丹酚酸A通過lncRNA B調控TGF-β/Smads通路改善阿霉素誘導的心力衰竭的機制研究*

艾文偉 張明 熊力 周淑蘭（江西省人民醫院 南昌 330006）

心力衰竭是各種類型心臟病的最終狀態，其心肌病理改變通常是心肌腫大、凋亡、纖維化共存的[1]。現今許多學者研究中醫藥治療該病的方法，在臨床中也較為廣泛。丹酚酸A是丹參重要的水溶性有效成分，有保護心臟的作用；其可以顯著去除自由基并且保護羥基自由基造成的線粒體氧化損傷，具有一定的抗氧化功能，而且還能控制凋亡基因的表達[2]。目前關于該病的生物學機制以及潛在的分子學機制還不夠明確。有研究認為該病的發病可能有長鏈非編碼RNA（lncRNA）參與，還有可能是與調控TGF-β/Smads信號通路有關[3]。但是目前相關研究較少，因此，本研究通過構建細胞模型和動物心衰模型來探討丹酚酸A對阿霉素誘導的心力衰竭的影響，以確定其相關機制。現報道如下：

1 材料與方法

1.1 材料（1）細胞：H2C9細胞株，由中國協和細胞庫提供，于含有10%胎牛血清的培養基中培養，取對數生長期細胞進行實驗。（2）實驗動物：取30只無特定病原體（SPF）級、8周齡、健康、體質量在25 kg左右的雄性C57BL/6小鼠，在26℃下飼養，自由飲食。本研究經南昌大學實驗動物科學中心倫理委員會批準（倫理批號：20140729）。

1.2 方法

1.2.1 細胞分組與轉染 培養細胞至對數生長期后，進行細胞分組：（1）空白對照組：正常培養心肌細胞12 h。（2）模型組：用8 μmol/L的阿霉素處理細胞12 h。（3）丹酚酸A低劑量組：以10 μmol/L的丹酚酸A和8 μmol/L的阿霉素共同處理細胞12 h。（4）丹酚酸A中劑量組：以20 μmol/L的丹酚酸A和8 μmol/L的阿霉素共同處理細胞12 h。（5）丹酚酸A高劑量組：以40 μmol/L的丹酚酸A和8 μmol/L的阿霉素共同處理細胞12 h。（6）lncRNA B抑制組：轉染穩定沉默lncRNA B-inhibitoir表達細胞株（lncRNA B-inhibitor），驗證轉染成功后，以8 μmol/L的阿霉素處理細胞12 h。

1.2.2 小鼠建模及分組 將小鼠隨機分為：對照組（n=6），阿霉素性心力衰竭模型組（n=6），丹酚酸A低濃度組（n=6）、丹酚酸A中濃度組（n=6）、丹酚酸A高濃度組（n=6）。除對照組外的每只小鼠在2周內通過腹腔注射阿霉素6次，每次劑量2.5 mg/kg，建立小鼠心力衰竭模型，對照組小鼠注射等體積的生理鹽水；丹酚酸A低、中、高劑量組的小鼠在建模成功后，通過灌胃分別服用10 mg/kg、20 mg/kg、40 mg/kg的丹酚酸A，處理2周后進行下一步檢測。

1.3 觀察指標

1.3.1 PCR檢測lncRNA B和轉化生長因子-β（TGF-β）水平 使用miRNA分離試劑盒從動物模型組和細胞模型組中分別分離總RNA。反應條件按照cDNA合成試劑盒的說明進行設置。反應條件：95℃預變性10 min、95℃下變性15 s、60℃退火32 s，循環50次后測定其溶解曲線，測定好后通過計算機系統自動分析各個樣本的Ct值，再計算lncRNA B和TGF-β的相對表達量。

1.3.2 MTT檢測細胞增殖 將各組細胞加入孔板中，每組加3個孔，在5%CO2、37℃下培養12 h，置于顯微鏡下觀察。在每孔中加入5 mg/ml的MTT溶液10 μl，繼續培養4 h后終止培養。向每孔加入150 μl二甲基亞砜（DMSO）并放置于搖床上震蕩10 min后，使用酶聯免疫檢測儀檢測各孔在490 nm處的OD值，并計算出各組的細胞存活率。

1.3.3 流式細胞術檢測細胞凋亡 收集各組細胞，將細胞用異硫氰酸熒光素（FITC）凋亡檢測試劑盒在室溫下進行染色1 h。最后用流式細胞儀進行測定分析。

1.3.4 檢測小鼠心臟功能 對小鼠腹腔進行消毒后，注射戊巴比妥麻醉，將小鼠固定至操作臺后，用肝素尾靜脈注射。通過頸部中央切口切開表皮，仔細分離每一層組織，露出右側頸動脈，頸動脈遠端用手術線結扎，之后利用動脈夾關閉頸動脈近心端，利用顯微剪剪開總動脈缺口，插入P-V導管至小鼠的主動脈并延伸至左心室。記錄15 min壓力容積的數據。使用Pressure Vol Anal軟件分析其血流動力學的相關數據，獲得左室內壓最大上升速率（dp/dtmax）、左室內壓最大下降速率（-dp/dtmax）、左心室收縮壓（LVSP）、左心室舒張末壓（LVEDP）等數據。

1.3.5 檢測小鼠生化指標 在模型建立后2周，分別對各組小鼠進行腹主動脈取血，并且對其血清進行分離處理，然后用酶聯免疫吸附測定（ELISA）方法測定其心力衰竭相關指標，包括腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、同型半胱氨酸（Hcy）、內皮素（ET）水平。1.3.6觀察小鼠心肌組織病理學變化 處死小鼠后，剪開心臟，取下左心室，使用冷生理鹽水進行沖洗，用5%的多聚甲醛進行固定。固定48 h后用酒精進行脫水，用石蠟進行包裹，切片，然后HE染色，最后用光學顯微鏡觀察。

1.3.7 Western Blotting（WB）法檢測相關蛋白表達利用RIPA裂解緩沖液分別提取動物組和細胞組的心肌細胞裂解物，利用SDS-PAGE電泳分離蛋白，之后轉移至聚偏氟乙烯（PVDF）膜上，用5%脫脂奶粉密封，一抗TGF-β1、Smad2、Smad3抗體4℃孵育過夜。膜與二抗共孵育，ECL底物試劑盒檢測。

1.4 統計學處理 采用SPSS22.0軟件對實驗數據進行統計學分析，計量資料以（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析；兩組之間采用LSD-t檢驗多重比較。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組細胞和各組小鼠lncRNA B和TGF-β表達水平比較 細胞實驗中，與空白對照組相比，模型組lncRNA B和TGF-β表達較高，與模型組比，丹酚酸A各劑量組和lncRNA B抑制組表達較低，P＜0.05；動物實驗中，與對照組相比，阿霉素性心力衰竭模型組lncRNA B和TGF-β表達較高，而經丹酚酸A干預后，表達降低，P＜0.05。見表1、表2。

表1 細胞實驗中各組細胞lncRNA B和TGF-β表達水平比較（±s）

表1 細胞實驗中各組細胞lncRNA B和TGF-β表達水平比較（±s）

注：與空白對照組相比，*P＜0.05；與模型組相比，#P＜0.05。n=3是指重復了3次實驗。

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表2 動物實驗中各組小鼠lncRNA B和TGF-β表達水平比較（±s）

表2 動物實驗中各組小鼠lncRNA B和TGF-β表達水平比較（±s）

注：與對照組相比，*P＜0.05；與阿霉素性心力衰竭模型組相比，#P＜0.05。

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2.2 細胞實驗中各組細胞存活率與凋亡率比較與空白對照組相比，模型組存活率較低，凋亡率較高；與模型組相比，丹酚酸A各劑量組和lncRNA B抑制組存活率較高，凋亡率較低，P＜0.05。見表3。

表3 細胞實驗中各組細胞存活率與凋亡率比較（%，±s）

表3 細胞實驗中各組細胞存活率與凋亡率比較（%，±s）

注：與空白對照組相比，*P＜0.05；與模型組相比，#P＜0.05。n=3是指重復了3次實驗。

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2.3 各組小鼠血流動力學參數比較 與對照組相比，阿霉素性心力衰竭模型組dp/dtmax、-dp/dtmax、LVSP水平較低，LVEDP水平較高，而經丹酚酸A干預后，其水平發生逆轉，P＜0.05。見表4。

表4 各組小鼠血流動力學參數比較（±s）

表4 各組小鼠血流動力學參數比較（±s）

注：與對照組相比，*P＜0.05；與阿霉素性心力衰竭模型組相比，#P＜0.05。

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2.4 各組小鼠生化指標比較 與對照組相比，阿霉素性心力衰竭模型組生化指標較高，而經丹酚酸A干預后，生化指標水平好轉，P＜0.05。見表5。

表5 各組小鼠生化指標比較（±s）

表5 各組小鼠生化指標比較（±s）

注：與對照組相比，*P＜0.05；與阿霉素性心力衰竭模型組相比， #P＜0.05。

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2.5 各組小鼠心肌組織病理學變化 空白對照組心肌組織未見明顯病理改變，肌束排列整齊，心肌細胞間間隙均勻，未發生炎癥細胞浸潤和彌漫性水腫。模型組心肌組織表現為典型的心肌損傷，肌束紊亂，炎性細胞浸潤，彌漫性水腫。丹酚酸A各濃度組心肌組織肌束排列逐漸有序，炎性細胞浸潤和彌漫性水腫細胞逐漸減少。見圖1。

圖1 HE染色檢測各組小鼠心肌組織病理學變化（×200）

2.6 各組細胞蛋白相關表達水平比較 細胞實驗中，與空白對照組相比，模型組Smad2、Smad3蛋白表達較低，TGF-β1表達升高，與模型組相比，丹酚酸A各劑量組和lncRNA B抑制組蛋白表達均有所逆轉。動物實驗中，與對照組相比，阿霉素性心力衰竭模型組Smad2、Smad3蛋白表達降低，TGF-β1表達升高，而經丹酚酸A干預后，其相關蛋白表達反轉，P＜0.05。見圖2、表6、表7。

圖2 各組相關蛋白表達比較

表6 細胞實驗中各組細胞蛋白相關表達水平比較（±s）

注：與空白對照組相比，*P＜0.05；與模型組相比，#P＜0.05。n=3是指重復了3次實驗。

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表7 動物實驗中各組小鼠相關蛋白表達水平比較（±s）

表7 動物實驗中各組小鼠相關蛋白表達水平比較（±s）

注：與對照組相比，*P＜0.05；與阿霉素性心力衰竭模型組相比，#P＜0.05。

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3 討論

心力衰竭是威脅生命的心臟疾病，其特征是心臟結構或心功能受損，尤其是病理性或適應不良的心肌肥大，心室無法有效填充或泵送血液[4]；表現為缺血性、高血壓性、感染性或遺傳性心臟病，心力衰竭已成為心臟病學的主要挑戰，并成為廣泛研究的熱點[5]。中醫認為治療心力衰竭主要以養身定志、活血化瘀為主，其中丹參可入心經，是治療心力衰弱的重要藥物，而丹酚酸A是丹參重要的有效成分[6]。此外，lncRNA作為重要的基因表達調控因子，越來越多的證據表明，其在各種心血管疾病中發揮著重要的調控作用[7～8]。若丹酚酸A可以通過lncRNA B對TGF-β/Smads信號通路產生調控作用，則丹參的中藥應用及臨床治療就有了新的實驗依據和循證學依據。

在本研究細胞實驗中，與空白對照組相比，模型組lncRNA B和TGF-β表達較高，與模型組比，丹酚酸A各劑量組和lncRNA B抑制組表達較低。動物實驗中，與對照組相比，阿霉素性心力衰竭模型組lncRNA B和TGF-β表達較高，而經丹酚酸A干預后，表達降低。這說明，lncRNA B在該病的發病機制中發揮著重要的作用，且lncRNA B表達升高可被丹酚酸A逆轉。此外，在心肌細胞的存活率和凋亡率的實驗觀察中，丹酚酸A可以降低模型組細胞的凋亡率，并提高存活率，且lncRNA B抑制組也有同樣的效果，也進一步佐證了丹酚酸A對心力衰竭有改善作用。在動物實驗中，通過檢測小鼠血流動力學指標、生化指標以及病理觀察，也證實了丹酚酸A對心力衰竭的干預作用，其可改善心力衰竭小鼠的心功能且對心肌細胞的凋亡均有改善效果。有研究表明，TGF-β/Smads通路參與心肌損傷疾病，TGF-β1表達升高可通過傳導Smads通路誘導細胞損傷，甚至是凋亡[9～10]。而Smad2、Smad3屬于R-Smad，可通過TGF-β1受體激活轉化，與該受體形成瞬時復雜激活途徑[11～12]。因此，本研究通過檢測細胞和小鼠中TGF-β1、Smad2、Smad3蛋白表達來確定其調控機制。結果顯示，細胞實驗中，與空白對照組相比，模型組Smad2、Smad3蛋白表達較低，TGF-β1表達升高；動物實驗中與模型組相比，丹酚酸A各劑量組和lncRNA B抑制組蛋白表達均有所逆轉；與對照組相比，阿霉素性心力衰竭模型組Smad2、Smad3蛋白表達降低，TGF-β1表達升高，而經丹酚酸A干預后，其相關蛋白表達反轉。這說明，丹酚酸A可通過lncRNA B調控TGF-β/Smads信號通路，從而改善心力衰竭小鼠癥狀，抑制心肌細胞凋亡，保護心肌組織。

綜上所述，丹酚酸A可能通過lncRNA B調節TGF-β/Smads信號通路，保護阿霉素誘導的心力衰竭小鼠心肌組織損傷，改善組織病理學變化，降低細胞凋亡。然而，盡管本研究證實了丹酚酸A與TGF-β/Smads信號通路的相關性，不過所涉及的轉錄因子還需要進一步闡明。