基于網絡藥理學的健脾清化方治療2型糖尿病的作用機制研究

唐勵靜，申利賢，吳廣，王梅，李榮

南華大學附屬第二醫院，南華大學衡陽醫學院，臨床藥學科，湖南衡陽 421001

2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus,T2DM）是一種多因素引起具有遺傳易感性的內分泌代謝性疾病，主要特征為慢性高血糖。《中國心血管健康與疾病報告2020》[1]報道在2015—2017年，中國成年人糖尿病患病率為11.2%，其中大陸成人患糖尿病人數約為1.298億。在中醫學中，糖尿病有其專屬的名稱，被稱為“消渴病”或糖絡病等，并且中醫藥在治療糖尿病、防治并發癥中有獨特的優勢和作用，《中國2型糖尿病防治指南（2020年版）》進一步明確了中醫藥在糖尿病防治中的重要地位和作用[2]。本研究通過網絡藥理學進一步探討健脾清化方中有效成分和2型糖尿病的作用靶點及通路，闡述其可能潛在的作用機制，為中醫藥治療2型糖尿病提供理論基礎與科學依據的支持。現報道如下。

1 材料與方法

1.1 藥物成分與靶點篩選方法

通過TCMSP數據庫，網站搜索地址為http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php，檢索健脾清化方中“山藥”“葛根”“黃 芪”“黨 參”“黃 芩”“黃 連”“黃 精”“鬼 箭 羽”的化學成分。以口服生物利用度OB≥30%和類藥性DL≥0.18為閾值篩選出相應化合物的活性成分，利用TCMSP數據庫中的選項Related Targets-對篩選到的活性成分有關的靶點進行預測分析。標準基因名稱使用UniProt(http://www.uniprot.org)的數據庫篩選有效化合物對應的作用靶點命名。

1.2 藥材-化合物-靶點網絡圖的構建

健脾清化方中有效的化合物信息和作用靶點使用Cytoscape3.7.2軟件處理，有效化合物和作用靶點的標示用“節點”表示，用“邊”表示二者之間的作用關系。通過網絡拓撲學進一步分析，以等級值（Degree）、親中心度值（closeness centrality）、中介中心度（betweenness centrality）來顯示“節點”程度的重 要 性，Betweenness和Degree centrality的 數 值 越大，證明在網絡中該“節點”越重要，以degree≥2倍中位數為篩選條件選擇關鍵靶點。

1.3 2型糖尿病的靶點信息篩選

使用GeneCard數據庫和OMIM數據庫，網站搜索地址分別為https://www.genecards.org/和https://www.omim.org/，以關鍵詞“Type 2 diabetes mellitus”進行檢索，取交集為2型糖尿病的靶點。

1.4 潛在作用靶點的獲取

通過Venny2.1平臺分別錄入1.1中所得的有效成分靶點和2型糖尿病的相關靶點，繪制韋恩圖，得到相互交集的靶點蛋白即為健脾清化方治療2型糖尿病的潛在作用靶點。

1.5 PPI網絡的構建

使用STRING網站地址為https://string-db.org/，將以上潛在作用靶點基因導入，在STRING網站中設 定 屬 性 為“Homo sapiens”，meaning of network edges設為“confidence”“minimum required interaction score:”設 為“0.95”，display simplifications設 置 為“hide disconnected nodes in the network”“minimum required interaction score:”設為“0.95”，其余參數為系統默認，在此基礎上建立PPI網絡。用Cytoscape Version 3.7.2軟件對PPI關系進行可視化處理，以便于獲得PPI網絡；按degree大小順序篩選靶標基因。

1.6 GO及KEGG靶點通路富集分析

使用DAVID數據庫，搜索網址為https://david.ncifcrf.gov/home.jsp，將靶基因導入，將輸入得到的靶基因名稱列表，所有靶基因名稱按照官方名稱（official gene symbol）進行校正，并限定物種為Homo Sapiens，通過以上數據庫檢索以及轉化的操作，以P＜0.01進行GO生物學過程和KEGG信號通路富集分析，并用Origin軟件和R語言將其結果繪制成柱狀圖與氣泡圖進行可視化。

2 結果

2.1 藥物的活性化合物成分及篩選

通過TCMSP數據庫檢索健脾清化方共有563個化合物，其中黨參134個、黃芪87個、山藥71個、葛根18個、黃芩143個、黃連48個、黃精38個、鬼箭羽24個，經OB≥30%并且DL≥0.18為閾值篩選得到活性成分共有131個，其中黨參21個、黃芪20個、山藥16個、葛根4個、黃芩36個、黃連14、黃精12個以及鬼箭羽8個。刪除16個重復化合物數據，共獲取115個有活性成分。活性化合物基本信息見圖1。

2.2 藥材-化合物-靶點網絡圖的構建

TCMSP數據庫顯示的Related Targets進行預測，得到115個活性成分相關靶點，收集到257個未重復的化合物及其靶點。使用Cytoscape3.7.2軟件將之前獲取的有效化合物和作用靶點信息對其建立關于有效化合物-作用靶點網絡，見圖2。網絡總共包括396個節點（8種藥材節點、131個化合物節點和257個靶點節點）與2267條邊，分別為黨參、黃芪、山藥、葛根、黃芩、黃連、黃精、鬼箭羽及其化合物，中央菱形圖標代表靶標基因，其中形狀△代表藥材，○代表化合物，◇代表基因。其中作用靶點用各節點表示，各作用靶點之間的相互作用關系用每條邊表示，邊數的多少標志該節點對應的作用靶點程度的重要性。結果顯示，Degree值最高的化合物是MOL000098-槲皮素。此外，Degree≥2倍中位數的靶點有MOL000358-β-谷甾醇、MOL000422-山奈酚、MOL000449-豆甾醇、MOL000392-刺芒柄花素、MOL002714-黃芩素和MOL000006-木犀草素，表明以上所述的化合物在整個網絡中發揮非常重要的作用，可能是健脾清化方治療2型糖尿病的核心化合物。

圖2 藥材-化合物-靶標網絡圖

2.3 健脾清化方治療2型糖尿病潛在作用靶點

預測健脾清化方治療2型糖尿病的靶點根據GeneCards數據庫檢索2型糖尿病的治療靶點，按照Score≥50為閾值得到284個2型糖尿病的治療靶點。運用Venny2.1.0平臺將健脾清化方主要活性成分調控的靶點與2型糖尿病的治療靶點取交集，得到67個健脾清化方治療2型糖尿病的靶點，見圖3。

2.4 PPI網絡

用STRING平臺對藥物和疾病映射得到的67個交集基因進行PPI網絡分析，在Cytoscape Version3.7.2軟件中將PPI關系導入后進行可視化處理見圖4。由圖3可知，該網絡共有67個節點和164條邊，其中蛋白用節點表示，連接到1個節點的線條數用度值表示，因此網絡中每個節點的重要性得到合理的評估。PPI網絡圖中平均局部聚類系數為0.41，平均節點度為4.9。在平均度值以上的靶蛋白有23個，其中，排名前十的靶點分別為腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor,TNF）、白介素-6（interleukin-6,IL-6）、血管內皮生長因子（vascular endothlial growth factor,VEGF）、AKT1、FOS、TP53、表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor,EGFR）、表皮生長因子（epidermal growth factor,EGF）、MAPK14和MAPK1，這些靶點在PPI網絡中有顯著意義的聯系作用。其中，TNF節點最多，可能是健脾清化方中治療2型糖尿病最主要的潛在靶點。TNF-α，IL-6作為重要的炎癥細胞因子，可能通過葡萄糖代謝及脂代謝等途徑干擾胰島素信號的傳導，并在胰島素抵抗方面發揮重用的作用。

圖3 健脾清化方與2型糖尿病靶點韋恩圖

2.5 GO及KEGG靶點通路富集分析

使用數據庫DAVID進行相關的GO功能富集分析，其中得到321個GO條目（P＜0.01），其P值顯著的前10條見圖4。其中生物過程（biological process,BP）條目215個，靶標數量前5的分別是一氧化氮生物合成過程的正調控、藥物反應、蛋白質磷酸化的正調控、脂多糖介導的信號通路、RNA聚合酶Ⅱ啟動子轉錄的正調控。細胞組成（cellular composition,CC）條目23個，靶標數量前5的分別是細胞外間隙、細胞外區、血小板α-膜粒膜蛋白、小窩、細胞質核周區、分子功能（molecular function,MF）條目34個，靶標數量前5的分別是酶結合、相同蛋白結合、細胞因子活性、蛋白結合，及轉錄因子結合。通過KEGG通路富集分析(P＜0.01)的通路有89條，其P值顯著的前20條見圖5，其主要涉及的信號通路有腫瘤通路、美洲錐蟲病、乙型肝炎、癌癥中的蛋白多糖、膀胱癌、胰腺癌、TNF信號通路、弓形蟲病、利什曼病、PI3K-Akt信號通路、HIF-1信號通路、FoxO信號通路等。

圖4 健脾清化方治療2型糖尿病相互作用（PPI）網絡圖

圖5 化合物作用靶點的GO富集分析及KEGG通路富集分析

3 討論

現在吳以嶺[3]認為2型糖尿病之證多“起于中焦”，指出其治療應“從脾論治”的思想；韓煦等[4]比較健脾清化方組與模型對照組的葡萄糖耐量和胰島素耐量，發現健脾清化方可改善T2DM大鼠的腸道胰島素抵抗，降低血糖。網絡分析結果發現健脾清化方中有效活性成分中化合物中綜合評分前7位化合物分別是槲皮素、β-谷甾醇、山奈酚、豆甾醇、刺芒柄花素、黃芩素及木犀草素。研究表明這些化合物對T2DM具有保護作用[5-7]。PPI網絡圖顯示健脾清化方中的有效成分可能是通過TNF、IL-6、VEGF、AKT1、FOS、TP53、EGFR等藥物-疾病共有靶點網絡起作用。炎癥是胰島素抵抗和2型糖尿病代謝紊亂的基礎，促炎細胞因子包括TNF-α、IL-6等在多種組織中能影響血糖濃度。李俊燕等[8]發現健脾清化方可通過JAK-STAT、MAPK、VEGF信號通路中VEGF等基因的表達來調控糖尿病大鼠血液轉錄水平，降低糖化血紅蛋白，改善血糖水平。邱艷等[9]通過采用高脂喂養聯合腹腔注射小劑量鏈脲佐菌素（streptozotocin,STZ）對Wistar大鼠進行造模，連續4周灌胃給藥，觀察各組大鼠的隨機血糖水平，發現用健脾清化方處理后能夠增加肝臟中的GSK3β磷酸化水平和降低GS的磷酸化水平，進一步促進肝臟糖原合成，使糖尿病大鼠的血糖降低。健脾清化方對2型糖尿病患者有較好的調控作用，其作用的物質基礎可能涉及NO生物合成過程的正調控，藥物反應，蛋白質磷酸化的正調控，脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）介導的信號通路等生物學調控過程，與腫瘤、美洲錐蟲病、乙型肝炎等通路密切相關。目前研究表明，高血糖、高胰島素血癥、胰島素抵抗、胰島素樣生長因子、多種脂肪細胞因子、氧化應激及慢性炎癥在糖尿病誘發惡性腫瘤的過程中起重要作用[10-12]。

綜上所述，本研究基于網絡分析對健脾清化方中其中所含的化學成分、作用靶標及其關鍵藥效成分進行分析，初步探索了健脾清化方用于治療2型糖尿病的作用機制，但基于及中藥成分的復雜性和網絡藥理學的局限性，還需要通過藥效學評價等實驗進一步深入研究，為中醫藥治療2型糖尿病提供一定的理論基礎與科學依據。