月季黑斑病病原菌鑒定及生物學特性研究

陳雪莉

（青島市市級公園管理服務中心青島市海泊河公園，山東 青島 266000）

從已掌握的月季病蟲害種類的危害性角度來看，黑斑病對月季健康情況影響最嚴重，并且發病率很高，在我國多地月季種植區域均有出現[1-2]。2021年在青島市海泊河公園的月季綠化帶中發現多株月季患有黑斑病。為此，文章以該地區的患病月季植株為試驗對象，以分離純化的方式從形態與分子方面對黑斑病病原菌種類與生物學特性進行鑒定分析，以期為相關防控單位或科研人員提供幫助。

1 材料與方法

1.1 材料

患病植株選取。以青島市海泊河公園月季綠化帶下患黑斑病月季植株（整株）為研究材料，在試驗內截取患病葉片作為分離與對照材料。

試劑和培養基。測定試劑采用賽默飛公司的DL DNA Marker、博奧龍2×Taq PCR Mixture（含上樣染料）、Loading buffer，引物見表1 所示。

表1 試驗合成引物序列

試驗使用馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養基，配制方法如下。選取干凈且水煮后的馬鈴薯200 g（濾液）、葡萄糖與瓊脂各20 g，將瓊脂與馬鈴薯濾液充分攪拌，待瓊脂完全容積后向其中加入稱取好的葡萄糖，將冷卻后的蒸餾水（1 L）加入其中并將培養液的pH 值調節為7.0，最后將培育液包好放于滅菌鍋中滅菌，滅菌完成后取出冷卻備用。

1.2 方法

1.2.1 病原菌分離

月季葉片與黑斑病菌絲采用單孢分離法分離。首先，挑選整株月季患病植株中具有明顯黑斑病的患病葉片送至實驗室，在黑斑病斑點與葉片的交界處選取9 mm×9 mm 的組織塊，將其浸泡在濃度為75%的乙醇溶液中消毒，浸泡30 s 后取出，用無菌水漂洗，共漂洗3 次。其次，將其浸泡在濃度為2%的次氯酸鈉溶液中，浸泡時間為60 s，浸泡完成后再次用無菌水浸洗，共浸洗3 次。再次，將其放置在滅菌濾紙上轉移至無菌室晾干，晾干后將其移放至環境溫度為28 ℃恒溫環境下的PDA 培養基上進行培養。采用第三次清洗液制作涂布平板并將其作為陰性對照，培養4～5 d 后觀察黑斑病菌菌落生長狀況，取菌絲尖端孢子放置于新的PDA 培養基中進行培養（培養環境為28 ℃），不斷重復上述操作直到分離出純化菌株。

1.2.2 黑斑病病原菌的形態學鑒定

初步觀察純化菌株培養基下的菌落疏密程度和顏色等菌落特征，將其放置在光學顯微鏡下進行鏡檢，重點觀察對黑斑病病原菌菌絲和分生孢子的特征，例如分生孢子的形狀、大小、殘缺程度、孢子梗以及孢子有無隔膜等信息。

1.2.3 黑斑病病原菌的分子生物學鑒定

使用CTAB 法對月季黑斑病病原菌的DNA 進行提取，實際操作步驟如下。首先，需要在試驗開始前將2-丙醇（C3H8O）放置在-20 ℃環境下預冷，將濃度為70%的乙醇放置在4 ℃環境下進行恒溫處理，將試驗使用的水浴鍋加熱至57 ℃。用無菌槍頭刮取0.1 mL的純化黑斑病菌絲，并將其置于2 mL 的離心管中，將石英砂（20μL）和2%的CTAB 提取緩沖液（300 μL）加入裝有黑斑病菌絲的離心管中，使用研磨棒對其進行研磨直到所有物體研磨充分為止。向離心管中在此加入2%的CTAB 提取緩沖液（200 μL）并充分震蕩，將其放置在57 ℃的水浴鍋中恒溫加熱1 h 后使其自然冷卻至室溫，期間要注意每隔10 min 對離心管進行1 次顛倒混勻。其次，當水浴操作結束之后，需將等體積的500 μL 三氯甲烷（CHCl3）和C3H8O（比例為24∶1）溶液加入離心管中，將其放置在離心機中以10 000 r/min的速度離心10 min，在離心操作期間需要將濃度為10%的CTAB 提取緩沖液放置在65 ℃環境的水浴中加熱。取離心后上清液（300 μL）放置在新的離心管中，并將已加熱完成濃度為10%的CTAB 提取緩沖液（30 μL）加入新離心管中，振蕩混勻，之后再向其中加入比例為24∶1 的CHCl3與C3H8O的混合液（330 mL）。再次，將新的離心管放置在10 000 r/min 離心機中離心10 min。取離心后溶液的上清液（250 μL）放置在新的離心管，并向其中加入預冷好的C3H8O（250 μL）輕輕混勻，將其放置在-20 ℃環境下靜置30～60 min，將靜置完成的溶液再次放置在參數為12 000 r/min、溫度為4 ℃的離心機中離心10 min。最后，將離心完畢的溶液上清液緩慢剔除并倒置片刻，向離心管中加入提前預冷濃度為70%的乙醇洗滌（1 mL），放置在10 000 r/min的離心機中震蕩離心5 min。離心完成后除去上清液取剩余液體將其放置在工作臺上自然風干。制作PCR 反應體系（50 μL），其中主要成分包括3 μL 模板、1 μL上游引物、1 μL 下游引物，25 μL 博奧龍2×Taq PCR Mixture（含上樣染料）以及20 μL 去離子水。

PCR 反應程序參數設定：預變性環境溫度為94 ℃、時間為3 min；變性溫度為94 ℃、時間為30 s；退火溫度為55 ℃、時間為45 s，35 個循環；延伸溫度為72 ℃、時間為10 min。將擴增產物送至某生物工程研究所進行比對測序，使用BLAST 將得到的序列與DNA序列數據庫GenBank 上對其同源性進行比對，并將與月季黑斑病病原菌有關的同源序列下載到本地，以EF1-α、rDNA ITS 和GPD 序列為對象，以MEGA 進化樹V7.0.26 軟件為基礎，借助鄰位法構建系統發育樹[3-5]，如圖1 所示。

圖1 EF1-α、rDNA ITS 和GPD 聯合對比所構建的系統發育樹

1.2.4 致病性測定

對月季黑斑病的病原菌致病性測定將采用離體接種法進行驗證。首先，在接種前需要用無菌水沖洗健康的月季葉片，去除葉片表面的雜質，然后使用滅菌接種針對葉片進行破壞處理。其次，把放置在28 ℃環境下培養的病原菌通過打孔器制成半徑為2.5 mm 的菌餅，并將其接種到健康月季葉片的接種點處，使用無菌PDA 培養基作為對照。再次，把接種后的對照葉片放在鋪有濕潤脫脂棉的培養皿中，維持培養環境溫度處于24～25 ℃，保濕培養3～5 d，以12 d 為周期觀察其發病狀況。

1.2.5 病原菌生物學特性的測定

從溫度、pH 值以及光照等角度對月季黑斑病病原菌菌絲生長進行試驗，以平板測定法作為試驗驗證方法。將半徑為2.5 mm 的病菌菌餅接種到PDA 培養基的中央處，設計6 組培養溫度，分別為5 ℃、20 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃和50 ℃；將半徑為2.5 mm 的黑斑病菌餅接種到pH 值為4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0 和10.0的PDA 培養基中央處；將其分別置于全光照、光暗交替（交替時間為12 h）以及全黑暗等環境下，并將半徑為2.5 mm 的黑斑病菌餅接種在PDA 培養基的中央處。將上述處理完畢的培養基放進培養箱中進行培養，并定期測量其菌落半徑，所有處理重復3 次。

1.3 數據分析

通過IBMSPSS Statistics v 27.0.0.1 軟件對試驗數據進行統計與分析，運用鄧肯氏多重比較法對試驗數據進行差異顯著性分析[6]。

2 結果分析

2.1 發病癥狀

月季葉片是出現黑斑病的主要部位。在黑斑病的發病初期，月季葉片正面會出現一處或多處褐色小斑點，隨著時間變化，這些小斑點會逐漸擴大為近圓形的黑色斑點。在黑斑病的發病后期，月季葉片上黑斑病斑點會產生一些黑色顆粒，主要呈現零散或者輪狀排列，只有少部分種類的黑斑病斑點間相互連接。同時，黑斑病后期還會導致月季葉柄上產生一些暗褐色斑點，斑點略凸起，但斑點邊緣并無明顯黑斑病菌絲。此時若不對其進行治療，會造成月季葉片全部脫落或全部枯黃，嚴重時會間接導致月季植株死亡。

2.2 形態特征

從患有月季黑斑病的葉片病斑中獲得1 株黑斑病病原菌菌株，將其命名為A1。A1 在PDA 平板上生長2 d 后能夠明顯看出平板上出現零星的白色菌絲，繼續培養3 d 后，病原植株開始產生孢子，7 d 后黑斑病植株可以長滿整個平板，此時觀察黑斑病菌落表面可以發現，其菌落表面濕潤但不光滑，整體呈黑褐色，孢子沒有出現輪紋，如圖2、圖3 所示。通過光學顯微鏡可以看出，黑斑病病原菌的分生孢子梗呈現灰褐色且有隔膜。病菌孢子為棒狀和長卵形，每個孢子均具有4～9 個橫隔膜和2～5 個縱隔膜，最大分生孢子的長寬為18.5 μm×24.7 μm，最小分生孢子的長寬為3.6 μm×7.1 μm，如圖4 所示，初步斷定青島市海泊河公園月季感染的是鏈格孢類黑斑病。

圖2 培養2 d（正面）

圖3 培養7 d（背面）

圖4 光顯微鏡下病菌孢子形態

2.3 致病性鑒定

記錄以致病性測定設計試驗下觀察黑斑病菌株的發病時間與性狀。在新鮮葉片植入黑斑病菌餅后的3～5 d，其接種葉片上可以明顯看出存在黑褐色病斑，且人工移植的葉片上出現的病理癥狀與田間月季黑斑病癥狀十分相似，因此可認為其發病率能夠達到98%，而只在葉片中接入PDA 培養基圓片的對照組卻未出現黑斑病癥狀，如圖5～圖7 所示。從接種患病葉片中分離出黑斑病病菌，將其與自然環境下的黑斑病病菌的孢子形態與菌落形態進行對比，發現二者間的孢子形態與菌落形態完全一致，因此斷定青島市海泊河公園月季黑斑病是由鏈格孢病原菌侵染所致。

圖5 自然患病月季葉片

圖6 直接PDA培養基圓片葉片

圖7 人工刺傷接種黑斑病葉片

2.4 黑斑病致病菌的最適生長環境測定

圖8 為月季黑斑病菌絲在不同溫度、pH 值和光照條件下的生長數據。由圖中數據能夠得出，月季黑斑病植株的最適生長溫度為30 ℃，黑斑病病原在溫度20～35 ℃都可以正常生長，但不同溫度環境下黑斑病菌絲的生長性狀存在一定的差異。月季黑斑病植株的最適生長pH 值為6.0，pH 值為4.0～10.0 時黑斑病菌絲都能夠正常生長，但菌絲的生長性狀存在一定的差異。月季黑斑病植株的最適生長光照條件為全天光照，但在無光照時也可正常生長。

圖8 環境因素對黑斑病菌絲生長的影響

3 結束語

經試驗證實，青島市海泊河公園下的月季植株患黑斑病孢子類型為鏈格孢真菌。該真菌在溫度為30 ℃、pH 值為6.0 和全天光照下可以實現最佳生長。該黑斑病菌絲群初期呈現灰白色，后期逐漸變為黑褐色，分生孢子呈黑褐色棒狀或卵狀，具有橫縱隔膜。