人參皂苷RG1調控丙酮酸激酶M2影響視網膜毛細血管內皮細胞糖酵解和血管形成

薛黎萍，胡 敏，李亞娣，張曉帆，張潔瑩，周 園，梁佳芮，張傳宏，丁 鵬

糖尿病視網膜病變(diabetic retinopathy，DR)是最常見、最嚴重的糖尿病微毛細血管并發癥之一，DR的基本病理特征是新生血管的生成[1]。有研究[2]表明內皮細胞(endothelial cells，ECs)代謝在血管生成中的關鍵作用，ECs的增殖和遷移依賴于糖酵解產生的能量，因此，抑制ECs中的糖酵解可能會抑制DR中新血管形成。丙酮酸激酶M2(pyruvate kinase M2, PKM2)是糖酵解末端步驟的限速酶，它促進磷酸烯醇式丙酮酸釋放能量，為細胞生長提供有利條件[3]。Liu et al[4]報道，高葡萄糖(high glucose，HG)可誘導人視網膜微血管內皮細胞(human retinal microvascular endothelial cells，HRMECs)中PKM2表達增加，而抑制PKM2后可逆轉HG誘導的HRMECs損傷和凋亡。人參皂苷Rg1(ginsenoside Rg1，GRg1)是人參中的一種主要皂苷，在糖尿病中具有抗血管生成和抗凋亡活性[5]，但在DR中，鮮有關于GRg1是否通過調控糖酵解過程影響血管形成的報道。因此，該研究旨在探討GRg1通過調控PKM2的表達對HRMECs糖酵解的影響。

1 材料與方法

1.1 細胞株及主要試劑人視網膜微血管內皮細胞HRMECs(上海澤葉生物科技有限公司)；LipofectamineTM2000轉染試劑盒、TRIzol試劑、Western blot試劑盒(美國Thermo Fisher公司)；Qiagen RNeasy mini 試劑盒(廣州健侖生物科技有限公司)；PrimeScript RT試劑盒(北京智杰方遠科技有限公司)；葡萄糖檢測試劑盒和ATP檢測試劑盒(生工生物工程股份有限公司)；乳酸含量檢測試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)；血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、血管生成素-1(angiopoietin-1，Ang-1)、血管生成素-2(angiopoietin-2，Ang-2)、成纖維細胞生長因子2(fibroblast growth factor2，FGF2)和GAPDH(英國Abcam公司)；ECs專用培養基(武漢普諾賽生命科技有限公司)

1.2 細胞培養及轉染HRMECs在含有5%胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)、1%青霉素/鏈霉素和1% ECs生長因子的HRMECs特異性ECs培養基中培養。所有細胞均在37 ℃、5% CO2培養箱中培養。每2 d更換一次培養基。正常葡萄糖條件下的葡萄糖濃度為5 mmol/L，HG條件下的葡萄糖濃度為25 mmol/L，細胞在HG條件下培養48 h后加入10 μmol/L GRg1，繼續培養48 h進行后續實驗。根據Lipofectamine 2000轉染試劑盒說明將陰性對照物(NC)、靶向PKM2的小干擾RNA(si-PKM2)和過表達PKM2(OE-PKM2)的質粒轉染至HRMECs。

1.3 qRT-PCR檢測HRMECs中PKM2 mRNA的表達情況收集各組細胞，使用TRIzol試劑提取細胞總RNA，根據PrimeScript RT試劑盒說明將1 μg總RNA逆轉錄合成cDNA，以GAPDH為內參，進行定量PCR反應，反應體系為：ddH2O 7 μl，SYBR Green PCR Master Mix 10 μl，cDNA 2 μl，上游引物0.5 μl，下游引物0.5 μl，總體系共20 μl。PCR反應條件為：95 ℃預變性10 min，然后3步反應，95 ℃變性15 s，60 ℃ 退火30 s，共45個循環。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.4 Western blot檢測HRMECs中相關蛋白表達量使用RIPA緩沖液裂解細胞，BCA蛋白檢測試劑盒分析蛋白質濃度，然后加載到十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳微型凝膠上并轉移到聚偏二氟乙烯膜上。將膜在含有5%脫脂奶粉的封閉緩沖液中封閉，并在4 ℃下加入提前稀釋好的一抗(VEGF，1 ∶10 000；Ang-1，1 ∶10 000；Ang-2，1 ∶5 000；FGF2，1 ∶1 000；GAPDH，1 ∶2 500)，室溫孵育2 h。然后在室溫下將膜與HRP標記的二抗孵育1 h，ECL顯色，凝膠成像系統成像分析，使用ImageJ軟件進行蛋白質印跡結果的定量。

1.5 血管形成實驗檢測HRMECs血管形成能力將Matrigel(90 μl)涂到24孔板中，在37 ℃下硬化30 min，將HRMECs以每孔1.2×105個細胞的密度接種到Matrigel包被的孔頂部，于100%濕度、37 ℃、5%CO2的無菌培養箱中培養6 h，然后在倒置顯微鏡下觀察體外管腔生成結果并拍照，使用Image Pro Plus軟件分析計算視野內Matrigel小管形成的數量，以此量化血管形成能力。

1.6 HRMECs中葡萄糖攝取量和乳酸產量收集細胞到離心管內，離心后棄上清液，每組收集5×105個細胞，加入100 μl蒸餾水，超聲波破碎細胞(冰浴，功率200 W，超聲3 s，間隔10 s，重復30次)，95 ℃水浴10 min，冷卻后，25 ℃、10 600 r/min離心10 min，取上清液備用；酶標儀預熱30 min以上，按照試劑盒說明書加入各試劑，根據公式計算葡萄糖攝取量。同樣，按照乳酸含量檢測試劑盒說明書檢測乳酸產量。

1.7 HRMECs中ATP含量收集各組細胞，每組收集5×105個細胞，加入100 μl提取液，冰浴下超聲波破碎1 min，4 ℃、11 818 r/min離心10 min，取上清液至另一離心管，加入500 μl的氯仿充分震蕩混勻，4 ℃、11 818 r/min離心3 min，取上清液，置冰上待測。根據試劑盒說明加入反應液，檢測酶標儀340 nm波長處的光密度(optical density，OD)值，根據公式計算腺嘌呤核苷三磷酸(adenosine triphosphate，ATP)含量。

2 結果

2.1 GRg1抑制HRMECs血管形成Western blot檢測結果顯示，與NC組相比，HG組細胞的VEGF、Ang-1、Ang-2、FGF2的表達水平增強，經GRg1處理后，VEGF、Ang-1、Ang-2、FGF2的表達下降(P<0.05)，見圖1A；同時分析視野內Matrigel小管形成的數量，結果顯示，與NC組細胞相比，HG組細胞血管形成數量增多(P<0.01)，而GRg1處理HG誘導的HRMECs后，其血管形成數量減少(P<0.05)，見圖1B。

圖1 GRg1抑制HRMECs血管形成A：GRg1處理后HRMECs的相關蛋白表達情況；B：GRg1處理后HRMECs的血管生成情況×200；與NC組比較：*P<0.05，**P<0.01；與HG組比較：△P<0.05

2.2 GRg1抑制HG誘導的HRMECs糖酵解在HG的處理下，HRMECs對葡萄糖的攝取量高于NC組(P<0.001)，其乳酸和ATP產量也高于NC組(P<0.001)；用GRg1處理HG組細胞后，與HG組相比，細胞對葡萄糖的攝取減少(P<0.01)，乳酸及ATP產量與HG組相比也降低(P<0.01)，見圖2。

圖2 GRg1抑制HG誘導的HRMECs糖酵解A：GRg1處理后HRMECs的葡萄糖攝取量；B：GRg1處理后HRMECs的乳酸產量；C：GRg1處理后HRMECs的乳酸產量；與NC組比較：***P<0.001；與HG組比較：△△P<0.01

2.3 GRg1調控HRMECs中PKM2表達qRT-PCR檢測結果顯示，HG組細胞PKM2 mRNA的表達增加(P<0.001)，在GRg1處理后，PKM2 mRNA的表達有所下調(P<0.01)，見圖3A；Western blot檢測HRMECs中表達量發現，PKM2在HG組中的表達高于NC組(P<0.01)，而經GRg1處理后，其在HRMECs中的表達降低(P<0.05)，見圖3B。

圖3 GRg1調控HRMECs中表達A：GRg1處理對HRMECs中PKM2 mRNA表達的影響；B：Western blot檢測HRMECs中PKM2的表達；與NC組比較：**P<0.01，***P<0.001；與HG組比較：△P<0.05，△△P<0.01

2.4 GRg1通過調控PKM2的表達減少HRMECs糖酵解抑制血管形成qRT-PCR檢測si-PKM2和OE-PKM2的轉染效率，結果顯示，轉染si-PKM2后，其表達量降低(P<0.001)，見圖4A。轉染OE-PKM2后，其表達量升高(P<0.001)，見圖4B。表明細胞轉染效率佳。對每組細胞的糖酵解過程檢測發現，與HG+GRg1組相比，HG+GRg1+OE-PKM2組細胞的葡萄糖攝取量、乳酸和ATP產量均升高(P<0.05或P<0.01)，而HG+GRg1+si-PKM2組細胞的葡萄糖攝取量、乳酸和ATP產量均降低(P<0.01)，見圖4C-4E。檢測HRMECs中相關蛋白表達量，結果如圖4F，在HG+GRg1+OE-PKM2組細胞中，VEGF、Ang-1、Ang-2、FGF2的表達量高于HG+GRg1組(P<0.05)，HG+GRg1+si-PKM2組的蛋白表達量則降低(P<0.05或P<0.01)。最后，通過血管形成實驗進一步驗證，HG+GRg1+OE-PKM2組細胞的血管生成數量多于HG+GRg1組(P<0.01)，而HG+GRg1+si-PKM2組的血管形成數量比HG+GRg1組減少(P<0.05)，見圖4G。

圖4 GRg1通過調控PKM2的表達減少HRMECs糖酵解抑制血管形成A：qRT-PCR檢測si-PKM2的轉染效率；B：qRT-PCR檢測OE-PKM2的轉染效率；C：各組HRMECs的葡萄糖攝取量；D：各組HRMECsHRMECs的乳酸生成量；E：各組HRMECs的ATP產量；F：各組HRMECs的蛋白表達；G：各組HRMECs的血管生成情況×200；a：NC組；b：HG組；c：HG+RGg1組；d：HG+RGg1+OE-PKM2組；e：HG+RGg1+si-PKM2組；與si-NC組比較：▲▲▲P<0.001；與OE-NC組比較：▼▼▼P<0.001；與NC組比較：**P<0.01，***P<0.001；與HG組比較：△P<0.05，△△P<0.01；與HG+RGg1組比較：#P<0.05，##P<0.01

3 討論

DR的發展與高血糖相關，長期的高血糖環境可損傷視網膜血管內皮，引起一系列眼底病變，如微血管瘤、新生血管、玻璃體增生甚至視網膜脫離[6]，視網膜新生血管被認為是DR中不可逆失明的主要原因。通過對高糖誘導下的HRMECs進行研究，可以發現HG環境可以誘導HRMECs的血管生成。

GRg1是人參中的主要活性成分之一，具有抗炎、抗氧化、神經保護等多種藥理活性[7]。Zhu et al[8]報道GRg1可以減輕HG誘導的人臍靜脈ECs屏障功能障礙；Ying et al[9]報道GRg1通過激活IRS-1/Akt/GSK3β信號傳導，保護過度磷酸化Tau誘導的糖尿病視網膜神經變性，阻止DR 的進展。由此可知，GRg1可能在DR的血管病變中發揮作用。PKM2在所有核酸合成率高的細胞中均有表達，如胚胎細胞、正常增殖細胞和腫瘤細胞[10]。PKM2的四聚體通常與正常細胞中ATP的產生和糖酵解中間體的分解代謝增加有關[11]。目前已有研究[12]表明PKM2在腫瘤發生和傷口愈合過程中具有調節血管生成的作用。此外，PKM2也已經被證實參與調控DR中HRMECs的炎癥、凋亡和功能障礙[4]。本研究結果顯示，HG處理HRMECs后可上調PKM2表達，PKM2表達被抑制后可減少HG誘導的糖酵解和血管形成。GRg1可抑制HG誘導的PKM2表達升高，抑制PKM2誘導的糖酵解過程，進而抑制HG誘導的血管形成。

DR的發病機制不僅受多種因素通過整合的分子信號通路和細胞過程的調節，ECs的葡萄糖代謝通過控制ECs增殖、遷移和新血管形成在DR的眼部新生血管疾病中也發揮重要作用[13]。Feng et al[14]的研究表明，通過在視網膜病變小鼠玻璃體內注射PFKFB3的小干擾RNA可以減少糖酵解，并且抑制了脈絡膜和視網膜ECs新生血管形成。Pedro et al[15]發現糖原合成、戊糖循環和糖酵解途徑對VEGF和FGF刺激下的ECs增殖至關重要。由此可知，ECs糖酵解在DR新血管形成中發揮重要作用，調節視網膜ECs糖酵解途徑的分子或藥物對DR的治療有重要意義。對HRMECs的葡萄糖、乳酸和ATP生成量進行研究發現，在HG的影響下，三者的生成量均顯著升高，而在加入GRg1后，降低了葡萄糖、乳酸和ATP生成量；但如圖4內容所示，HG+GRg1組導致的效應改變應該可以通過HG+GRg1+OE-PKM2組來逆轉，但本研究結果并未完全逆轉，因此GRg1對視網膜血管生成的影響是否仍有其他機制和分子參與還有待進一步研究。