P＜0.05)。

兩種起始血液制備的洗滌血小板功能指標檢測情況：去白細胞單采血小板洗滌后血小板聚集試驗、血小板黏附試驗、血小板CO2分壓低于洗滌前，差異有統計學意義(P＜0.05)；去白細胞混合濃縮血小板洗滌后血小板聚集試驗、血小板黏附試驗、血小板CO2分壓低于洗滌前，差異有統計學意義(P＜0.05)。

討 論

有關研究顯示，血漿懸浮液血小板存在種種問題，包括對血漿過敏，IgA 缺乏等患者失去血小板治療的機會，血漿中的大量補體、凝血酶、纖溶酶等物質影響血小板輸注療效，血漿中許多生物反應物質導致輸血不良反應，血漿同種異體蛋白抗原導致同種免疫等問題；血小板儲存期間釋放的生長因子可能影響腫瘤患者的治療，洗滌去除血漿中的生長因子對腫瘤患者的治療很有必要；輸注去白細胞血小板仍存在非溶血性發熱的患者，采用生理鹽水洗滌的血小板后，不良反應發生率從20%降到0.6%，據此認為儲存的濃縮血小板懸浮液血漿中存在著引起非溶血性發熱反應的物質，應該采用洗滌的方法去除；僅濾除濃縮血小板中的白細胞并不能完全避免輸血發熱反應；在血小板貯存期間，白細胞抗體、血小板抗體、細胞因子、補體成分、脂質成分等均可引起非溶血性發熱反應[1-3]。血小板儲存期間釋放的生長因子可能影響腫瘤患者的治療等，同時也指出了離心制備時的剪切力對血小板影響較大，會出現血小板數量減少、回收率下降、解聚困難、體外被激活、聚集力下降等情況；以及采用輕離心先行去除血小板中沉淀的紅細胞再行洗滌，避免殘存紅細胞影響洗滌血小板質量等問題[4]。

表1 兩種起始血液制備的洗滌血小板的質量指標檢測情況

表2 兩種起始血液制備的洗滌血小板功能指標檢測情況

為提高洗滌效果和洗滌血小板的質量，本研究采取的方式：①對起始血小板進行外觀檢查，無紅染者用于制備洗滌血小板，旨在規避紅細胞混入量過高影響洗滌血小板質量，減少不必要的離心去紅細胞操作過程；②采用一次離心去除全部血漿加2次靜態沉淀物直接清洗法進行制備，旨在降低離心剪切力對血小板功能的影響，達到充分洗滌、簡化流程、縮短制備時間以及后期及時應用等目的；③在選擇起始血小板時有意識地選擇血小板含量高者用于制備洗滌血小板，旨在規避洗滌過程受激活、上清液流失等因素導致的血小板含量降低，以滿足臨床治療量的需求；④根據血站行業各自條件的不同，建立適合自身的洗滌血小板制備、質量保證等相關制度流程，基于滿足臨床治療量和混合濃縮血小板制備特點而實施[5]。從試驗結果來看，兩種起始血小板制備的洗滌血小板，在容量、血小板計數、白細胞殘留量、紅細胞混入量、上清蛋白質含量、pH 值質量指標上均符合國家相關標準要求；在血小板聚集、血小板黏附、血小板氧分壓、血小板CO2分壓輔助指標的表現上，二者大體一致。

綜上所述，在現有標準、技術等框架下，血站行業制備的洗滌血小板質量可靠，可向臨床提供洗滌血小板，在適宜條件下可應用于臨床治療。