兩種國蘭MADS-box家族B類基因PI/GLO的克隆與時空表達特性分析

田云芳盧 超徐艷花劉宇邈陳景鮮張耀廣鄭鈞屏楊玉珍

(1.鄭州師范學院生命科學學院,鄭州 450044;2.鄭州市觀賞藥用特色資源植物重點實驗室,鄭州 450044)

典型被子植物的花由不同的組織(萼片、花瓣、雄蕊和心皮)徑向對稱的同心輪組成。參照ABCDE花發育模型(圖1),B 類擬南芥(Arabidopsis thaliana)MADS-box 基因APETALA3(AP3)、PI決定和控制花瓣和雄蕊的生長發育[1-2]。B功能基因突變致花瓣向萼片轉變、雄蕊向心皮轉變。目前,B 類花發育基因PI/GLO已從多種植物中克隆,如擬南芥[3-4]、葡萄[5]、萬壽菊[6]、煙草[7]、向日葵[8]、紅花玉蘭[9-10]等。國蘭花器官尤其花瓣是重要的觀賞部位,但其B 類花發育基因研究相對較少。

圖1 擬南芥ABCDE花發育模型[20]Fig.1 ABCDE flower development model of Arabidopsis thaliana[20]

傳統意義上,B 類基因AP3和PI在擬南芥花器官第二、三輪發育中表達,在非花組織中不表達[11]。然而,擬南芥中B類功能基因表達界限不夠明晰,PI不完全限于花的第二、三輪中表達,PI也表達于第四輪早期[4]。葡萄PI基因表達豐度較高的部位是花序,葉、根較低,雄蕊、花瓣中也有特異表達[5]。Dezar等[8]采用Northern 和原位雜交獲得向日葵不育花中Ha PI優先表達,而花瓣和可育花雄蕊中弱微表達。Yao等[12]將轉座子插入蘋果Md PI基因的突變體Rae Ime中,花瓣替換為萼片,雄蕊替換為心皮,最終單性結實。Sreekantan等[13]將葡萄Vv PI基因轉化擬南芥致花瓣重瓣、雄蕊缺失。萬壽菊PI主要于花瓣、雄蕊中表達,萼片中低表達,轉基因植株花瓣、雄蕊和雌蕊明顯變短,TePI過表達影響花器官發育[6]。劉彩霞等[14]將擬南芥At PI轉化煙草,雄蕊變短,果實畸形,花冠變小,子房基部變長,At-PI基因調控雄蕊和花瓣的發育。Singh等[15]發現罌粟突變體Paps PI-1 進行煙草異位表達,花瓣萼片狀。異位表達Md PI的轉基因蘋果果實變得扁平[16]。因此,不同物種PI基因的作用有所區別。

PI還可抑制AP1轉錄而調控花發育。Sundstr?m 等[17]通過染色質免疫沉淀,發現PI蛋白可以直接與AP1基因的啟動子相結合。AG基因的激活也需AP3和PI的調控。Wuest等[18]發現在擬南芥雄蕊中,AP3表達水平的維持除需要PI蛋白外,還需要AG轉錄表達。AP3和PI的起始轉錄是由AP1、LFY、UNUSUALFLORAL ORGANS(UFO)等花分生組織基因誘導的[19]。

本研究以兩種國蘭(蕙蘭和墨蘭)為試驗材料,對PI/GLO基因的同源克隆與分析鑒定,利用實時熒光定量對不同時期的組織器官該基因的相對表達水平進行分析,揭示兩種國蘭PI基因在花發育的保守性和差異性,為國蘭的分子育種奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

材料為兩種3 a及以上地生蘭:蕙蘭(Cymbidium faberi)、墨蘭(Cymbidium sinense),采自鄭州師范學院蘭花工程中心智能溫室,分別選取:成苗期(沒有花葶抽出)的根和葉;花蕾期(花葶抽出,有花蕾,無開花)的根、葉、花葶和花蕾;盛花期(花葶上大部分花蕾展開)的根、葉、花(將花剝離為萼片、花瓣、唇瓣、合蕊柱、子房)和花葶。每份材料至少3個重復。所有材料用鋒利刀片切取后迅速用液氮速凍,并置于-80℃冰箱,備用。

1.2 試劑和儀器

主要試劑:RNAprep pure植物總RNA 提取試劑盒、SYBR Premix Ex Taq TM II、M-MLV 反轉錄試劑盒均購自大連寶生物工程有限公司;主要儀器:瓊脂糖凝膠電泳儀(P25T,德國Biometra),微量紫外分光光度計(Q5000,美國Quawell),實時熒光定量PCR 儀(realplex2,德國Eppendorf)。

1.3 總RNA 的提取及cDNA 第一鏈的合成

按照RNAprep pure試劑盒的方法提取兩種國蘭器官和組織的總RNA,分別吸取不同材料的RNA 1.0μL,于1.0%瓊脂糖凝膠上電泳檢測其完整性,利用Quawell Q5000 微量紫外分光光度計檢測RNA 濃度、質量,以蕙蘭和墨蘭的花蕾總RNA 為模板,用M-MLV 反轉錄酶完成RNA 的反轉錄。

1.4 PI 基因克隆及生物信息學分析

根據GenBank 建蘭(JQ326259.1)、春蘭(HM106984.1)、石斛(DQ017701.1)、文心蘭(HM140842.1)等的PI基因序列,選擇比較保守的區段,根據引物設計原則設計1 對引物PI-F,PI-R(表1)用于蕙蘭和墨蘭PI基因的克隆。以蕙蘭和墨蘭花蕾總RNA 反轉錄后的cDNA 為模板進行RT-PCR,Tm 為51.9 ℃,預期目的條帶獲得后切膠回收,再進行TA 克隆,測序分析。將正確的PI基因序列在NCBI(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)上通過blastn檢索,并與其他物種PI核苷酸序列比對;通過blastp比對所編碼蛋白獲得其保守結構域及功能域。

1.5 PI 基因時空表達分析

依據得到的PI核苷酸序列設計特異熒光定量引物進行RT-qPCR 試驗。參照SYBR Premix ExTaqTMII使用說明,用RT-qPCR 的方法檢測PI基因在蕙蘭和墨蘭不同發育階段不同部位的相對表達豐度,蕙蘭PI基因的表達檢測的內參基因為ACT、UBQ3,EF1α、ACT為墨蘭的內參基因。每個樣品3個重復,Tm 為58 ℃,利用蒸餾水為陰性對照,反應體系20μL,程序為:95 ℃預變性30 s,95 ℃變性15 s,58 ℃退火15 s,72 ℃延伸30 s,變性、退火、延伸為一個循環單位,共40個循環。表達相對豐度計算方法為:Rel.Exp=2-ΔΔCt。RT-qPCR 反應中使用引物及參數見表1。

表1 擴增PI/GLO 基因cDNA序列所用的引物及引物之間在各擴增反應中的組合Table 1 PCR primers for amplification of cDNA sequence of PI/GLO gene and combination of primers

2 結果與分析

2.1 PI 基因cDNA 序列克隆

分別以蕙蘭、墨蘭的花蕾cDNA 為模板,結合PI-F、PI-R 簡并引物(表1)擴增PI/GLO保守序列,得到兩條長度約為400 bp的目的條帶(圖2),與預期結果一致,測序后長度均為398 bp。將其核苷酸序列在NCBI上Blast分析,發現蕙蘭CfPI1和墨蘭CsPI1均與建蘭(JQ326259.1)PI基因有99% 的一致性;CfPI1基因與石斛蘭(EU444028.1)、球花石斛(DQ017701.1)、細莖石斛(EU056326.2)、萼脊蘭(KM975642.1)的同源性為95%、94%、94%、93%;CsPI1基因與上述基因序列的同源性分別為95%、95%、94%、93%。提交GenBank,登錄號為 MW654194,MW654193。

圖2 兩種國蘭PI 基因PCR 擴增產物Fig.2 PCR amplification products of two Chinese orchids PI genes

2.2 PI 基因編碼的蛋白序列分析

通過NCBI網站比對,兩個PI/GLO均為MIKC 型MADS-box 基因,均有保守的MADS區和相對保守的K 區(圖3 和圖4),且與春蘭(AD158461.1)同源性較高,分別為98%、99%。CfPI1和CsPI1與細莖石斛(XP_020679601.1)同源性為95%、97%,文心蘭(ACD85113.1)95%、96%,球花石斛(AAY86363.1)95%、96%,萼脊蘭(AJG41730.1)93%、95%,蝴蝶蘭(AAV28490.1)92%、93%。

圖3 CfPI1 基因核苷酸序列和推測的氨基酸序列及蛋白保守域Fig.3 Nucleotide acid sequence and deduced amino sequence of CfPI1 gene and conservative protein domain structure

圖4 CsPI1 基因核苷酸序列和推測的氨基酸序列及蛋白保守域Fig.4 Nucleotide acid sequence and deduced amino sequence of CsPI1 gene and conservative protein domain structure

2.3 CfPI1 在蕙蘭各組織器官中的表達

CfPI1在蕙蘭各組織器官中的相對表達豐度順次為花萼＞花瓣＞唇瓣＞花蕾＞子房＞盛花期花葶＞合蕊柱(圖5),除了盛花期花葶外在生殖器官中均表達,而在苗期的根和葉、花蕾期的根、葉和花葶、盛花期葉中幾乎未檢測到,即除盛花期花葶外CfPI1在蕙蘭營養器官中不表達。就蕙蘭的3個生長時期來說,表達豐度順次為營養生長期＜花蕾期＜盛花期。對于蕙蘭花器官來說,CfPI1在花器官組織中自外而內表達水平逐漸降低。

圖5 CfPI1 在蕙蘭各組織器官中的表達Fig.5 Expression of CfPI1 in tissues of Cymbidium faberi

2.4 CsPI1 在墨蘭各組織器官中的表達

CsPI1在墨蘭各組織器官中的相對表達豐度順次為花瓣＞唇瓣＞花蕾＞花萼＞合蕊柱＞子房(圖6),在營養生長期、花蕾期、盛花期的根、葉、花葶中幾乎未檢測到熒光信號。CsPI1只在墨蘭生殖器官中表達,而在營養器官中均不表達。對于3個生長時期,CsPI1在墨蘭器官組織中的表達量逐漸升高,說明CsPI1主要調控生殖器官的生長發育。

圖6 CsPI1 在墨蘭各組織器官中的表達Fig.6 Expression of CsPI1 in tissues of Cymbidium sinense

3 討論

所克隆的兩條PI/GLO序列均為MIKC 型MADS-box基因。均有M、I和K 結構域。兩基因與春蘭(AD158461.1)、細莖石斛(XP_020679601.1)、文心蘭(ACD85113.1)、球花石斛(AAY86363.1)、萼脊蘭(AJG41730.1)、蝴蝶蘭(AAV28490.1)的同源性均在92%以上,推測CfPI1和CsPI1基因功能與以上蘭科植物PI/GLO基因相似。

通過RT-qPCR 試驗發現兩個基因在不同的組織和器官中均差異表達,CfPI1和CsPI1均主要表達于花器官中,這與蝴蝶蘭GLO/PI基因Pe MADS6的表達特性一致[21]。兩個基因表達相似之處在于二者均在花萼、花瓣、唇瓣和花蕾中突出表達,表明這兩個基因主要參與花被片的發育,而且二者在子房中也有表達。不同之處在于,蕙蘭表達最突出部位是花萼,墨蘭是花瓣;而且蕙蘭盛花期花葶中也有表達,墨蘭在合蕊柱中表達也相對突出。二者均是主要調控花器官的發育。CfPI1在花器官中自外而內表達水平逐漸下調,CsPI1在花器官花瓣中的表達高于花萼,這與紅花玉蘭Mawu PI[9-10]的表達相似。這表明不同植物中PI功能并不完全保守,而是存在一定差異。前人研究中,Tunen等[22]首次指出花瓣類似的萼片的形成是B 類基因的表達區域向外擴展導致的結果,致本來花器官第一輪僅A 類基因控制變為A+B同時控制。

擬南芥PI蛋白直接結合AP1啟動子中的序列以調控AP1基因的表達,從而參與花的發育[17]。白樺Bp PI過表達可能通過限制開花激活因子來延遲開花,其中Bp AP1顯著下調,而且Bp PI可以直接與Bp AP1的啟動子結合,限制Bp AP1的表達[23]。蕙蘭的AP1/FUL亞家族同源基因CfAP11[24]、CfMADS1[25]主要在營養期葉、花蕾期葉、花蕾、花葶、盛花期葉和子房中表達,與蕙蘭的成花誘導和子房發育有關。而Cf-PI1在花蕾和盛花期花器官突出表達。由此推斷蕙蘭CfPI1的表達限制了開花時間基因CfAP11和CfMADS1的表達,CfPI1基因可能通過調控Cf AP11和Cf MADS1的表達來調控花器官的發育。這還需要通過染色質免疫共沉淀方法進一步分析驗證。