基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接技術(shù)探討圣愈湯治療骨關(guān)節(jié)炎的作用機(jī)制

朱在師，趙啟剛，李西海

（1.福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究院，福建 福州 350122；2.福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院，福建 福州 350122）

骨關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis，OA）是一種常見(jiàn)、多發(fā)、難治的慢性筋骨病，以滑膜炎癥、軟骨退變、軟骨下骨代謝異常為病理特征［1］。OA 屬于中醫(yī)“痹證”“痿證”范疇，OA 患者多因年老體衰、肝腎虧虛，引發(fā)氣血、筋骨失和，導(dǎo)致發(fā)病［2］。針對(duì)氣血失和是OA 的重要發(fā)病機(jī)制，臨床常用圣愈湯（出自《醫(yī)宗金鑒·刪補(bǔ)名醫(yī)方論》）調(diào)和氣血以治療OA［3-5］。但圣愈湯治療OA 的活性成分尚未明確，有待進(jìn)一步研究，因此，本研究借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)和分子對(duì)接技術(shù)探討圣愈湯治療OA 可能的作用機(jī)制。

1 方 法

1.1 圣愈湯活性成分、藥物靶點(diǎn)篩選 通過(guò)中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)（TCMSP，https：//tcmspw.com/tcmsp.php）以口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%且類藥性（drug likeness，DL）≥0.18 作為篩選條件，篩選圣愈湯中黃芪、人參、熟地黃、白芍、川芎、當(dāng)歸的活性成分，同時(shí)在該數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索下載符合要求的活性成分對(duì)應(yīng)的藥物靶點(diǎn)。

1.2 OA 差異基因的獲取 以“osteoarthritis”為檢索詞，在GEO 數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）中檢索OA 相關(guān)基因測(cè)序表達(dá)芯片，將得到的結(jié)果按條目類型項(xiàng)目選擇“Series”，研究類型項(xiàng)目選擇“Expression profilling by array”，物種項(xiàng)目選擇“Homo sapiens”進(jìn)行篩選，篩選后選取差異顯著的GSE 55457、GSE 29746、GSE 51588 3 個(gè) OA 芯片。通過(guò) PERL 軟件利用log2 算法，對(duì)這3 個(gè)OA 芯片進(jìn)行數(shù)據(jù)整理，獲取3 個(gè)芯片中的OA 差異基因。

1.3 活性成分-交集靶點(diǎn)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建及分析 利用PERL軟件將圣愈湯的藥物靶點(diǎn)分別與3個(gè)OA 芯片的OA 差異基因取交集，獲得3 個(gè)OA 芯片與圣愈湯藥物靶點(diǎn)的交集靶點(diǎn)，通過(guò)R 語(yǔ)言將3 個(gè)芯片的交集靶點(diǎn)取并集且去重，獲得圣愈湯治療OA 的交集靶點(diǎn)。將圣愈湯治療OA 的交集靶點(diǎn)及活性成分導(dǎo)入Cytoscape 3.8.1 軟件，繪制圣愈湯活性成分-交集靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖，篩選度值從大到小排序前10 的成分作為圣愈湯治療OA 的主要活性成分。

1.4 交集靶點(diǎn)蛋白互作網(wǎng)絡(luò)（PPI）的構(gòu)建與分析 將交集靶點(diǎn)導(dǎo)入 String 數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//cn.string-db.org/），將物種設(shè)為“Homo Sapiens”，最低閾值設(shè)為≥0.4，進(jìn)行PPI 分析。從String 數(shù)據(jù)庫(kù)導(dǎo)出分析所得數(shù)據(jù)并導(dǎo)入Cytoscape 3.8.1 軟件，繪制交集靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)圖，以中介中心性（BC）、接近中心性（CC）和節(jié)點(diǎn)數(shù)目（DC）三者大于各自中位數(shù)作為篩選條件，篩選2 次，保留符合條件的交集靶點(diǎn)作為圣愈湯治療OA 的關(guān)鍵靶點(diǎn)。

1.5 GO 生物學(xué)進(jìn)程與KEGG 通路富集分析 使用R 語(yǔ)言中Bioconductor 插件，對(duì)交集靶點(diǎn)進(jìn)行GO 的生物學(xué)過(guò)程（bilgical process，BP）、分子功能（mlecular functin，MF）、細(xì)胞組分（cell components，CC）以及KEGG 通路富集分析，以P＜0.05 為篩選條件，取矯正后P值排名前10 的生物學(xué)功能和排名前20 的信號(hào)通路進(jìn)行分析。

1.6 分子對(duì)接驗(yàn)證 利用PDB 數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.rcsb.org/）下載PPI 網(wǎng)絡(luò)篩選出的關(guān)鍵靶點(diǎn)的3D 結(jié)構(gòu)，在 PubChem 數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）下載關(guān)鍵靶點(diǎn)對(duì)應(yīng)的活性成分結(jié)構(gòu)；用PyMOL 2.4.1 軟件移除關(guān)鍵靶點(diǎn)受體結(jié)構(gòu)中的水分子以及小分子配體，然后導(dǎo)入AutoDock Tools 1.5.6軟件，使對(duì)接位點(diǎn)選擇以原有配體為中心，設(shè)置網(wǎng)格箱（gird box）為默認(rèn)值；最后利用AutoDock Vina軟件完成圣愈湯關(guān)鍵活性成分與核心靶點(diǎn)的對(duì)接，將對(duì)接結(jié)果輸出為txt 文件和pdbqt 文件，通過(guò)txt 文件查看兩者的最低結(jié)合能，用PyMOL 2.4.1打開(kāi)pdbqt文件查看對(duì)接圖像；通過(guò)關(guān)鍵靶點(diǎn)和活性成分的分子對(duì)接結(jié)果來(lái)驗(yàn)證網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)篩選結(jié)果。

2 結(jié) 果

2.1 圣愈湯活性成分及藥物靶點(diǎn) 共篩選出圣愈湯56 個(gè)活性成分，其中共有6 個(gè)重復(fù)活性成分，其余活性成分及靶點(diǎn)數(shù)量，見(jiàn)表1。

表1 圣愈湯活性成分及藥物靶點(diǎn)基本信息

2.2 OA 差異基因 在 GSE 55457、GSE 29746、GSE 51588 3 個(gè) OA 芯片中，分別有 1 770、2 342、4 532 個(gè)OA 差異基因。

2.3 活性成分-交集靶點(diǎn)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建及分析 得到3 個(gè)芯片的26、39、54 個(gè)交集靶點(diǎn)，將3 芯片的交集靶點(diǎn)取并集且去重，獲得圣愈湯治療OA的98 個(gè)交集靶點(diǎn)。構(gòu)建活性成分-交集靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖，見(jiàn)圖1。篩選DC 值前10 的活性成分，見(jiàn)表2。

圖1 活性成分-交集靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

表2 圣愈湯主要活性成分相關(guān)信息

2.4 PPI 的構(gòu)建與分析 構(gòu)建交集靶點(diǎn)PPI 網(wǎng)絡(luò)圖，見(jiàn)圖2。篩選2 次并繪制新的PPI 網(wǎng)絡(luò)圖，篩選流程圖見(jiàn)圖3。排名前10 的關(guān)鍵靶點(diǎn)信息見(jiàn)表3。

圖2 交集靶點(diǎn)PPI 網(wǎng)絡(luò)圖

圖3 關(guān)鍵交集靶點(diǎn)篩選流程圖

表3 排名前10 的關(guān)鍵靶點(diǎn)信息

2.5 GO 與 KEGG 富集分析 GO 富集分析結(jié)果見(jiàn)圖4。結(jié)果顯示BP、MF、CC 主要富集于血管新生的調(diào)節(jié)、調(diào)節(jié)缺氧環(huán)境、促進(jìn)炎癥反應(yīng)對(duì)脂多糖等生物過(guò)程和氧化還原酶活性等分子功能上。KEGG富集結(jié)果，見(jiàn)圖5，結(jié)果顯示排名前20通路主要富集在IL-17、TNF、Toll 樣受體通路等進(jìn)程上。

圖4 GO 富集分析結(jié)果氣泡圖

圖5 KEGG 富集分析結(jié)果

2.6 分子對(duì)接驗(yàn)證 為進(jìn)一步驗(yàn)證圣愈湯治療OA 網(wǎng)絡(luò)預(yù)測(cè)結(jié)果，選取排名前3 的核心靶點(diǎn)與其對(duì)應(yīng)活性成分做分子對(duì)接驗(yàn)證，獲得活性成分與核心靶點(diǎn)分子對(duì)接自由能，見(jiàn)表4。結(jié)合自由能＜0 kcal/mol說(shuō)明配體和受體可以自發(fā)結(jié)合，一般認(rèn)為兩者結(jié)合自由能越低，發(fā)生作用的可能性越大。圣愈湯活性成分與核心靶點(diǎn)結(jié)合能均≤-5.0 kcal/mol，提示篩選出的核心靶點(diǎn)與其對(duì)應(yīng)的活性成分具有良好的親和力。分子對(duì)接結(jié)果，見(jiàn)圖6。

圖6 核心靶點(diǎn)分子與槲皮素對(duì)接結(jié)果展示

表4 核心靶點(diǎn)結(jié)合化合物的結(jié)合能

3 討 論

OA 歸屬中醫(yī)“痹證”范疇，中醫(yī)學(xué)認(rèn)為OA 病在筋骨，病位在肝、腎，以氣血失和為重要發(fā)病機(jī)制。肝主筋藏血，腎主骨藏精。若肝腎虧虛，氣血失和，則發(fā)為痹證，故治療OA 以調(diào)氣血、榮筋骨為治則［6］。圣愈湯出自《醫(yī)宗金鑒·刪補(bǔ)名醫(yī)方論》，由黃芪、人參、熟地黃、白芍、川芎、當(dāng)歸組成，具有益氣、攝血、補(bǔ)血之功效。

本研究通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探析圣愈湯治療OA的潛在作用機(jī)制。研究結(jié)果顯示：圣愈湯藥物中共有56 個(gè)活性成分，集中在黃芪、人參2 味中藥，槲皮素、山柰酚、異鼠李素、β-谷甾醇能匹配到較多的疾病靶點(diǎn)。槲皮素作為一種常見(jiàn)的黃酮類化合物，主要功能為抗氧化、抗炎及免疫，保護(hù)軟骨［7］；槲皮素還可通過(guò)p38 信號(hào)通路抑制巨噬細(xì)胞釋放促炎因子，并介導(dǎo)NF-κB 信號(hào)通路抑制炎癥反應(yīng)［8］。山柰酚能增加成骨細(xì)胞活化因子RUNX-2、Osterix、BMP2、RHCgⅠ表達(dá)［9］，通過(guò)抗炎、抗氧化，改善 OA病理變化。β-谷甾醇在抗氧化、抗炎、免疫調(diào)節(jié)等方面有一定的作用，可通過(guò)調(diào)節(jié)TNF-α、IL-6、MMP-13相關(guān)信號(hào)通路，抑制炎癥反應(yīng)，保護(hù)軟骨［10］。異鼠李素可抑制破骨細(xì)胞活性和軟骨細(xì)胞凋亡，從而避免軟骨損傷，以達(dá)到治療OA 的目的［11］。

PPI 分析結(jié)果提示白細(xì)胞介素-6（IL-6）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A（VEGFA）、基因金屬蛋白酶-9（MMP-9）、原癌基因（MYC）、轉(zhuǎn)錄因子AP-1（JUN）、環(huán)加氧酶 2（PTGS2）、缺氧誘導(dǎo)因子 1 亞基α（HIF-1α）、過(guò)氧化物酶體增生激活受體（PPARG）、熱休克蛋白90α 家族A 類成員1（HSP90AA1）、細(xì)胞周期蛋白D1（CCND1）是圣愈湯治療OA 的關(guān)鍵靶點(diǎn)。炎癥因子IL-6 受體在軟骨細(xì)胞中表達(dá)，在軟骨退變過(guò)程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。MMP-9 通過(guò)降解軟骨基質(zhì)，引發(fā)軟骨退變，參與 OA 病理進(jìn)程［12］。VEGFA 是血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子VEGF 中最重要的亞型，其對(duì)血管內(nèi)皮的增殖和分化的影響最大。研究表明，VEGF 的表達(dá)變化與滑膜炎癥、軟骨變性及軟骨細(xì)胞凋亡等過(guò)程密切相關(guān)［13］，同時(shí)可以促進(jìn)MMP-1 及MMP-3 的表達(dá)，從而導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨組織破壞［14］。

GO 富集分析結(jié)果顯示：圣愈湯治療OA 的生物學(xué)過(guò)程主要涉及脂多糖反應(yīng)、血管新生調(diào)節(jié)、缺氧環(huán)境調(diào)節(jié)、氧化應(yīng)激反應(yīng)等，與炎癥的形成與發(fā)展、血管調(diào)節(jié)有著密切的聯(lián)系。KEGG 通路富集結(jié)果顯示：圣愈湯治療OA 的信號(hào)通路主要有AGERAGE 信號(hào)通路、TNF 信號(hào)通路、Toll 樣受體信號(hào)通路、IL-17 信號(hào)通路等，集中在炎癥反應(yīng)、血管及細(xì)胞凋亡等方面。研究表明AGE-RAGE 可激活促炎因子的分泌，導(dǎo)致關(guān)節(jié)出現(xiàn)炎癥反應(yīng)，同時(shí)可充當(dāng)炎癥細(xì)胞因子來(lái)激活先天免疫細(xì)胞，推動(dòng)OA 病情的發(fā)展［15-16］。LPS 又稱內(nèi)毒素，可以激活 Toll 樣受體 4（TLR4），引起炎癥反應(yīng)。TLR4 識(shí)別 LPS 后，招募下游信號(hào)分子觸發(fā)一系列的信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，最終活化NF-κB，誘導(dǎo)促炎因子IL-1β 和TNF-α 等的表達(dá)［17］。IL-17 信號(hào)通路的主要功能在于促進(jìn)炎性因子的釋放，能夠上調(diào)IL-6、TNF-α、IL-1β 等炎性因子的分泌，進(jìn)而加重炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致軟骨出現(xiàn)不可逆轉(zhuǎn)的損傷；IL-17 還能抑制骨形態(tài)發(fā)生蛋白2誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞分化參與骨重建的調(diào)控［18］。我們推測(cè)圣愈湯治療OA 可能與該通路及調(diào)節(jié)氣血有關(guān)，有待進(jìn)一步認(rèn)證。

將核心靶蛋白與槲皮素對(duì)接后獲得的結(jié)合能均遠(yuǎn)小于參考值-5.0 kcal/mol，表明圣愈湯活性成分能與OA 核心靶點(diǎn)受體蛋白穩(wěn)定結(jié)合，并發(fā)揮顯著作用，基于此得到的網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果可信度較高，參考價(jià)值較大。

綜上所述，本文揭示圣愈湯的活性成分與OA的靶點(diǎn)基因之間復(fù)雜調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，提示圣愈湯治療OA 主要涉及的核心靶點(diǎn)包括IL-6、VEGFA、MMP9、MYC、JUN 等，靶點(diǎn)間作用關(guān)系復(fù)雜多樣，富集到多條通路，涉及了炎癥、血管生成、免疫等多個(gè)方面。提示圣愈湯可能通過(guò)調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)、血管生成、免疫反應(yīng)和細(xì)胞凋亡等方面治療OA。為進(jìn)一步驗(yàn)證網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)果，后續(xù)可開(kāi)展相應(yīng)基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。