水處理中微生物固定化技術的研究進展

＊譚正堯 肖妮 李天琦 王小鳳,2,3 陳金毅,2,3*

（1.武漢工程大學化學與環境工程學院 湖北 430205 2.綠色化工過程教育部重點實驗室 湖北 430299 3.湖北省化工環境污染控制工程技術研究中心 湖北 432406）

固定化細胞技術被定義為在整個系統中，通過自然的或人工合成的細胞被限制在水相以外的部分。生物膜存在于表面或自然結構，如人體，谷物，玻璃等[1]。這種自然現象啟發研究人員利用其解決實際問題。自1970年末以來，通過固定化氨酰酶，固定化技術已在實際中得到廣泛應用[2]。

1.固定化類型

吸附法是利用細胞和基質之間的范德華力、靜電吸附、水合作用和疏水作用固定。吸附分為長程和短程相互作用。短程相互作用涉及氫鍵，離子—偶極相互作用，其中細胞與表面之間的距離小于5nm。遠程相互作用涉及非特異性吸附（范德華力），其中細胞與表面之間的距離大于50nm。吸附法的缺陷在于在使用過程中，微生物與載體之間的結合力較弱，不穩定，不易控制負載，所以微生物從基質中脫落的比例非常高且再現性也很低[3]。

共價耦聯是應用最廣泛的方法之一，其通過生物細胞表面的反應性基團（例如-NH2或-COOH基團）與活性基團（例如蛋白質）固定微生物。共價耦聯固定后，微生物的穩定性將顯著提高，但在耦合聯結過程中微生物的生物活性將迅速降低[4]。共價固定化法主要用于酶的固定化，但由于耦聯劑的毒性常常導致細胞活力或酶活性的喪失，在細胞固定化中應用較少[5]。

包埋法是一種將微生物包裹在多孔聚合物基質中，使基質和產物擴散的細胞固定化技術。該方法中使用的聚合物基質具有多孔結構，污染物和各種代謝產物容易擴散到基質中。因此，傳質是影響固定化細胞系統活性和效率的主要因素之一[6]。

包埋包括將細胞包裹在聚合物網絡（晶格包埋）、膜或微膠囊中。細胞包埋技術主要可分為兩類，膠體包埋和預制多孔基體包埋。在機制原理上，膠體包埋指的是多孔基質在細胞周圍原位合成；而對于多孔預制基質體系，細胞擴散到預制成型的多孔基質中并生長，直至固定。膠體包埋是在固定化的微生物周圍創建一個保護屏障，防止細胞從聚合物泄漏到周圍的培養基中，同時允許營養物質和代謝物的轉移。預制多孔基體包埋指的是使細胞擴散到預先形成的多孔基質中。細胞開始生長后，其他細胞和基質的存在阻礙了它們的活動性從而有效進行捕獲。已經證明，通過包埋技術的固定化具有優于游離細胞系統的顯著優勢，例如保護細胞免受流體切應力、惡劣的環境以及細胞易于從培養物中分離。但依舊存在一些缺陷，例如細胞滲漏、固定化成本、擴散限制、固定期間的失活以及使用期間載體材料的磨損。另一個缺點是負載能力低，因為必須將生物催化劑摻入載體基質中。

2.載體的選擇

載體的選擇取決于各種因素：具有良好的機械強度、重量輕、整體形狀的靈活性、無毒、在測試條件下不可生物降解以及成本效益。一般來說，用于固定化微生物細胞的載體材料有兩種：無機載體和有機載體。

無機載體材料不僅具有良好的成本效益，而且能夠抵抗微生物的降解，具有良好的熱穩定性。木材、鋸屑、陶瓷、多孔玻璃、黏土、活性炭、沸石是最常用的無機載體。固定化穩定性依舊是無機載體存在的最大問題，因為缺少相關官能團和化學鍵使得探索改性無機載體和豐富基團的新無機載體成為研究熱點[7-8]。

有機載體大致可以分為兩類：天然聚合物載體和合成聚合物載體。天然聚合物載體有瓊脂、海藻酸鹽、卡拉膠和殼聚糖等，合成聚合物載體有聚乙烯醇（PVA）、聚乙二醇（PEG）、聚氨基甲磺酸鹽（PCS）、聚丙烯酰胺（PAM）等。天然聚合物的擴散限制能力低、微生物生長狀態好、易于固定、無毒且成本低，但溶解性能差，容易降解，穩定性能差；而合成聚合物機械性能好生物性能卻相對一般，成本較高且它們的適用范圍是有限的[9]。

最近的研究中也有不少利用有機和無機載體結合的復合載體，或是在有機或無機載體中添加一些金屬氧化物以優化微生物代謝條件。Jiang等[10]制備了一種新型的細菌細胞固定化載體（ZnONPs/PVA）復合材料用于固定化蒼白桿菌，細菌生長良好且在適宜條件下喹啉的去除率可達97%以上。Su等[11]以Fe3O4/Cu/PVA為吸附劑和固定化載體，確定去除硝酸鹽的最佳條件并可為微生物提供額外電子供體影響細菌的豐度和種類。

3.決定微生物固定的活性要素

(1)活性程度的理化表現

微生物固定化載體后活性的大小往往是不一致且混亂的，如何將微生物的活性程度以數值確定下來成為了研究的重點。常用的三個活化率為：固定化產率、固定化效率、活性回收率。固定化產率應用于描述游離微生物在溶液中被固定的總微生物活性的百分比，如公式（1）所示。

“固定活性”只能通過測量固定后殘留在溶液中的總殘留微生物活性并從總起始活性中減去該活性以確定。在某些情況下，應進行平行空白實驗以補償固定條件下游離微生物的失活。有時使用蛋白質測量來確定固定化產量。這可能會產生誤導，特別是當使用粗蛋白混合物進行固定時，因為不同的蛋白質可能具有不同的固定產量。

固定化效率描述了在固定物中觀察到的結合微生物活性的百分比，如公式（2）所示。

理論上，當溶液中的微生物全被載體固定下來但固定菌劑本身沒有活性時，此時的固定化產率為100%，但固定效率為0%，此時可能因為在固定化過程中，由于某種原因微生物失活。

活性回收率也稱活性恢復是固定化產率乘以固定化效率，描述了總體上成功完成固定化的活性過程。通過活性回收率，是將固定物菌劑的活性與溶液中游離微生物的總起始活性進行比較，如公式（3）所示。

上述式（1）、式（2）、式（3）都必須使用總活度單位，即μmol·min-1。

可測活性在固定化效率和固定化產率中由實驗條件如不同類型的底物、底物濃度、pH值和溫度，和固定載體的理化性質如粒徑、疏水親水性、空隙大小等決定。因此，為特定情況設定固定化菌劑時應當盡可能在投入使用時進行活性測定，這對固定化過程以及之后應用過程的經濟效益極為重要。

(2)胞外聚合物(EPS)

當微生物在任何自然環境中生長時，它們都傾向于微生物的聚合形式生長，而這些聚集形式包括絮凝體、多聚物以及薄膜等，這些生物膜嵌入在多種微生物的聚合基質上時就形成了胞外聚合物（EPS）。胞外聚合物（EPS）為微生物聚合體決定了其生物理化特性，保障了生物酶活性和營養來源并提供了必要的粘合力。那么決定微生物固定載體的生物活性要素根源取決于傳質過程是否收到限制。

EPS主要由碳水化合物（多糖）、蛋白質、核酸、脂質和腐殖質構成。而多糖占EPS基質的主要成分，這些多糖組分為有機聚合載體包埋微生物菌體仍保持活性提供了理論依據。在EPS中存在的蛋白質包括結構蛋白、非酶蛋白和酶。結構蛋白、非酶蛋白例如與細胞表面相關的蛋白和細胞外碳水化合物結合蛋白也參與基質網絡的形成，并在微生物表面和細胞外表面之間的界面處構成一個連接。而微生物與載體之間的共價耦合固定使得載體的反應基團與蛋白質之間產生反應導致微生物活性降低，這也證實了EPS是生物活性的關鍵因素。

(3)載體因素

微生物固定在載體上的活性程度根本上取決于①載體本身或是載體衍生物對微生物是否產生影響；②載體是否限制了微生物代謝產物與底物之間的傳質過程。

為保證微生物固定后的正常生理活性，在對載體的設計考慮就應該選擇本身不存在生物毒性的材料，此時一些天然載體與微生物EPS成分相近，具有高蛋白親和力和很好的生物相容性，同時它們的吸附能力強，載體具有剛性優勢，修飾簡單、鍵合穩定使得它們能成為固定化的活性保障。固定能力是固定活性的前提，而官能團的豐富度決定載體與微生物之間的固定量。官能團的類型和數量決定了載體基質為親水性還是疏水性，從而決定了微生物與載體之間極性或是疏水性相互作用的能力。通過使用聚合載體，可以決定基質間微生物單體的間隔。較長的間隔決定了微生物較高的構架靈活性，較短的間隔可以保護生物分子受熱失去活性，并減少微生物的浸出。

微生物固定活性很大程度由載體是否對菌體由傳質限制決定。對于載體而言，具有多孔介質、較大的孔隙率以及多個固定位點顯得極為重要。碳基材料在這方面就展現了巨大的優勢，活性炭、未改性炭和改性炭材料已成為固定化微生物的有效載體材料。與其他材料不同，碳納米管增強了底物和固定化微生物之間的電子轉移，納米尺寸讓微生物擁有了低阻傳質和減少擴散限制的優勢。

4.固定化技術的應用

(1)流化床反應器(FBR)

流化床反應器因其混合效果好、傳質性能好等特點，常被用于處理高濃度有毒有機廢水。其優點有：①對于降解外源生物和有毒化合物所必需的微生物具有較長SRT；②沖擊載荷和不可生物降解的有毒化合物可吸附在固定化載體上；③較低水平的總懸浮固體（TSS）和COD。傳統上，在過去的幾十年中，無機顆粒（例如沙子、活性炭）被廣泛用作流化床生物反應器中的流化介質。然而，無機載體的密度非常高，這導致運營成本的增加。因此，越來越多的低密度有機載體被選擇或合成來代替無機載體，以提高固定化微生物的流化性能和廢水的去除效率。

(2)填充床生物反應器(PBR)

與流化床反應器相比，填料床反應器用于污水處理的運行成本較低。該技術已廣泛應用于固定化載體基質上的微生物廢水處理。在該生物反應器中，來自初級澄清池的廢水被均勻地分配到載體的表面上，并被固定在載體上的微生物處理。填充的載體是PBR的基本單元，并且填充的載體的表面積提供了生物活性中心，以提高生物反應器中的反應速率。因此，許多研究工作集中在各種填充床生物填充載體上的選擇與結合。

(3)膜生物反應器(MBR)

膜生物反應器這一概念最小化了許多與物理化學處理流程相關的單元操作，同時仍然實現了廢水中污染物如可溶性有機碳和氮化合物的生物降解。通常，這種方法使用的膜是多孔超濾膜，但無孔膜（聚合膜）同樣適用。而這種生物反應器的缺點也很明顯，化學或物理方法不能直接應用于生物過濾系統，因為它會對生物過濾系統產生有害影響。

(4)氣升式生物反應器(ABR)

氣升式生物反應器主要利用了好氧型微生物或污泥與空氣水三相的密度差，從底部通入上升氣流，通過三相密度差的充分混合達到生物反應的效果。其中在整個設備上層進行氣相檢測，底部進行混合相靜置檢測。其中由于游離態微生物和污泥易于膨脹對整個系統會發生堵塞現象，故載體單元的選擇可使得目的微生物進行優勢純化且易于收集。

5.結語

現階段固定化微生物與游離細胞相比，具有易于回收保存和去除降解效率高等顯著特點。但實際廢水的結構復雜、操作復雜、組成復雜，阻礙了固定化微生物技術在廢水處理中的大規模商業工程應用。故固定化系統的發展方向主要集中于提高固定化載體活性物質濃度，延長固定化載體的使用壽命，提高固定化微生物的穩定性，設計和制備具有活性基團、多孔結構、高表面積、良好的生物相容性和穩定的理化性能的新型固定化載體。