基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的健脾清化方治療2型糖尿病的作用機(jī)制研究

唐勵(lì)靜，申利賢，吳廣，王梅，李榮

南華大學(xué)附屬第二醫(yī)院，南華大學(xué)衡陽(yáng)醫(yī)學(xué)院，臨床藥學(xué)科，湖南衡陽(yáng) 421001

2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus,T2DM）是一種多因素引起具有遺傳易感性的內(nèi)分泌代謝性疾病，主要特征為慢性高血糖。《中國(guó)心血管健康與疾病報(bào)告2020》[1]報(bào)道在2015—2017年，中國(guó)成年人糖尿病患病率為11.2%，其中大陸成人患糖尿病人數(shù)約為1.298億。在中醫(yī)學(xué)中，糖尿病有其專屬的名稱，被稱為“消渴病”或糖絡(luò)病等，并且中醫(yī)藥在治療糖尿病、防治并發(fā)癥中有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)和作用，《中國(guó)2型糖尿病防治指南（2020年版）》進(jìn)一步明確了中醫(yī)藥在糖尿病防治中的重要地位和作用[2]。本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)進(jìn)一步探討健脾清化方中有效成分和2型糖尿病的作用靶點(diǎn)及通路，闡述其可能潛在的作用機(jī)制，為中醫(yī)藥治療2型糖尿病提供理論基礎(chǔ)與科學(xué)依據(jù)的支持。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 藥物成分與靶點(diǎn)篩選方法

通過TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)，網(wǎng)站搜索地址為http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php，檢索健脾清化方中“山藥”“葛根”“黃 芪”“黨 參”“黃 芩”“黃 連”“黃 精”“鬼 箭 羽”的化學(xué)成分。以口服生物利用度OB≥30%和類藥性DL≥0.18為閾值篩選出相應(yīng)化合物的活性成分，利用TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)中的選項(xiàng)Related Targets-對(duì)篩選到的活性成分有關(guān)的靶點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)分析。標(biāo)準(zhǔn)基因名稱使用UniProt(http://www.uniprot.org)的數(shù)據(jù)庫(kù)篩選有效化合物對(duì)應(yīng)的作用靶點(diǎn)命名。

1.2 藥材-化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建

健脾清化方中有效的化合物信息和作用靶點(diǎn)使用Cytoscape3.7.2軟件處理，有效化合物和作用靶點(diǎn)的標(biāo)示用“節(jié)點(diǎn)”表示，用“邊”表示二者之間的作用關(guān)系。通過網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)進(jìn)一步分析，以等級(jí)值（Degree）、親中心度值（closeness centrality）、中介中心度（betweenness centrality）來(lái)顯示“節(jié)點(diǎn)”程度的重 要 性，Betweenness和Degree centrality的 數(shù) 值 越大，證明在網(wǎng)絡(luò)中該“節(jié)點(diǎn)”越重要，以degree≥2倍中位數(shù)為篩選條件選擇關(guān)鍵靶點(diǎn)。

1.3 2型糖尿病的靶點(diǎn)信息篩選

使用GeneCard數(shù)據(jù)庫(kù)和OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)，網(wǎng)站搜索地址分別為https://www.genecards.org/和https://www.omim.org/，以關(guān)鍵詞“Type 2 diabetes mellitus”進(jìn)行檢索，取交集為2型糖尿病的靶點(diǎn)。

1.4 潛在作用靶點(diǎn)的獲取

通過Venny2.1平臺(tái)分別錄入1.1中所得的有效成分靶點(diǎn)和2型糖尿病的相關(guān)靶點(diǎn)，繪制韋恩圖，得到相互交集的靶點(diǎn)蛋白即為健脾清化方治療2型糖尿病的潛在作用靶點(diǎn)。

1.5 PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

使用STRING網(wǎng)站地址為https://string-db.org/，將以上潛在作用靶點(diǎn)基因?qū)耄赟TRING網(wǎng)站中設(shè) 定 屬 性 為“Homo sapiens”，meaning of network edges設(shè)為“confidence”“minimum required interaction score:”設(shè) 為“0.95”，display simplifications設(shè) 置 為“hide disconnected nodes in the network”“minimum required interaction score:”設(shè)為“0.95”，其余參數(shù)為系統(tǒng)默認(rèn)，在此基礎(chǔ)上建立PPI網(wǎng)絡(luò)。用Cytoscape Version 3.7.2軟件對(duì)PPI關(guān)系進(jìn)行可視化處理，以便于獲得PPI網(wǎng)絡(luò)；按degree大小順序篩選靶標(biāo)基因。

1.6 GO及KEGG靶點(diǎn)通路富集分析

使用DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)，搜索網(wǎng)址為https://david.ncifcrf.gov/home.jsp，將靶基因?qū)耄瑢⑤斎氲玫降陌谢蛎Q列表，所有靶基因名稱按照官方名稱（official gene symbol）進(jìn)行校正，并限定物種為Homo Sapiens，通過以上數(shù)據(jù)庫(kù)檢索以及轉(zhuǎn)化的操作，以P＜0.01進(jìn)行GO生物學(xué)過程和KEGG信號(hào)通路富集分析，并用Origin軟件和R語(yǔ)言將其結(jié)果繪制成柱狀圖與氣泡圖進(jìn)行可視化。

2 結(jié)果

2.1 藥物的活性化合物成分及篩選

通過TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)檢索健脾清化方共有563個(gè)化合物，其中黨參134個(gè)、黃芪87個(gè)、山藥71個(gè)、葛根18個(gè)、黃芩143個(gè)、黃連48個(gè)、黃精38個(gè)、鬼箭羽24個(gè)，經(jīng)OB≥30%并且DL≥0.18為閾值篩選得到活性成分共有131個(gè)，其中黨參21個(gè)、黃芪20個(gè)、山藥16個(gè)、葛根4個(gè)、黃芩36個(gè)、黃連14、黃精12個(gè)以及鬼箭羽8個(gè)。刪除16個(gè)重復(fù)化合物數(shù)據(jù)，共獲取115個(gè)有活性成分。活性化合物基本信息見圖1。

2.2 藥材-化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建

TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)顯示的Related Targets進(jìn)行預(yù)測(cè)，得到115個(gè)活性成分相關(guān)靶點(diǎn)，收集到257個(gè)未重復(fù)的化合物及其靶點(diǎn)。使用Cytoscape3.7.2軟件將之前獲取的有效化合物和作用靶點(diǎn)信息對(duì)其建立關(guān)于有效化合物-作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，見圖2。網(wǎng)絡(luò)總共包括396個(gè)節(jié)點(diǎn)（8種藥材節(jié)點(diǎn)、131個(gè)化合物節(jié)點(diǎn)和257個(gè)靶點(diǎn)節(jié)點(diǎn)）與2267條邊，分別為黨參、黃芪、山藥、葛根、黃芩、黃連、黃精、鬼箭羽及其化合物，中央菱形圖標(biāo)代表靶標(biāo)基因，其中形狀△代表藥材，○代表化合物，◇代表基因。其中作用靶點(diǎn)用各節(jié)點(diǎn)表示，各作用靶點(diǎn)之間的相互作用關(guān)系用每條邊表示，邊數(shù)的多少標(biāo)志該節(jié)點(diǎn)對(duì)應(yīng)的作用靶點(diǎn)程度的重要性。結(jié)果顯示，Degree值最高的化合物是MOL000098-槲皮素。此外，Degree≥2倍中位數(shù)的靶點(diǎn)有MOL000358-β-谷甾醇、MOL000422-山奈酚、MOL000449-豆甾醇、MOL000392-刺芒柄花素、MOL002714-黃芩素和MOL000006-木犀草素，表明以上所述的化合物在整個(gè)網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮非常重要的作用，可能是健脾清化方治療2型糖尿病的核心化合物。

圖2 藥材-化合物-靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)圖

2.3 健脾清化方治療2型糖尿病潛在作用靶點(diǎn)

預(yù)測(cè)健脾清化方治療2型糖尿病的靶點(diǎn)根據(jù)GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)檢索2型糖尿病的治療靶點(diǎn)，按照Score≥50為閾值得到284個(gè)2型糖尿病的治療靶點(diǎn)。運(yùn)用Venny2.1.0平臺(tái)將健脾清化方主要活性成分調(diào)控的靶點(diǎn)與2型糖尿病的治療靶點(diǎn)取交集，得到67個(gè)健脾清化方治療2型糖尿病的靶點(diǎn)，見圖3。

2.4 PPI網(wǎng)絡(luò)

用STRING平臺(tái)對(duì)藥物和疾病映射得到的67個(gè)交集基因進(jìn)行PPI網(wǎng)絡(luò)分析，在Cytoscape Version3.7.2軟件中將PPI關(guān)系導(dǎo)入后進(jìn)行可視化處理見圖4。由圖3可知，該網(wǎng)絡(luò)共有67個(gè)節(jié)點(diǎn)和164條邊，其中蛋白用節(jié)點(diǎn)表示，連接到1個(gè)節(jié)點(diǎn)的線條數(shù)用度值表示，因此網(wǎng)絡(luò)中每個(gè)節(jié)點(diǎn)的重要性得到合理的評(píng)估。PPI網(wǎng)絡(luò)圖中平均局部聚類系數(shù)為0.41，平均節(jié)點(diǎn)度為4.9。在平均度值以上的靶蛋白有23個(gè)，其中，排名前十的靶點(diǎn)分別為腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor,TNF）、白介素-6（interleukin-6,IL-6）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothlial growth factor,VEGF）、AKT1、FOS、TP53、表皮生長(zhǎng)因子受體（epidermal growth factor receptor,EGFR）、表皮生長(zhǎng)因子（epidermal growth factor,EGF）、MAPK14和MAPK1，這些靶點(diǎn)在PPI網(wǎng)絡(luò)中有顯著意義的聯(lián)系作用。其中，TNF節(jié)點(diǎn)最多，可能是健脾清化方中治療2型糖尿病最主要的潛在靶點(diǎn)。TNF-α，IL-6作為重要的炎癥細(xì)胞因子，可能通過葡萄糖代謝及脂代謝等途徑干擾胰島素信號(hào)的傳導(dǎo)，并在胰島素抵抗方面發(fā)揮重用的作用。

圖3 健脾清化方與2型糖尿病靶點(diǎn)韋恩圖

2.5 GO及KEGG靶點(diǎn)通路富集分析

使用數(shù)據(jù)庫(kù)DAVID進(jìn)行相關(guān)的GO功能富集分析，其中得到321個(gè)GO條目（P＜0.01），其P值顯著的前10條見圖4。其中生物過程（biological process,BP）條目215個(gè)，靶標(biāo)數(shù)量前5的分別是一氧化氮生物合成過程的正調(diào)控、藥物反應(yīng)、蛋白質(zhì)磷酸化的正調(diào)控、脂多糖介導(dǎo)的信號(hào)通路、RNA聚合酶Ⅱ啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控。細(xì)胞組成（cellular composition,CC）條目23個(gè)，靶標(biāo)數(shù)量前5的分別是細(xì)胞外間隙、細(xì)胞外區(qū)、血小板α-膜粒膜蛋白、小窩、細(xì)胞質(zhì)核周區(qū)、分子功能（molecular function,MF）條目34個(gè)，靶標(biāo)數(shù)量前5的分別是酶結(jié)合、相同蛋白結(jié)合、細(xì)胞因子活性、蛋白結(jié)合，及轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合。通過KEGG通路富集分析(P＜0.01)的通路有89條，其P值顯著的前20條見圖5，其主要涉及的信號(hào)通路有腫瘤通路、美洲錐蟲病、乙型肝炎、癌癥中的蛋白多糖、膀胱癌、胰腺癌、TNF信號(hào)通路、弓形蟲病、利什曼病、PI3K-Akt信號(hào)通路、HIF-1信號(hào)通路、FoxO信號(hào)通路等。

圖4 健脾清化方治療2型糖尿病相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)圖

圖5 化合物作用靶點(diǎn)的GO富集分析及KEGG通路富集分析

3 討論

現(xiàn)在吳以嶺[3]認(rèn)為2型糖尿病之證多“起于中焦”，指出其治療應(yīng)“從脾論治”的思想；韓煦等[4]比較健脾清化方組與模型對(duì)照組的葡萄糖耐量和胰島素耐量，發(fā)現(xiàn)健脾清化方可改善T2DM大鼠的腸道胰島素抵抗，降低血糖。網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)健脾清化方中有效活性成分中化合物中綜合評(píng)分前7位化合物分別是槲皮素、β-谷甾醇、山奈酚、豆甾醇、刺芒柄花素、黃芩素及木犀草素。研究表明這些化合物對(duì)T2DM具有保護(hù)作用[5-7]。PPI網(wǎng)絡(luò)圖顯示健脾清化方中的有效成分可能是通過TNF、IL-6、VEGF、AKT1、FOS、TP53、EGFR等藥物-疾病共有靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)起作用。炎癥是胰島素抵抗和2型糖尿病代謝紊亂的基礎(chǔ)，促炎細(xì)胞因子包括TNF-α、IL-6等在多種組織中能影響血糖濃度。李俊燕等[8]發(fā)現(xiàn)健脾清化方可通過JAK-STAT、MAPK、VEGF信號(hào)通路中VEGF等基因的表達(dá)來(lái)調(diào)控糖尿病大鼠血液轉(zhuǎn)錄水平，降低糖化血紅蛋白，改善血糖水平。邱艷等[9]通過采用高脂喂養(yǎng)聯(lián)合腹腔注射小劑量鏈脲佐菌素（streptozotocin,STZ）對(duì)Wistar大鼠進(jìn)行造模，連續(xù)4周灌胃給藥，觀察各組大鼠的隨機(jī)血糖水平，發(fā)現(xiàn)用健脾清化方處理后能夠增加肝臟中的GSK3β磷酸化水平和降低GS的磷酸化水平，進(jìn)一步促進(jìn)肝臟糖原合成，使糖尿病大鼠的血糖降低。健脾清化方對(duì)2型糖尿病患者有較好的調(diào)控作用，其作用的物質(zhì)基礎(chǔ)可能涉及NO生物合成過程的正調(diào)控，藥物反應(yīng)，蛋白質(zhì)磷酸化的正調(diào)控，脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）介導(dǎo)的信號(hào)通路等生物學(xué)調(diào)控過程，與腫瘤、美洲錐蟲病、乙型肝炎等通路密切相關(guān)。目前研究表明，高血糖、高胰島素血癥、胰島素抵抗、胰島素樣生長(zhǎng)因子、多種脂肪細(xì)胞因子、氧化應(yīng)激及慢性炎癥在糖尿病誘發(fā)惡性腫瘤的過程中起重要作用[10-12]。

綜上所述，本研究基于網(wǎng)絡(luò)分析對(duì)健脾清化方中其中所含的化學(xué)成分、作用靶標(biāo)及其關(guān)鍵藥效成分進(jìn)行分析，初步探索了健脾清化方用于治療2型糖尿病的作用機(jī)制，但基于及中藥成分的復(fù)雜性和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的局限性，還需要通過藥效學(xué)評(píng)價(jià)等實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步深入研究，為中醫(yī)藥治療2型糖尿病提供一定的理論基礎(chǔ)與科學(xué)依據(jù)。