煙曲霉菌（Aspergillus fumigatus）的耐熱性研究

何鵬搏，李詠梅*，朱自萍，何鵬飛，何月秋，吳毅歆，蔡永占，符宗偉，Munir Shahzad，王軍偉，田陽陽，王云月**

（1.云南農業大學，云南 昆明 650201；2.云南省煙草公司 曲靖市公司，云南 曲靖 655000；3.紅塔煙草（集團）有限責任公司，云南 玉溪 653100）

煙曲霉（Aspergillus fumigatus）在自然界普遍分布，廣泛存在于海洋［1］和土壤，營腐生生活［2］，是土壤中優勢真菌之一［3］，其還可以在植物中內生［4］，如在白三葉草［5］、蒜頭果［6］、紅茄莓［7］和霸王鞭［8］中內生。它對農藥殘留、廢棄農用薄膜、蒽污染和農作物秸稈都有很好的降解作用［9］。然而，煙曲霉又是一種機會致病菌，它在人畜身體較弱時，也會引起疾病［10］，如它會引起肺曲霉菌病［11］，導致患者死亡［12-13］，引起角膜炎［14］等。該菌耐高溫，能在55 ℃下生長［15］，在倉貯中易引起煙草霉變［16］，造成重大損失。為了給煙草霉爛病防控、人畜疾病控制及為有機肥發酵提供科學依據，本文開展了煙曲霉菌耐高溫能力和引起霉爛病溫度研究。

1 材料與方法

1.1 煙草品種和煙曲霉

煙草品種為云煙 105，取其中下部葉柄供接種試驗。煙曲霉菌Q-1 （Aspergillus fumigatusQ-1，下稱Q-1）為本實驗室于2018年8月分離自云南省宣威市格宜鎮宜興烤煙合作社烤房煙草霉爛病樣本，且已被證明它是烘烤期煙葉霉爛病菌之一。

1.2 煙曲霉Q-1的耐熱性試驗

1.2.1 常壓下耐熱性試驗

1.2.1.1 菌絲體耐熱性 將在PDA上培養好的Q-1，用0.3 cm打孔器打成菌餅，分別置于裝有100 μL的滅菌水和空的PCR管內，將PCR管放入PCR儀（型號L96+，杭州朗基科學儀器有限公司）中檢測菌體的耐熱性。溫度設置為40～95 ℃，以5 ℃為1節點，共12個溫度節點，加熱5 min和10 min，每個節點6次重復。處理過的菌餅加入適量的滅菌水，混勻后，涂布于PDA板上，于37 ℃下黑暗培養48 h后統計菌落數，統計存活率。

1.2.1.2 孢子耐熱性 分生孢子耐熱性分：（1）在空氣中耐熱性：取Q-1的分生孢子1 mg，加入PCR管中，于PCR儀中60～90 ℃處理10 min。（2）在水相中耐熱性：將100 μL的1.5×106CFU/mL孢子液裝入PCR管內，于PCR儀中50～95 ℃處理5 min和10 min。2種試驗后，PCR管中均加滅菌水稀釋，再涂于PDA板上，于37 ℃下黑暗培養48 h后統計菌落數，統計存活率。以上各處理均重復6次。

1.2.2 在加壓下的耐熱性試驗 將在PDA上培養好的Q-1孢子用滅菌水洗下，混入121 ℃下間歇滅菌40 min和未滅過菌的2種煙草地土壤中，分成1 g裝入試管，置于滅菌鍋（型號LDZX-75KBX，上海申安醫療器械廠）中，121 ℃、0.105 MPa下滅菌20、30、35、40、45和50 min，10倍稀釋后涂板于加有10 μg/mL的氯霉素（排除細菌的干擾）PSA平板上，置于37 ℃溫箱中培養48 h，計數煙曲霉菌落數。以常溫不滅菌處理為對照。各處理重復3次，每重復包括4個培養皿的平均菌落數，計算存活率。

1.3 高溫處理煙曲霉Q-1的致病性試驗

取新鮮的煙草葉柄，各切成長約1 cm的組織塊，置于直徑6 cm的培養皿中，每皿3段。培養皿墊有吸水紙，每皿加7 mL滅菌水保濕。接種Q-1的1.5×107CFU/mL孢子懸浮液100 μL于兩端切口處，再分別置于50、60、65、70、80、90和95 ℃的培養箱中處理10 min后，取出后置于37 ℃保濕4 d，取出觀察發病情況。各處理均重復3次。

2 實驗結果

2.1 菌體的耐熱性

2.1.1 在培養基上的耐熱性 將Q-1菌餅分別放入有滅菌水和無滅菌水的PCR管中，于PCR儀上40～95 ℃溫度下加熱5 min和10 min，再放入PDA平板上培養，結果見表1。Q-1在40～95 ℃溫度范圍內，2種時間段分別處理后，再轉入37 ℃下培養，所有處理和重復的菌餅均長出菌絲和分生孢子，即在95 ℃時，菌餅上的Q-1仍保存著生命力。

表1 煙曲霉Q-1菌絲體在有水和無水PCR管中的耐熱性

2.2 分生孢子的耐熱性

2.2.1 分生孢子在空氣中的耐熱性 將煙曲霉Q-1分生孢子直接放入離心管中，置于PCR儀中60～90 ℃加熱處理10 min后，涂布于平板培養，發現其仍能長出菌落，表明煙曲霉Q-1分生孢子在60～90 ℃下10 min仍能存活，但存活率隨著溫度升高而下降，至80 ℃和90 ℃時，存活率僅分別0.14%和0.04%（表2）。

表2 煙曲霉Q-1孢子在不同溫度下處理10 min的 存活情況

2.2.2 分生孢子在水相中的耐熱性 將煙曲霉Q-1分生孢子制作成懸浮液，置于50～95 ℃分別處理5、10 min，培養48 h后，結果見表3。Q-1在70 ℃及以上溫度處理時，均未長出菌落；處理5 min時，在68 ℃處理溫度中，孢子存活率僅為6.25×10-6%；在65 ℃處理溫度中，孢子存活率為 8.75×10-4%；在60 ℃處理溫度中，仍有2.69%孢子存活。處理10 min時，在68 ℃處理溫度中，無孢子存活；在65℃處理溫度中，孢子存活率為1.25×10-4%；在60 ℃處理溫度中，有0.29%孢子存活；在50 ℃處理溫度中，有63.67%孢子存活。即隨著溫度升高和處理時間的延長，Q-1分生孢子在水相中存活力下降，其最高耐熱率的培養溫度和時間分別為68 ℃、5 min。

表3 煙曲霉Q-1孢子液在不同溫度下的存活情況

2.3 煙曲霉在加壓下對溫度的耐受性

在121 ℃溫度和0.105 MPa大氣壓下，滅菌與未滅菌土壤加入煙曲霉孢子液經幾種滅菌時間處理后，煙曲霉的分生孢子死亡率都達100%。即煙曲霉雖然能耐高溫，但是在121 ℃高溫和0.105 MPa大氣壓下滅菌20 min及以上都不能存活。

2.4 不同溫度處理的煙曲霉Q-1孢子引起煙草葉柄發病能力

將Q-1分生孢子懸浮液接種到煙草葉柄切口處，分別置于50～95 ℃的培養箱中處理10 min，培養4 d后葉柄處產生霉爛病癥狀結果見表4。接種煙草葉柄在涂布經80、90、95 ℃處理10 min的孢子懸浮液后未發病，而涂布經50、60、70 ℃處理的孢子懸浮液后均發生典型霉爛病，表明煙曲霉在50～70 ℃的煙草葉柄上仍能存活，孢子具有萌發和侵染能力。

表4 煙曲霉Q-1孢子液在煙草葉柄上于不同溫度處理10 min的發病情況

3 討論與結論

煙草霉爛病多發于烘烤過程中的高溫高濕期，即變黃期和定色期，且在通風條件不好、密閉的烤房霉爛病愈發嚴重。有研究表明煙曲霉亦是烘烤期煙葉霉爛病病原之一。本研究結果表明煙曲霉在較高溫度下仍能較好地存活，即使達95 ℃時，菌絲體和孢子仍能存活。總體來說，分生孢子耐受高溫的能力弱于菌絲體，如以菌絲塊置于氣相和水相中，即使95 ℃處理10 min，在37 ℃下培養還能長出菌落，但將純孢子置于水相中68 ℃以上，處理10 min后孢子就不能萌發。在空氣中，分生孢子即使在80 ℃和90 ℃時，處理10 min后孢子存活率分別達0.14%和0.04%。然而，即使在80 ℃以上孢子存活率較低，但其對于產孢子量大的煙曲霉來說，其侵染潛力仍不可小覷。當把孢子液接種到煙葉柄切口處，放置于50～70 ℃溫度下處理10 min，再轉到37 ℃下，煙葉柄仍能出現典型的煙曲霉霉爛病。

張晉卿等［18］采用酵母浸膏培養基研究證明煙曲霉最適宜生長溫度為37 ℃，最高生長溫度為52 ℃；65 ℃處理180 min或70 ℃處理120 min均能使煙曲霉完全失活。但本研究采用水相下處理，在68 ℃下處理10 min后，孢子全部死亡；在空氣中于60 ℃和90 ℃下處理10 min，孢子存活率仍達86.20%和0.04%，而菌絲體在95 ℃下處理10 min仍能存活。上述結果表明煙曲霉的耐熱性很強，但筆者與張晉卿等的結論差異可能來自不同菌株及試驗方法的不同所致。

由于煙曲霉是實驗室操作中會經常引起污染，本研究證明它不能耐受在121 ℃和0.105 MPa下的滅菌處理，從而證明實驗室出現煙曲霉污染是來自不嚴格的無菌操作所致，而不是其耐高溫的緣故。

農作物附產品是農田有機質重要來源，為了加速該類有機質原料的腐熟，添加腐熟菌種是最常見的方法。然而，大多數有機肥發酵的溫度都不會超過72 ℃，溫度過高引起發酵菌功能下降，會延長發酵周期。本研究證明煙曲霉菌絲在氣相下于70 ℃中仍能存活，在70 ℃下處理10 min，分生孢子仍然不失侵染煙草葉柄引起霉爛病的能力，展現了其用于發酵農業有機廢棄物的潛力。