檢測燕麥干草主要營養成分含量的近紅外光譜分析模型

王 儲， 麻冬梅， 李 躍， 屈新月， 李智林， 胡倩楠， 喬葭月， 孫 彥*

(1. 中國農業大學草業科學與技術學院， 北京 100093； 2. 寧夏大學生態環境學院， 寧夏 銀川 750021)

燕麥(Avenasative)是一種優良的禾本科(Gramineae)飼草，具有較高的營養價值與飼用價值，可改善粗飼料的消化利用率，是家畜重要的飼料來源，對緩解家畜矛盾、提供均衡飼料、維持草地畜牧業可持續發展和生態建設均起到了至關重要的作用[1-3]。燕麥干草適口性好，具有可消化纖維含量高以及鉀和硝酸鹽含量低等特點，可提高家畜的生產性能外，還能降低在某些時期疾病的發病率，例如降低奶牛產后酮病的發生。燕麥干草的營養品質主要取決于粗蛋白(CP)、中性洗滌纖維(NDF)、酸性洗滌纖維(ADF)和粗脂肪(EE)含量，而且易受品種、產地、收獲時期、加工方式等因素的影響[4-7]。目前國內對牧草營養指標的測定普遍采用常規的化學測定方法，具有準確度和精確度高等優點，但存在周期長、成本高、局限性強和操作麻煩等缺點，不能實時監測，此外，檢測使用危險的化學藥品，對檢測員與環境也會造成一定的危害。

近紅外光譜分析是一種能夠快速估測樣品中一種或多種化學成分含量的新技術，其關鍵特征是對有機化學物質在其近紅外光譜區內光學特性的利用，并且具有定量分析，可連續進行樣品分析，為飼料品質快速鑒定、常規營養成分快速檢測和飼料產地溯源等提供了技術途徑[8-11]。近紅外光譜屬于分子振動光譜類型，其本質又是非諧振動的倍頻和組合頻。由于每個分子都會有許多吸收帶，并且吸收帶的強弱為近紅外分析樣品濃度，物理性質(如密度、粘度、粒度、硬度等)和化學成分(如蛋白質、氨基酸、脂肪、淀粉、水分等)提供了可能。理論上說，凡能產生近紅外光譜的物質，都可用近紅外光譜技術進行分析檢測。近年來，近紅外在紫花苜蓿(Medicagosativa)、黑麥草(Loliumspp.)、玉米秸稈中營養品質的測定得到廣泛的運用[12-14]，其中，納嶸等[15]通過采集94份苜蓿樣本結合最小二乘法，使用4種數學處理方法與5種散射校正方法對原始光譜進行處理建立苜蓿干草常規營養成分含量的近紅外模型，然而，在燕麥干草主要營養成分含量分析上國內鮮有人報道。近紅外技術本身屬于一種間接檢測技術，在實際運用中需要采集大量具有代表性的樣本，除此之外樣品來源、收獲時期和生產年限都會使建立的模型產生差異，因此研究應用NIRS快速、準確測定不同年限不同收獲時期以及不同品種的燕麥干草中粗蛋白(CP)、中性洗滌纖維(NDF)、酸性洗滌纖維含量(ADF)和粗脂肪(EE)含量的方法，對我國飼草行業的發展和提供優質牧草，起到了關鍵的作用。

1 材料和方法

1.1 樣品采集與處理

試驗樣品采自2020—2021年寧夏平羅-寧夏大學試驗地種植的燕麥種質資源，品種分別來自中國、美國、加拿大，于拔節、抽穗、開花、乳熟和完熟期進行齊地刈割收獲，每個小區隨機采集5株。在60℃下烘干至恒重，剪碎，混勻、用康源鑫KF-25(溫州)高速粉碎機進行粉碎，然后過1 mm的篩，得到249份燕麥全株干草樣品。試驗技術路線圖如圖1所示。

圖1 模型構建流程圖Fig.1 Model construction flow chart

1.2 數據處理與分析

采用定標軟件WinISI III和EXCEL 2019對數據進行處理與分析。

1.3 近紅外光譜數據的獲取和處理

本試驗采用FOSS公司生產的NIRSsystem500型近紅外光譜儀，工作條件為室溫26℃，掃描波長范圍1 100 ～2 492.8 nm，波長間隔2 nm，掃描次數32次計算平均光譜。

為了消除儀器和環境的干擾，提高信噪比，進行光譜預處理，采用無散射預處理(None)、標準化處理(SNV)、去趨勢化處理(Detrend)、SNV+ Detrend、標準化多元散射處理(SMSC)、加權多元散射處理(WMSC)、反向多元散射處理(IMSC)等處理方法；數學處理包含導數處理和平滑處理；回歸方法包括改進局部偏最小二乘法(MPLS)、偏最小二乘法(PLS)、主成分回歸(PCR)。

1.4 燕麥干草營養分含量(品質)的檢測

燕麥干草中粗蛋白質(CP)含量參照GB/T 6432—2018方法(KDY-9830凱氏定氮儀)測定；中性洗滌纖維(NDF)含量參照GB/T 20806—2006方法(ANKOM 2000i 全自動纖維分析儀)測定；酸性洗滌纖維(ADF)含量參照NY/T 1459—2007方法(ANKOM 2000i 全自動纖維分析儀)測定；粗脂肪(EE)含量參照GB/T 6433—2006方法(DFA-2型分布式脂肪測定儀)。每個樣品指標重復測定3次，取平均值作為最終化學分析測定值，所有營養成分含量均以干物質為基礎。

1.5 建立NIRS定量分析模型方法

近紅外分析的樣品包括定標集和驗證集，定標集樣品中盡可能包括那些最高、最低范圍內的樣品。將剔除異常值后的所有樣品為定標集，再做交叉驗證并用驗證記進行外部驗證，根據RSQ,RMSEC,RMSECV,RMSEP和RPD等指標確定最優模型。建立模型后對隨機選取35個樣品(驗證集)進行預測，并將預測值與真實值進行檢驗判定預測結果與真實值的差異來評價模型預測能力。

2 結果與分析

2.1 燕麥干草CP，NDF，ADF和EE的化學分析結果

圖2是249份燕麥干草樣品中CP，NDF，ADF和EE的化學分析結果。含量范圍分別是4.50%～12.30%，43.40%～57.10%，18.22%～44.50%，4.60%～15.30%。由圖2可見樣品中這4個指標的含量變化幅度大，符合正態分布，樣品來源廣泛，其變化范圍基本上覆蓋當前生產上不同生育時期推廣品種和品種選育中可能出現的CP，NDF，ADF和EE的含量，可用于建立燕麥干草主要營養成分的近紅外光譜校正模型。

圖2 燕麥草常規養分含量測定值Fig.2 Measued value of conventional nutrient contents of oat grass

2.2 燕麥干草的光譜圖分析

圖3是249個燕麥樣品的近紅外漫反射光譜圖曲線，從中可以看出近紅外區內燕麥干草的光譜反映很好，每個樣品的吸收波段很相似卻不會完全重合，這表明不同樣本之間的重現性良好，又存在差異。樣品之間的差異也有可能是因為不同樣品表面的粗糙程度不同、電噪聲和操作的影響，所以需要進一步對光譜進行預處理。儀器噪音即使用者操作失誤等均會產生奇異樣本，使整個分析數據的結果受到影響。本次試驗的聚類算法采用主成分分析(PCA)，并利用馬氏距離法(GH>3)和T檢驗(T>2.50)剔除異常值，發現并剔除6個異常樣本，最終得到243份燕麥干草樣品的光譜圖用來建立預測燕麥干草品質的近紅外模型。

圖3 燕麥干草原始光譜Fig.3 Oat hay raw spectrum

2.3 CP，NDF，ADF和EE近紅外校正模型的建立與優化

本試驗通過定標軟件WinISI III分別對CP，NDF，ADF和EE定標集的243個燕麥干草樣品進行最佳光譜處理和最優數學處理方法以及最適合的回歸方法的篩選。建立校正標準誤差和交叉驗證誤差最小，定標相關系數最大的校正模型。得到了CP，NDF，ADF和EE的最佳近紅外建模數據。采用MPLS分別對經過不同光譜和數學預處理后的光譜進行建模分析，并通過交叉驗證的方式進行預測，具有最低的SEC、SECV和最高的RSQ和1-VR模型為最優模型。

表1是CP與EE的定標相關系數和交叉驗證系數分別為0.97和0.92,0.91和0.83，校正標準誤和交叉驗證誤差分別為0.00和0.00,0.01和0.01，逼近化學分析的精確度。另外NDF與ADF的建模效果較CP和EE差，定標相關系數和交叉驗證系數分別為0.86和0.79,0.83和0.79，校正標準誤和交叉驗證誤差分別為0.02和0.02,0.01和0.01，接近化學分析的精確度。

表1 燕麥干草主要營養成分含量的最優定標模型Table 1 Optimization results for the calibration of CP,NDF,ADF and EE

2.4 CP，NDF，ADF和EE近紅外校正模型預測效果評價

為了進一步檢驗校正模型的優劣，本次試驗采用驗證集樣品對模型的預測效果進行評價，衡量參數選用RSQv外部驗證決定系數，RMSEP預測標準誤差，RPD預測相對標準誤差。根據Sinnaeve、Park和何云的報道，當RPD(SD/RMSESV)大于2.50時模型能用于近紅外預測[12,16-17]，大于3.00時模型具有較好的預測效果，小于2.00時，定標模型受到限制，不能用于預測。由表2看出CP,ADF,NDF,和EE的外部驗證決定系數和預測標準誤差分別為0.96和0.01,0.90和0.00,0.84和0.00,0.95和0.00。其中CP,NDF和EE的預測相對標準誤差均大于3說明具有很好的預測效果，ADF的預測相對標準誤差相對較小但是大于2.50，可以用于近紅外預測。除此之外，由散點圖4-7所示，比較化學值與預測值之間的差異，發現他們之間相關系數分別為0.96，0.90，0.84，0.95，均在0.83以上，表明預測值與真實值之間比較接近有很好的預測效果，可以應用此模型對未知的燕麥干草樣品中的CP,ADF,NDF和EE的含量進行實際預測。

表2 燕麥干草主要營養成分含量的最優定標模型的預測效果評估Table 2 Evaluation of prediction effect of optimal calibration model for main nutrient content of oat hay

圖4 CP測定值與預測值的相關性Fig.4 Correlation between measured and predicted value of CP

圖5 NDF測定值與預測值的相關性Fig.5 Correlation between measured and predicted value of NDF

圖6 ADF測定值與預測值的相關性Fig.6 Correlation between measured and predicted value of ADF

圖7 EE測定值與預測值的相關性Fig.7 Correlation between measured and predicted value of EE

3 討論

3.1 NIRS模型測定燕麥干草品質的可行性

本試驗中所采集的燕麥干草樣品分別來自不同地區、年限、生長期，并且樣品的常規養分含量變化幅度大，覆蓋面廣泛，時間跨度較長，有利于NIRS模型的構建與優化；樣品間的離散程度大符合正態分布，表明所選樣品分布廣泛，且具有良好的代表性。NIRS與化學分析方法聯用，包括光譜預處理、變量選擇、數學處理、多元校正和模型轉移，一定程度上能夠提高模型預測的準確性和可靠程度[18]。為了進一步優化模型，人們采用NIRS與多元線性回歸法(MLR)、主成分回歸法(PCR)、改進偏最小二乘回歸法(MPLS)和偏最小二乘回歸法(PLS)相結合使預測的結果更為可靠[19-20]。本試驗在建立燕麥干草品質鑒定近紅外預測模型中，對不同營養成分含量對應的光譜圖進行了不同預處理以及數學處理，在此基礎上再結合MPLS分析，將燕麥干草的光譜圖和對應的通過化學分析方法測定的燕麥干草營養指標進行關聯，通過交叉驗證評價模型預測效果，最終得到準確度較高的CP,NDF,ADF和EE含量的4個預測模型。目前關于近紅外在燕麥干草品質分析中應用的報道較少，關于燕麥干草中EE含量的預測，更是罕見或者預測結果不太理想[21-23]。本次試驗建立的模型具有以下特點：樣品來源分布廣，品種數目多，收集于不同生長時期和年限，分析結果更加全面,因此本試驗建立的模型效果表明NIRS技術可用于分析燕麥干草品質。

3.2 影響NIRS校正模型建立的因素

近紅外作為一種通過光譜間接檢測的技術，存在許多影響準確性的因素，其受到影響的因素可概括為以下幾點：(1)樣品的儲存環境；(2)收獲時期；(3)來原產地；(4)莖葉比；(5)樣品的狀態；(6)化學分析結果的準確性；(7)光譜的處理方法對測定結果的影響[24-28]。本研究中為了避免樣品的狀態、儲存環境影響，采用統一烘干，重復取樣，選取光譜平均值的方法，來消除影響。關于化學分析測定均參照國家標準，并進行多次重復測定來降低誤差。本試驗通過不同光譜處理、數學處理和回歸方法的組合挑選適宜的預處理方法來減少和消弱非目標因素對光譜的影響，此外本次試驗對燕麥微量元素的測定還沒有涉及，為進一步提高模型的準確性和適用性，應在今后的研究中進一步擴大樣品數量，增加測定指標，加強樣品的代表性以及獲取更多的準確數據來完善模型的應用。

4 結論

本試驗利用了NIRS分析技術建立了燕麥干草品質的近紅外預測模型。其中CP,NDF和EE含量預測模型的定標系數均(RSQ)和外部驗證決定系數(RSQv)均在0.83以上，校正標準誤(SEC)、交叉驗證誤差(SECV)和預測標準誤差(RESEP)均小于0.02，RPD均大于3，具有很好的預測效果，達到化學分析的精確度，ADF含量預測模型的定標系數均和外部驗證決定系數分別為0.83和0.84，校正標準誤(SEC)、交叉驗證誤差(SECV)和預測標準誤差(RESEP)均小于0.01，接近化學分析精度，預測相對標準誤差(RPD)相對較小但是大于2.50。所有模型均可用于實際檢測中且適應良好，其中CP，NDF，EE含量的定標模型效果更為精確和可靠。