薏苡葉斑病病原菌分離及其拮抗內生細菌的篩選

普鳳雅，何開瀟，葉建萍，和慶康，谷書杰，何永宏，楊志清，，3*

（1.云南農業大學 農學與生物技術學院，云南 昆明 650201；2.云南農業大學 云南省藥用植物生物學重點實驗室，云南 昆明 650201；3.云南農業大學 西南中藥材種質創新與利用國家地方聯合工程研究中心，云南 昆明 650201）

0 引言

薏苡（Coix lacryma-jobiL.）屬于禾本科（Gramineae）玉蜀黍族（Maydeae）薏苡屬（CoixL.）植物，為《中國藥典》2020年版收載品種。薏苡被認為是藥食兼備的珍貴良藥，其成分具有較高的營養價值和獨特的藥用價值，享有“禾谷類保健滋補之王”的美譽［1］。近年來，云南省薏苡的種植面積逐漸擴大，薏苡產業迅速崛起，成為農民增收致富的支柱型產業。但因為長期以傳統的方式栽培，粗放管理，薏苡的病蟲害日益加重［2］。在薏苡的整個生長發育期間，主要病害有黑穗病、葉斑病、葉枯病，其中薏苡葉斑病主要是在下部老葉先出現病斑，逐步向上部嫩葉蔓延，主要危害植株葉部，造成葉片黃枯，最終導致薏苡產量減少、品質下降［3］。目前，主要是利用化學藥劑對薏苡葉斑病進行防治［4］，但長期使用化學殺菌劑容易使病原菌產生抗性而導致防治效果降低，也會有大量農藥殘留，危害生態環境，威脅人類的健康，還會導致“3R”問題［5］。目前對農作物病蟲害的防治，人們提出了很多措施，其中通過篩選植物內生菌中的生防菌進行生物防治是當前研究的熱點［6］，例如：苑寶潔等［7］篩選出的解淀粉芽孢桿菌ZF57微粉劑對黃瓜棒孢葉斑病的田間防治效果高達97.12%；冶福春等［8］從燕麥生境中分離獲得的1株生防菌株Qh-618對燕麥葉斑病的防治效果達65%以上；甘金佳等［9］研究了用枯草芽孢桿菌防治番茄灰霉病、青枯病、早疫病、立枯病、枯萎病和根腐病；王建鵬等［10］通過平板對峙法篩選出3株芽孢桿菌C-01、C-02、C-05，它們對藜麥葉斑病的抑菌率分別為45.00%、49.33%、48.33%。

生物防治是有效又綠色環保的防治方法，能在有效提升農業病蟲害防治效果的基礎上推動我國綠色農業的可持續發展［11］。但在對薏苡葉斑病的防治研究中，有關生物防治的文獻仍少見。本研究對具有典型薏苡葉斑病病斑的師薏1號帶病植株進行分離鑒定，通過平板對峙法篩選出對薏苡葉斑病有生防效果的菌株，并對其進行了鑒定，旨在為進一步探索薏苡葉斑病病原菌的分類篩選、生物學特性及微生物防治提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗材料 試驗于2020年9月—2021年12月在云南省高校作物種質創新與可持續利用重點實驗室進行。供試感病植株取自云南曲靖市師宗縣（師薏1號）。供試薏苡內生細菌由本課題組從薏苡（文薏2號）的根、莖、葉中分離保存。

供試病原菌：玉米大斑病原真菌大斑凸臍蠕孢菌（Exserohilum turcicum）、玉米小斑病原真菌玉蜀黍離蠕孢（Bipolaris maydis）、禾谷莖腐病原真菌禾谷鐮孢（Fusarium graminearum）、煙草炭疽病原真菌膠孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）、玉米紋枯病原真菌立枯絲核菌（Rhizoctonia solani）均由云南農業大學植物保護學院生物防治實驗室提供；甘蔗梢腐病原真菌串珠鐮刀菌（Fusarium moniliforme）由云南農業大學甘蔗研究所提供。

1.1.2 培養基 LB培養基：蛋白胨10 g、酵母粉5 g、氯化鈉10 g、蒸餾水1000 mL；固體培養基在此基礎上加入瓊脂17 g；均在121 ℃下滅菌20 min。

PDA培養基：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、蒸餾水1000 mL；固體培養基在此基礎上加入瓊脂17 g；均在115 ℃下高壓滅菌20 min。

1.2 薏苡葉斑病的分離鑒定

1.2.1 病原菌的分離純化 采用組織塊分離法［12］，選取薏苡的感病葉片，從病健交界處切取4～5 mm的感病組織，放入75%的酒精溶液中消毒，浸泡約1 min后使用無菌水沖洗3次，用無菌濾紙吸干，接入PDA培養基中，在25 ℃的培養箱中培養3～4 d。待PDA平板上長出疑似病原菌的微菌落后，用無菌接種針挑取菌落邊緣的菌絲塊，在新鮮的PDA平板上純化培養。

1.2.2 病原菌致病性的檢測 利用柯赫氏法［13］對分離物進行致病性測定。

離體葉片培養：將分離物在PDA培養基上預培養5 d后，選取健康的薏苡葉片，表面用75%的酒精消毒，然后用無菌針在葉片表面刺傷形成傷口，將上述分離純化的分離物打成菌餅倒貼于刺傷處，重復3次。接種后保濕，在28 ℃下培養，待葉片發病后，從病部對病原菌進行再分離，觀察所分離物的形態特征與原分離物的是否一致。

盆栽噴施：將病原菌培養至產孢狀態，利用無菌水配制成一定濃度的孢子懸浮液；將孢子懸浮液噴施在薏苡葉片上，觀察植株是否發病；待葉片發病后，從病部對病原菌進行再分離，觀察所分離物的形態特征與原分離物的是否一致。

1.2.3 病原菌的鑒定 將純化的病原菌菌株在PDA培養基上培養，觀察菌株的菌落形態、顏色和產孢情況。參照OMEGA真菌DNA小量提取說明書進行病原菌基因組DNA的提取，利用ITS通用引物進行PCR擴增，將目的片段送至上海生工生物工程有限公司進行測序。

1.3 生防菌的篩選

1.3.1 生防菌的初篩 使用平板對峙培養法［14］，用打孔器將病原菌絲塊處理成直徑為0.50 cm的菌餅，將菌餅接種到直徑為9.00 cm的PDA板的中心，在離中心3.00 cm的四周，接種不同的薏苡內生細菌。以接種無菌水作為對照，每個處理3次重復，在28.0 ℃的細菌培養箱中培養3 d后，測量抑菌帶的大小。

1.3.2 生防菌的復篩 在初篩中，將抑菌帶平均寬度大于1.50 cm的內生細菌作為復篩菌株。將復篩菌株的菌絲塊處理成直徑為0.50 cm的菌餅，然后將菌餅接種于PDA培養基中心，在離中心3.00 cm的四周，接種其拮抗的薏苡內生細菌。以接種無菌水作為對照，每個處理3次重復；3 d后測量抑菌圈大小，并計算抑菌率。

1.3.3 生防菌的廣譜性測定 對抑菌率最高的內生菌進行廣譜性測定，方法與1.3.2節中的方法相同。

1.4 生防菌的鑒定

將生防效果最好的菌株在LB培養基上劃線，在35 ℃下培養24 h后，對菌株進行形態學觀察。使用通用引物27F：AGTTTGATCMTGGCT和1492R：GGTTACCTTGTTACGACT，以及持家基因gyrA的引物GyrA-F（5′-CAGTCAGGAAATGCGT ACGTCCTT-3′）和GyrA-R （5′-CAAGGTAATGCT CCAGGCATTGCT-3′）進行PCR擴增。將目的片段送至上海生工生物工程有限公司進行測序。

2 結果與分析

2.1 病原菌的分離與致病性檢測

如圖1a所示，將病原菌菌餅放在健康的薏苡葉片上，在28 ℃下培養3 d后，發現薏苡葉片變黃，表面有斑點，而對照則無癥狀。通過組織塊分離法分離后，在PDA培養基上純培養物的形態特征與先前分離得到的Y2一樣，鏡檢觀察到的分生孢子也與Y2一致，說明菌株Y2可能引起離體的薏苡葉片發病。為了進一步驗證，將Y2菌株配制成孢子懸浮液，并噴施在薏苡葉片上，結果如圖1b所示，在噴施10 d后，薏苡葉片枯萎，有感病現象;再分離物的形態特征和孢子結構也均與Y2一致，符合科赫式法則，表明Y2病原菌對薏苡葉片有致病作用。

圖1 薏苡葉斑病分離病菌的致病性檢測結果

2.2 病原菌的鑒定

2.2.1 形態觀察 如圖2所示，分離得到的Y2病原菌的菌落為圓形，菌落灰褐色，絨毛狀，不易產孢，背面呈淡棕色；分生孢子單生，有隔膜，卵形，屈膝狀彎曲。

圖2 薏苡葉斑病病原菌的形態特征

2.2.2 ITS序列鑒定 用真菌的通用引物ITS1/ITS4對Y2進行PCR擴增，將擴增結果提交給Gen Bank，與序列相似性較高的模式菌株進行比對，構建系統發育樹，結果如圖3所示，分離得到的Y2菌株與Curvularia coicis（登錄號：NR_147457.1）在同一個分支上，相似度達89%，因此將Y2鑒定為彎孢霉Curvularia coicis。

圖3 基于ITS序列的系統發育樹

2.3 生防菌的篩選

2.3.1 生防菌的初篩 由表1可知：共篩選到12株對薏苡葉斑病病原菌有抑制作用的薏苡內生細菌，抑菌帶均大于1.00 cm；其中菌株R24、L21、R26、L47的抑菌帶均在1.50 cm以上，以L47的抑菌效果最好，抑菌帶達1.76 cm。

表1 內生細菌菌株與薏苡葉斑病菌平板對峙培養結果

2.3.2 生防菌的復篩 對初篩中抑菌帶在1.50 cm以上的4株內生細菌菌株進行復篩，結果如表2和圖4所示，4株細菌的抑菌率在65%以上；其中分離自文薏2號莖稈的L47的抑菌率最高，為73.82%；分離自文薏2號根系的R24的抑菌率最低，只有66.23%。

圖4 生防菌的復篩結果

表2 生防內生細菌菌株的復篩結果

2.3.3 生防菌L47的抑菌廣譜性測定 經過初篩和復篩，發現分離自文薏2號莖稈的L47菌株的生防效果最好。采用平板對峙法對L47菌株進行抑菌譜的測定，結果如表3和圖5所示，菌株L47對玉米紋枯病菌、玉米小斑病菌、玉米大斑病菌、甘蔗梢腐病菌、禾谷莖腐病菌、煙草炭疽病菌等都有抑制作用，抑菌率在64%～73%之間。

圖5 L47對幾種病原真菌的抑制作用

表3 菌株L47的抑菌廣譜性測定結果

2.4 生防菌的鑒定

生防菌L47的菌落形態如圖4和圖6所示，菌落圓形，白色，表面粗糙。對菌株L47進行16S rDNA基因片段擴增，將PCR擴增產物結果提交給Gen Bank，與序列相似性較高的模式菌株進行比對，構建系統發育樹（圖7）。結果顯示：菌株L47與Bacillus subtilis（登錄號：NR 027552.1：34-989）在同一個分支上（圖7a），相似度達96%，為枯草芽孢桿菌。將gyrA基因序列的測序結果在NCBI中進行BLAST比對，結果顯示菌株L47與Bacillussp.（登錄號：OK564471.1：1-921）的gyrA基因序列最為相似，同源性達94%（圖7b）。

圖6 生防菌L47的菌落形態

圖7 菌株L47的系統發育樹

3 討論

薏苡葉斑病發病初期在葉片上出現水漬狀半透明小斑點，周邊為淡黃色暈圈，隨后在水漬狀斑點中心出現1個白色小點；之后病斑繼續擴大，到拔節期會大面積發病，導致葉片枯萎，植株生長減弱，產量和品質下降［15］。章霜紅［16］將薏苡葉斑病的病原菌鑒定為尾孢（Cercosporasp.）。在本研究中，將感病葉片在PDA培養基上培養，再將培養物分離純化、進行致病性檢測后，發現純化培養物能夠使薏苡葉片發病；再分離感病植株得到的純化物與Y2的形態特征、孢子形態一致；通過ITS序列擴增，將其鑒定為Curvularia coicis［17］。這與Dai等［18］從福建薏苡葉斑病病葉上分離純化得到的病原菌一樣。

生物防治具有無污染、不會誘發抗藥性的優點，彌補了化學防治的諸多不足［19］。枯草芽孢桿菌具有防治植物病害的作用，用枯草芽孢桿菌制備生防制劑防治植物病害已成為國內外研究的熱點［20－21］。枯草芽孢桿菌通過成功定殖在植物體內，分泌抗菌物質以抑制病原菌生長，同時誘導植物防御系統抵御病原菌入侵，從而達到生防的目的［22－23］。

本研究從已經分離得到的薏苡內生細菌中篩選到1株生防細菌L47，L47對薏苡葉斑病病原菌的抑菌率為73.82%，低于謝林艷等［24］篩選的YC89對鐮孢炭疽菌的抑菌率，但高于程萍等［25］篩選的B10b對石斛蘭葉斑病菌的抑菌率。通過平板對峙法測定生防菌的抑菌廣譜性發現，L47具有較寬的抑菌譜，對玉米紋枯病菌、玉米小斑病菌、玉米大斑病菌、甘蔗梢腐病菌、禾谷莖腐病菌、煙草炭疽病菌等菌的生長都有一定的抑制作用，抑菌率為64.29%～73.68%。利用16S rDNA序列進行測序分析，發現菌株L47與枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）的同源性達到96%；結合gyrA序列分析，最終將菌株L47鑒定為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）。

目前生防菌的研究大部分集中在實驗室內，而有些生防菌株在室內培養皿上和田間農作物上的防治效果大不相同，因此想要得到生防能力高效且穩定的菌株，需要將培養皿篩選、盆栽生防效果以及田間生防效果相結合。此外，還需要對菌株的生防機理、生長環境以及基因型進行研究，從而為生物防治奠定理論基礎。

4 結論

本研究篩選得到1株對薏苡葉斑病有防治效果的內生細菌L47；發現L47對玉米紋枯病菌、玉米小斑病菌、玉米大斑病菌、甘蔗梢腐病菌、禾谷莖腐病菌、煙草炭疽病菌等均有一定的抑制效果；將菌株L47鑒定為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）。