茯磚茶中冠突散囊菌的分離鑒定及富硒菌株篩選

劉 程梁靜一美王周利袁亞宏岳田利

(1.西北農林科技大學食品科學與工程學院,陜西楊陵 712100;2.農業農村部農產品質量安全風險評估實驗室(楊凌),陜西楊陵 712100;3.西北大學食品科學與工程學院,西安 710069)

茯磚茶屬于六大茶類中的黑茶,它生產工藝復雜、品質獨特[1],具有調節腸道菌群、降低血脂、抗氧化、消炎等功效[2]。冠突散囊菌(Eurotium cristatum)是茯磚茶在一定的溫度、濕度條件下,通過“發花”過程生長得到的益生菌體[3],也被稱為“金花菌”[4]。1990年,齊祖同等[5]對湖南茯磚茶中的“金花菌”進行分離培養,觀察到菌體表面具有冠狀突起,將其定義為冠突散囊菌。陳云蘭[6]將形態學鑒定與酯酶同工酶電泳相結合,分離鑒定多地茯磚茶中的“金花菌”,結果顯示它是由冠突散囊菌和謝瓦氏曲霉菌組成。由于散囊菌屬真菌存在很高的同源性,目前普遍接受的分類為真菌門、子囊菌綱、真子囊菌亞綱、曲霉目、曲霉科、散子囊菌屬、冠突散囊菌,無性型為針刺曲霉[7]。

硒(Selenium)是哺乳動物必需的微量營養素,在自然界以有機和無機形式存在[8]。無機硒包括單質硒、亞硒酸鹽和硒酸鹽等,具有較大的毒性。有機硒包括硒代氨基酸、硒蛋白、硒多糖等,研究已經證實,有機硒的毒性低且生物利用度高[9-10]。硒在生物體的能量代謝和基因表達中起著重要的作用[11],具有抗氧化、保護心血管、預防癌癥等功能[12-13],而硒攝入不足可能會引發克山病、甲狀腺腫等疾病。世界衛生組織已確定飲食中硒的最佳攝入量為50μg/d,開發低毒性和高生物利用度的硒補充劑尤為重要[14-16]。酵母、細菌、真菌等可以通過自身生理代謝實現無機硒到有機硒的轉化[17],微生物富硒能力的大小可以通過生物量、硒形態等多種指標判定[18]。利用生物對無機硒進行轉化,是生產有機硒補充劑的一種安全有效的方法,已成為當前重要的研究方向[19]。

本研究從陜西茯磚茶中分離冠突散囊菌,并利用形態學與分子生物學對其進行鑒定,根據微生物的富硒特性對冠突散囊菌富硒菌株進行篩選,并對菌體硒形態進行分析,旨在為冠突散囊菌的利用及硒補充劑的開發提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

經典1368茯茶(1 000 g)、手筑茯磚茶(1 000 g)、貢金茯茶(200 g)、貢福尊品(200 g)、茯茶柱(200 g)、吼秦腔(200 g),購于咸陽涇渭茯茶有限公司;涇茯源花開月圓涇渭茯磚茶(1 000 g),購于陜西涇陽百富茯磚茶有限公司;涇陽茯茶1368(450 g),購于陜西古渡茯磚茶有限公司。所購茯磚茶均金花茂盛、品質優良者。

1.2 主要試劑

葡萄糖、瓊脂、硝酸、高氯酸、鹽酸、過氧化氫、氫氧化鈉、戊二醛、磷酸銨、亞硒酸鈉等,購自西安化學試劑廠,均為分析純。植物基因組DNA 提取試劑盒,購自天根生化科技(北京)有限公司。蛋白酶XIV、脂肪酶VII,購自美國Sigma-Aldrich公司。硒代蛋氨酸(Se Met)、硒代胱氨酸(SeCys2)、甲基硒代半胱氨酸(MeSeCys)、硒酸根(Se(IV))、亞硒酸根(Se(VI)),購自中國計量科學研究院。

1.3 主要儀器與設備

超凈工作臺(YT-CJ-2ND),北京亞泰科隆儀器技術有限公司;恒溫培養箱(ZXSD-A1160),上海智誠分析儀器制造有限公司;恒溫培養振蕩器(ZWY-240),上海智城分析儀器制造有限公司;高速冷凍離心機(HC-3018R),安徽中科中佳科學儀器有限公司;光學顯微鏡(Ni-U),日本尼康株式會社;掃描電子顯微鏡(S-3400N),日本株式會社日立制作所;PCR 儀(CFX CONNCT),美國Bio-Rad公司;電泳儀(JY600C),北京市六一儀器廠;凝膠成像儀(Gel Doc XR+),美國Bio-Rad公司;氫化物發生—原子熒光光譜儀(AFS-9300),江蘇艾塔科學儀器有限公司;液相色譜儀(ICS-600),賽默飛世爾科技公司;電感耦合等離子體質譜儀(NexION 2000),珀金埃爾默儀器有限公司。

1.4 試驗方法

1.4.1 培養基制備 馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養基:取去皮馬鈴薯200 g,切片后置于1 000 m L蒸餾水中煮沸20 min,過濾后加入葡萄糖20 g、瓊脂20 g并再次煮沸,加蒸餾水定容至1 000 m L,121 ℃滅菌20 min。馬鈴薯葡萄糖(PDB)培養基:除不加入瓊脂外,其他步驟與PDA 培養基制備方法相同。

1.4.2 冠突散囊菌的分離純化 稱取茯磚茶樣品25 g,粉碎后混懸于225 m L 無菌生理鹽水(0.85%),在28 ℃恒溫水浴箱中以200 r/min振蕩40 min,洗脫茶葉上附著的菌體[20]。將去除茶葉的洗脫液進行梯度稀釋,取10-3、10-4、10-5、10-6梯度稀釋液涂布PDA 培養基。置于28 ℃恒溫培養箱中避光培養,適時對長勢良好的菌落進行劃線分離,將得到的純化菌株接種至PDA斜面培養基于4 ℃保存。

1.4.3 形態學特征觀察 將純化菌株接種于PDA 培養基,于28 ℃恒溫避光培養21 d,觀察菌落的生長狀況并根據《中國真菌志》對其種屬進行初步判斷[21]。培養5～7 d時通過顯微鏡與掃描電鏡進行形態學觀察。

顯微鏡觀察:通過直接制片與形態觀察相結合的方式進行光學顯微鏡觀察[22]。制備PDA 平板培養基時,以45°斜插入4片無菌蓋玻片,接種后置于28℃的恒溫培養箱中培養,待菌絲延伸至蓋玻片上時,用鑷子將蓋玻片夾出,蓋到滴有一滴無菌水的載玻片上,在顯微鏡下觀察。

掃描電鏡觀察:純化菌株在PDA 培養基上生長7 d,用無菌刀片切取5 mm×5 mm 且長有菌落的培養基薄片,置于2.5%戊二醛常溫浸漬過夜。用0.1 mol/L PBS緩沖液(p H 7.2)浸洗3次,每次10 min。然后用30%、50%、70%、80%、90%、100%乙醇逐級脫水,每級脫水2 次,每次10 min[23]。脫水后的樣品通過超臨界CO2真空干燥,噴金后通過掃描電鏡觀察。

1.4.4 分子生物學鑒定 收集PDA 培養基上純化菌落的菌絲體,經液氮研磨后利用植物基因組DNA 提取試劑盒提取DNA。采用真菌核糖體基因通用引物ITS1(5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3')和ITS4(5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3')進行PCR 擴增[18]。PCR 擴增反應體系:上游、下游引物各1μL(5.65 nmo L,稀釋100倍),模板DNA 2μL,premixTaq10μL,加dd H2O 至20μL。擴增條件:95℃預變性5 min,95℃變性30 s,55℃退火30 s,72℃延伸1 min,34次循環,72 ℃延伸10 min[24]。PCR 擴增產物通過凝膠電泳進行檢測,將條帶單一且明亮的PCR 擴增產物送至上海生物工程股份有限公司進行測序。將測序結果提交至NCBI數據庫,通過核酸BLAST 進行比對,對測序菌株進行屬種歸類,篩選出冠突散囊菌。

1.4.5 孢子懸浮液制備 冠突散囊菌于PDA培養基活化3次,在28 ℃下恒溫培養5～7 d,用無菌生理鹽水將孢子洗脫至無菌離心管中,通過血球計數板調整孢子濃度為107cfu/m L 并于4 ℃保存。

1.4.6 生長特性研究 以1%的接種量將孢子懸浮液接種于PDB 培養基中,于28 ℃、130 r/min振蕩培養10 d。每隔12 h取出3瓶培養液并收集菌絲體,于65 ℃烘干至恒質量,即為菌體生物量[25]。繪制菌體生物量關于培養時間的曲線,即為冠突散囊菌在該條件下的生長曲線。

1.4.7 耐硒菌株篩選 不同菌株對無機硒的耐受能力不同,在環境硒質量濃度相同的情況下,根據菌體紅硒現象出現的程度,篩選耐硒能力強的菌株。配制硒質量濃度為0、30、60、90、120 μg/m L的PDA 培養基,分別取32株冠突散囊菌孢子懸液100μL涂布于平板,每個質量濃度設置3個平行,于28 ℃下避光培養9 d,每天觀察菌落生長狀況,篩選耐硒性能優良的菌株。

1.4.8 富硒菌株篩選 配制硒質量濃度為30 μg/m L的PDB培養基,以1%的接種量分別接種初篩得到的耐硒菌株的孢子懸液,于28 ℃、130 r/min振蕩培養7 d。加硒組和對照組均設置3個平行。通過測定菌體生物量、總硒含量篩選富硒能力強的菌株。

1.4.9 菌體生物量的測定 將培養7 d的冠突散囊菌培養液轉移至離心管中,在8 000 r/min離心10 min,棄去上清液,向沉淀中加入30 m L無菌水,震蕩清洗后再次離心,重復清洗3次。將菌體沉淀轉移至10 m L無菌離心管中,冷凍干燥24 h,稱重得菌體生物量[26]。

1.4.10 菌體總硒含量的測定 通過氫化物發生原子熒光光譜法(HG-AFS)測定總硒含量[27]。

樣品消化:稱取冠突散囊菌凍干菌體0.500 g于250 m L 錐形瓶中,依次加入9 m L 硝酸和1 m L高氯酸并充分混合。將錐形瓶置于200 ℃加熱板加熱,至混合物變為澄清透明并有白煙出現。待混合物冷卻后加入5 m L鹽酸(6 mol/L),混勻后繼續加熱,直到混合物再次澄清透明。冷卻后轉移至10 m L容量瓶中用蒸餾水定容。

標準曲線繪制:分別配制硒質量濃度為0、10、20、30、40、50μg/L 的硒標準溶液,充分混勻后測定其熒光強度。以硒質量濃度為橫坐標,熒光強度為縱坐標,繪制標準曲線。

硒含量測定及計算:硒含量通過氫化物原子熒光儀測定,運行條件如表1所示。對樣品和空白溶液進行測定,與標準系列溶液比較定量,每個樣品平行測定3次。硒含量按照以下公式計算:

表1 HG-AFS運行參數Table 1 Operating conditions of HG-AFS

其中,x為硒含量(μg/g);ρ為樣品溶液中硒的質量濃度(mg/m L);ρ0為空白溶液中硒的質量濃度(mg/m L);V為消化液總體積(m L);m為樣品的質量(g);1 000為換算系數。

1.4.11 菌體硒形態的測定 菌體硒形態的提取:稱取0.200 g冠突散囊菌凍干菌體粉末于離心管中,加入20 mg蛋白酶XIV、20 mg脂肪酶VII、6 m L無菌超純水。將混合物置于磁力攪拌器上,以400 r/min速度在37 ℃避光孵育36 h。在8 000 r/min 離心5 min,收集上清液并通過0.45μm 無菌濾膜過濾,測定前置于-20 ℃保存。

LC-ICP/MS測定硒形態:通過液相色譜—電感耦合等離子體質譜(LC-ICP/MS)測定菌體硒形態及其含量。LC 系統使用PRP-X100陰離子交換柱(250 mm×4.1 mm×10μm)對硒形態進行分離。流動相為40 mmol/L磷酸銨(p H 6.0),流速為1.0 m L/min,進樣量為50μL,運行時間為25 min。ICP-MS系統用于硒形態的分析和定量,選擇78Se 和82Se 作為監測同位素。ICP-MS的運行條件如表2 所示。硒形態鑒定標準物質為:Se Met、SeCys2、MeSeCys、Se(IV)、Se(VI),分別配制質量濃度為0、20、40、60、80、100μg/m L的標準物質系列溶液。通過LC-ICP/MS對標準系列溶液進行測定,確定各硒標準物質保留時間,并繪制標準工作曲線。

表2 ICP-MS運行參數Table 2 Operating conditions of ICP-MS

2 結果與分析

2.1 菌落形態特征

如圖1所示,生長4 d的菌落(圖1-a,1-f)直徑約15～20 mm,可觀察到黃白色菌絲和黃色閉囊殼。菌落生長7 d(圖1-b,1-g)時,直徑達30～35 mm,整體呈較規則圓形,中心部位稍厚且有小突起;顏色由邊緣的淺黃色逐漸加深至中心的淺褐色。菌落生長10 d(圖1-c,1-h)時,直徑達到40～45 mm,菌落上布滿黃色閉囊殼,部分黃色菌絲已衰老,變為褐色;菌落中心已近橄欖褐色,且有透明黃色液滴滲出。菌落生長14 d(圖1-d,1-i)時為直徑50～55 mm 的較規則圓形;此時菌落已老化,產生大量閉囊殼;菌落邊緣變成鐵銹色,培養基被色素染為褐色。菌落生長21 d(圖1-e,1-j)時,直徑達到65～70 mm,菌落幾乎變成深橄欖色,反面呈黑褐色,菌落中心滲出黑色濃稠的液滴。

圖1 冠突散囊菌在PDA平板培養基生長狀況Fig.1 Growth status of Eurotium cristatum on PDA plate medium

菌落顏色隨著培養時間延長而逐漸加深,因為在菌落生長過程中,其形態結構和色素分泌出現于不同階段。淺色菌絲和少量黃色閉囊殼產生于培養初期,使菌落呈淡黃色;大量黃色閉囊殼產生于中期,使菌落呈黃色;黑褐色色素分泌于后期,且此時菌落開始老化,菌落顏色進一步加深而呈褐色。

2.2 菌體顯微特征

在顯微鏡下對冠突散囊菌進行觀察,可看到冠突散囊菌存在有性生殖(子囊孢子)和無性生殖(分生孢子)兩種生殖方式。如圖2所示,視野內可觀察到具有不對稱分枝的菌絲(圖2-a),以及大量球形或近球形的子囊果(黃色閉囊殼)。子囊果成熟后發生無規則破裂釋放出包含子囊孢子的子囊(圖2-b,2-c)。培養中后期可觀察到分生孢子結構(圖2-d),未成熟分生孢子呈球形,孢子梗較光滑,具有燒瓶形或球形的頂囊。分生孢子從頂端以出芽的形式發育至成熟,并串生在孢子梗頂部。

圖2 冠突散囊菌顯微形態特征Fig.2 Microscopic morphological characteristics of Eurotium cristatum

2.3 菌體掃描電鏡特征

如圖3所示,掃描電鏡下可以觀察到冠突散囊菌茂盛的菌絲(圖3-a),菌絲為具有分枝的管狀,中間有隔膜。子囊果纏繞在菌絲中(圖3-b),直徑為70～100μm,含有大量子囊。子囊為橢球形或近球形,直徑為10～25μm,包裹著8個子囊孢子。子囊孢子為(3～5)μm×(5～8)μm,呈雙凸鏡形,“赤道”部分繞有兩圈縱向的“冠狀”凸起(圖3-c)。“冠狀”凸起為冠突散囊菌的特征結構,是判斷其屬種的重要依據。分生孢子頭成熟后呈較疏松的掃帚狀(圖3-d),分生孢子為(3.0～4.0)μm×(4.0～5.0)μm,大部分為橢球形,外壁粗糙且生有小刺。無性孢子形成結構被認為是曲霉家族的獨特特征[28]。

圖3 冠突散囊菌掃描電鏡形態Fig.3 Scanning electron microscopy morphological characteristics of Eurotium cristatum

2.4 分子生物學鑒定結果

從茯磚茶中共分離、純化得到54株菌株,部分優勢菌株的ITS序列PCR 擴增產物的電泳分析如圖4所示,2至15號泳道條帶所對應的基因片段長度約為500～750 bp,且呈現單一明亮狀態,表明所對應DNA 純度高。將測得的基因序列在NCBI數據庫進行同源序列比對,以ITS序列同源性＞99%為標準進行屬種歸類。54株菌株序列比對結果如表3所示,SXFCA.1、SXFCB.7等32株菌與模式冠突散囊菌的相似度達到99%以上,其中SXFCC.12、SXFCF.23、SXFCF.25、SXFCH.32達到100%,表明這32株菌與冠突散囊菌有很高的同源性。結合形態學的鑒定結果,可將32株菌株判定為冠突散囊菌。

表3 茯磚茶分離菌株的測序結果Table 3 Sequencing results of strains isolated from Fucha tea

圖4 茯磚茶部分優勢菌株的ITS序列PCR 擴增產物凝膠電泳圖像Fig.4 Gel electrophoresis images of PCR amplification products of ITSsequences of dominant strains from Fucha tea

2.5 冠突散囊菌生長特性曲線

通過液體培養繪制的冠突散囊菌生長曲線如圖5所示。冠突散囊菌短時間內便適應了生長環境,培養24 h時生物量開始增加。由于培養基為冠突散囊菌的生長提供充足的營養物質,極大地促進了菌體生長[25]。在培養前132 h,菌絲體生物量呈穩定增加趨勢,在培養132 h～156 h 階段,菌絲體生長速率出現大幅提升,菌絲體生物量在156 h時達到最大值184.33 mg/100 m L,說明此時冠突散囊菌處于生長對數期且活力最旺盛。此后,菌絲體生物量出現緩慢下降并逐漸平穩的趨勢,這是因為菌絲體的持續生長繁殖使培養基體系內菌體相對密度增加,導致菌體生長空間變小,也可能是由于長時間半封閉培養使菌絲體發生輕微自溶[29]。

圖5 冠突散囊菌生長特性曲線Fig.5 Growth characteristic curve of Eurotium cristatum

2.6 耐硒菌株篩選結果

當微生物生長環境中的無機硒濃度較高時,它不僅會在胞內轉化成有機硒,而且有一部分會被還原成單質硒[30],使菌體在外觀上呈紅色。32株冠突散囊菌在含硒培養基上生長情況如表4所示。在硒質量濃度為30μg/m L 時,菌落數量多且直徑大,與正常生長的菌落相比顏色沒有明顯變化,且菌落在此濃度下生長最快。為了提高有機硒的轉化率,減少單質硒的累積[31],選擇冠突散囊菌生長的適宜硒質量濃度為30μg/m L。當硒質量濃度為60μg/m L時,菌落顏色明顯變紅,說明硒單質在細胞內的累積增多[18]。當硒質量濃度達到120μg/m L時,大部分菌株已停止生長或長出零星的紅色或橙紅色菌落。部分菌株可以生長出顏色較淺的菌落,分別為菌株SXFCB.7、SXFCC.1、SXFCC.8、SXFCC.10、SXFCD.7、SXFCD.8、SXFCE.7、SXFCG.3,表明這8株菌有很強的耐硒性能,可進一步探究它們的富硒能力。

2.7 富硒菌株篩選結果

PDB培養篩選富硒菌株結果如圖6所示,不同菌株受硒的影響有明顯差別。菌株SXFCC.1與SXFCD.8 的生物量分別為(27.48±1.31)mg/100 m L和(28.92±0.94)mg/100 m L,均超過25 mg/100 m L,說明這兩株菌在硒環境中能保持較好的活力,硒對其生長產生的抑制作用小。SXFCC.8和SXFCD.8富硒量分別為(604.98±16.93)μg/g和(628.38±20.96)μg/g,說明這兩株菌的富硒能力很強,對硒的利用和轉化率高,但是菌株SXFCC.8的生物量較低,說明硒對其生長的抑制作用較強。綜合考量得出菌株SXFCD.8能夠在保持較高生物量的基礎上實現最大的富硒量,是一株富硒能力較強的優勢菌株。

圖6 8株富硒冠突散囊菌生物量及總硒含量Fig.6 Biomass and total selenium content of 8 selenium-enriched Eurotium cristatum

為進一步探究菌株SXFCD.8的有機硒轉化能力,通過LC-ICP/MS 對其菌體硒形態進行測定。如圖7-b所示,菌株SXFCD.8硒形態色譜圖中共檢出6個清晰的峰,代表至少存在6種硒形態。通過與硒標準物質保留時間(圖7-a)比對可知,峰1為SeCys2,峰2 為MeSeCys,峰4 為Se(IV),峰5為Se Met。根據硒標準物質曲線計算出的硒形態濃度如表5所示。濃度最高的硒形態為Se Met,達到(338.03±3.78)μg/g,占總硒含量的53.79%。其次為SeCys2,含量為(183.30±2.43)μg/g,占總硒含量的29.17%。MeSeCys是含量最低的有機硒形態,為(17.58±3.24)μg/g,僅占總硒含量的2.80%。作為原始硒源的Se(IV),在菌體內的含量為(44.07±0.84)μg/g,僅占總硒含量的7.01%。Se(VI)未在菌體中檢測到。硒形態測定結果表明,菌株SXFCD.8能夠將環境中的無機硒吸收并轉化為有機硒,且主要以硒代氨基酸形式存在,進一步說明冠突散囊菌具有作為有機硒來源的巨大潛力。

表5 冠突散囊菌中硒形態及總硒含量(±s)Table 5 Se species contents and TSC of proteins isolated from Eurotium cristatum

表5 冠突散囊菌中硒形態及總硒含量(±s)Table 5 Se species contents and TSC of proteins isolated from Eurotium cristatum

注:ND.未檢出。Note:ND.Not detected.

硒形態Selenium species項目Item 硒代胱氨酸SeCyS2甲基硒代半胱氨酸MeSeCyS硒代蛋氨酸Se Met硒(Ⅳ)Se(Ⅳ)硒(Ⅵ)Se(Ⅵ)有機硒Organic selenium總硒Total selenium含量/(μg/g)Content 183.30±2.43 17.58±3.24 338.03±3.78 44.07±0.84 ND 538.91±4.59 628.38±7.96占總硒比例/%Percentage of total selenium 29.17 2.80 53.79 7.01 0 85.76

圖7 硒標準物質(a)和冠突散囊菌硒形態(b)的LC-ICP/MS色譜圖Fig.7 LC-ICP/MS chromatogram of(a)selenium standards and(b)selenium species of Eurotium cristatum

3 討論

對冠突散囊菌的命名和分類的研究自其被發現就開始了,早期的研究多以形態學鑒定為主,溫瓊英[32]通過掃描電鏡觀察到“金花菌”菌體表面具有冠狀突起,其子囊孢子表面比較粗糙而分生孢子具有小刺,與齊祖同[5]的研究結果相符。雖然形態學觀察在菌株鑒定中起到重要作用,但是由于菌落形態具有不穩定性,因而需要采用多種鑒定手段以確證鑒定結果。本研究將傳統的形態學觀察與分子生物學鑒定相結合,從陜西茯磚茶中鑒定出32株冠突散囊菌。從測序結果可以看到每個菌株在ITS保守區域中有各自的堿基變化,表明冠突散囊菌中存在遺傳多樣性[33]。從茯磚茶中分離的菌株除了冠突散囊菌外,其他菌株分別與阿姆斯特丹散囊菌、謝瓦散囊菌、赤散囊菌等有較高的相似性,說明茯磚茶中的“金花菌”是一個菌種組成復雜的體系。胡治遠等[34]鑒定了湖南地區茯磚茶中的“金花菌”,結果表明“金花菌”包括冠突散囊菌、謝瓦散囊菌、蠟葉散囊菌等多種散囊菌。盡管ITS 區域可用于散囊菌的分類鑒定,但在反映種間的遺傳多樣性方面仍有欠缺。如果要得到種水平的相關信息,則應利用分辨能力更高、更精準的基因進行鑒定,或進行基因系統發育分析[35]。

目前,關于冠突散囊菌功能和應用的研究較少,至于其富硒能力的研究更是鮮有報道,本研究關于陜西茯磚茶中的冠突散囊菌富硒菌株的報道為首次。在菌株篩選過程中發現,硒對所有菌株的生長都造成不同程度的影響,且質量濃度越高對菌體生長抑制越明顯。另外,不同冠突散囊菌在含硒PDA 培養基上的菌落生長情況有顯著差異,如在大部分菌株可以耐受的30μg/m L 的硒環境中,菌株SXFCA.6和SXFCA.8幾乎沒有菌落產生,而在硒質量濃度高達120μg/m L的環境中,菌株SXFCC.1、SXFCD.8等仍可以產生大量菌落,且紅硒現象并不嚴重,這說明不同菌株對硒的耐受和轉化能力存在差異性。目前關于微生物硒轉化的機理并未明確,對富硒酵母富硒機理的研究表明[36],菌株富硒能力的差異可能與其自身的代謝系統有關,因為該系統對硒和硫元素的識別能力在微生物富硒過程中起決定性作用。也有研究表明由于不同微生物含有的酶類不同,氧化還原反應的胞內環境也不盡相同,從而影響了富硒能力[37]。

對菌株SXFCD.8 硒形態的研究表明,冠突散囊菌具有轉化有機硒的能力。在其轉化得到的有機硒中,Se Met的含量最高,這與之前的報道相一致,表明Se Met是富硒微生物中有機硒的主要種類[27,38],這也被認為是富硒微生物“有機”的標志[39]。SeCys2 占冠突散囊菌總硒含量的29.17%,而在富硒酵母中約為10%～15%[40],這一差異可能與蛋白質中Met、Cys2和Cys的比例有關[41]。3種有機硒的總含量達到92.44%,表明冠突散囊菌中的硒物質具有較高的生物利用度,更易于被生物吸收[42]。值得注意的是,所鑒定的4種硒形態總含量為(582.99±2.78)μg/g,低于HG-AFS檢測到的總硒含量,這可能是由于冠突散囊菌酶解不足所致[43]。除了這4種可以通過標準物質確定的硒形態外,在圖7-b中還觀察到兩個未確定的峰。在沒有標準物質的情況下,可以利用ESI-Orbitrap MS進行鑒定。硒氨基酸的多樣性是微生物具有強大富硒能力的重要基礎,對冠突散囊菌硒形態的分析表明,冠突散囊菌具有較強的有機硒轉化能力,有望被開發為一種有機硒補充劑。

4 結論

本研究通過形態學和分子生物學手段相結合的方式,從陜西茯磚茶中分離并鑒定到32株冠突散囊菌,并通過硒脅迫篩選得到8株耐硒菌株,其中菌株SXFCD.8在硒質量濃度為30μg/m L 的培養環境下,生物量為(28.92±0.94)mg/100 m L,富硒量達到(628.38±20.96)μg/g,是具有較強富硒能力的優勢菌株。通過LC-ICP/MS在SXFCD.8菌體內共檢測到6種硒形態,其中Se-Met、SeCys2、MeSeCys、Se(IV)與標準物質相匹配,說明冠突散囊菌具有較強的有機硒轉化能力。

本研究首次報道了陜西茯磚茶中冠突散囊菌富硒菌株,豐富了富硒微生物的種類,為微生物硒補充劑的研究提供了參考,并對硒缺乏現象的改善具有重要意義。