豇豆中5種農藥及其代謝物殘留檢測與膳食風險評估

張 群 段 云 馬 晨 田 海 郇志博 吳曉鵬

〔中國熱帶農業科學院分析測試中心，農業農村部亞熱帶果品蔬菜質量安全控制重點實驗室，海南省熱帶果蔬產品質量安全重點實驗室，農業農村部熱作產品質量安全風險評估實驗室（海口），海南海口 571101〕

豇豆〔（Linn.）Walp.〕又名帶豆、豆角等，廣泛生長于熱帶、亞熱帶地區，嫩莢可炒食、涼拌、泡食或腌漬曬干食用，種子可代糧和做餡料，營養豐富，是海南省大宗瓜菜種類之一，也是冬季重要的反季節瓜菜種類，海南省年栽培面積約133.33 萬hm，總產量25 萬t 左右（張群 等，2021）。豇豆為連續采收作物，花期和收獲期并存，病蟲害爆發幾率更高。農業農村部熱作產品質量安全風險評估實驗室（海口）調研發現，海南省豇豆生產中滅蠅胺和多菌靈的使用頻率非常高。呂岱竹等（2018）研究表明，滅蠅胺是海南省豇豆防治斑潛蠅的主要用藥之一，且滅蠅胺殘留易超標；李祖蒞和袁偉方（2017）研究表明，多菌靈可用于防治豇豆枯萎病；此外，氟蟲腈、克百威、涕滅威是對人體健康存在高風險的禁限用農藥（王連森 等，2016）；因此，這些農藥常被列為蔬菜農殘的監測對象（龔久平 等，2018）。

國內外普遍關注農產品中農藥殘留問題，但對農藥代謝產物的研究較少。滅蠅胺在植物體內可通過脫烷基作用代謝為三聚氰胺（王京文 等，2011；Liu et al.，2015），其對動物及人體造成腎衰竭從而有害健康（孫貴朋 等，2008）。多菌靈雖被劃分為低毒農藥，但越來越多的研究表明多菌靈易對動物、植物、浮游生物、土壤微生物及人類健康產生危害（魏中華 等，2015；Jiang et al.，2015；徐信燡和施春雷，2019）。2-氨基苯并咪唑是多菌靈在植物體內降解代謝的主產物，其短期毒性與母體多菌靈相同，但是急性毒性更嚴重（郝露露，2013；劉超 等，2018）。我國食品安全國家標準GB 2763—2021《食品中農藥最大殘留限量》中規定了涕滅威、氟蟲腈和克百威的殘留物檢測標準：以涕滅威及其氧類似物（砜、亞砜）之和表示涕滅威；氟甲腈、氟蟲腈、氟蟲腈硫醚、氟蟲腈砜之和表示氟蟲腈；克百威及3-羥基克百威之和表示克百威。近年來，關于滅蠅胺、多菌靈、涕滅威、氟蟲腈、克百威這5 種農藥及其代謝物的檢測方法主要有氣相色譜法（司富美 等，2019；張春萍 等，2020）、液相色譜法（金曉峰 等，2020；吳新華 等，2020）、光譜分析法（吳鳳蓮，2019）、免疫分析法（蔣文慧 等，2021）和電化學傳感器技術（Cui et al.，2017）等，以具有靈敏度高和分析速度快的超高效液相色譜-串聯質譜法（UPLC-MS/MS）為主。

目前，測定農作物農藥殘留的UPLC-MS/MS方法比較成熟，但是農藥代謝物殘留檢測方法的報道較少。QuEChERS 法是一類快速、簡便、經濟、高效、耐用和安全的樣品前處理方法，常用于植物產品器官農藥殘留檢測。本試驗采用QuEChERS技術進行樣品前處理，通過優化色譜-質譜條件，建立了一次同時提取、正負離子模式同時測定豇豆中5 種農藥及其代謝物含量的檢測方法，并利用該方法對海南省市售豇豆樣品進行檢測分析，初步評估了豇豆中所檢出農藥的慢性和急性膳食攝入風險情況，以期為保障人體健康提供技術和數據支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豇豆購于海南市場，采樣時間為2020 年11 月至2021 年2 月，采樣地點為三亞、樂東、澄邁、陵水、儋州、海口，采樣量為238 份。取豇豆鮮樣1 000 g，經高速勻漿機勻漿后混勻，裝入潔凈的密封罐中，標明編號，于-20 ℃保存。1 個月內完成樣品檢測，檢測地點為農業農村部熱作產品質量安全風險評估實驗室（海口）。

試驗用到的標準物質滅蠅胺、多菌靈、氟蟲腈、克百威、涕滅威、三聚氰胺、2-氨基苯并咪唑、氟甲腈、氟蟲腈砜、氟蟲腈硫醚、3-羥基克百威、涕滅威砜、涕滅威亞砜均購于農業部環境質量檢驗測試中心（天津），純度≥ 99%。甲醇、乙腈購于美國Fisher 公司，HPLC 級；乙酸銨購于廣州化學試劑廠，分析純。分散SPE 試劑盒（2 mL，150 mg MgSO、25 mg PSA、2.5 mg GCB）、萃取鹽包（0.5 g 半水檸檬酸氫二鈉、1 g 二水合檸檬酸三鈉、1 g NaCl、4 g MgSO）購于Agilent公司。

1.2 儀器與設備

超高效液相色譜-串聯質譜儀（UPLC-MS/MS）（TRIPLE QUAD6500）為美國SCIEX 公司生產，電子天平（EB-280-12）為日本島津公司生產，去離子水純化系統（Milli-Q）為美國Millipore 公司生產，高速勻漿機（T25 basic）為廣州儀科實驗技術有限公司生產，離心機（TGL 16M）為湖南凱達科學儀器有限公司生產，旋渦混合器（QL-901）為江蘇海門其林醫用儀器廠生產。

1.3 試驗方法

1.3.1 超高效液相色譜條件 采用ACQUITY UPLCBEH C色譜柱（Waters 公司，2.1 mm × 50 mm，1.7 μm），選用3 種流動相，分別為：A 相為乙腈、B 相為1.0 mmol·L乙酸銨水溶液，A 相為乙腈、B 相為超純水和A 相為甲醇、B 相為1.0 mmol·L的乙酸銨水溶液。柱溫40 ℃，進樣量1 μL，流動相的梯度洗脫程序見表1。

表1 流動相梯度洗脫程序

1.3.2 質譜條件 檢測模式：多反應監測模式（MRM）；電離方式：正離子掃描（ESI）、負離子掃描（ESI）；氣簾氣：40 psi；碰撞氣：8 psi；離子噴霧電壓：5 500 V；離子源溫度：550 ℃。通過優化定量、定性離子對的碰撞能量和錐孔電壓，得到優化后的化合物質譜參數見表2。

表2 5 種農藥及其代謝物的質譜條件

1.3.3 樣品處理 稱取10.00 g 豇豆樣品（精確至0.01 g），放置于50 mL 離心管中，加入20.0 mL 乙腈，在旋渦混合器上以2 500 r·min的速率振蕩3 min，之后在萃取管中加入萃取鹽包并渦旋2 min，萃取管在4 000 r·min條件下離心5 min，使水相和乙腈相分離。將1.8 mL 上清液轉移至含分散SPE 試劑的2 mL 凈化管中，在旋渦混合器上以2 500 r·min的速率振蕩3 min，然后將凈化管在10 000 r·min條件下離心5 min。分別取凈化后的1 mL 上清液與1 mL 超純水在5 mL 聚丙烯離心管中混合均勻，經有機系微孔濾膜（天津市津騰實驗設備有限公司，50 mm/0.22 μm）過濾后待儀器檢測。

1.3.4 標準溶液與混合基質標準溶液的配制 標準溶液配制：分別用甲醇溶解5 種農藥及其代謝物，配制成濃度為100 mg·L的標準儲備液，-20 ℃冷凍避光保存。

混合基質標準溶液配制：將豇豆空白樣品（未檢出待測化合物的樣品）按1.3.3 中樣品處理方法配制成空白基質溶液，用空白基質溶液將標準儲備液稀釋成濃度分別為100、75、50、25、10、5、1 μg·L的定量標準品混合溶液，現配現用。

1.3.5 加標回收試驗 分別稱取3 組豇豆空白樣品（未檢出待測農藥及其代謝物的樣品）10.00 g，每組5 個重復。在豇豆空白樣品中分別添加濃度水平為10、25、50 μg·kg的標準溶液，按照上述方法進行分析檢測并計算添加回收率。

1.4 數據分析

1.4.1 基質效應 基質是指樣品中除分析物外的其他成分，基質成分的存在對分析結果產生干擾，可以通過計算基質效應（matrix effect，ME）來表示受基質的干擾程度（樂淵 等，2020）。

式中，ME 為基質效應，為化合物在豇豆混合基質標準溶液中校正曲線的斜率，為化合物在標準溶液中校正曲線的斜率。ME=0，表示不存在基質效應；ME ＜0，表示分析物受基質影響為抑制效應；ME ＞ 0，表示分析物受基質影響為增強效應；ME ＜-50%或ME ＞ 50%，表示受基質干擾程度強烈；-50% ≤ ME ＜-20%或20%＜ME ≤ 50%，表示受基質干擾程度中等；-20% ≤ME ≤ 20%，表示受基質干擾程度較低。

1.4.2 膳食攝入風險評估 慢性膳食攝入風險評估是基于整個生命周期的暴露方式，通常以膳食中可能涉及的所有食物中農藥殘留量的平均值或中位值進行計算；急性膳食攝入風險評估是基于1 餐或1 d 內的膳食攝入量，一般可考慮采用1 種食品中農藥的MRL 值進行計算（馬晨 等，2021）。

式中，表示農藥殘留中位值（中位值為一組數據中間位置的數據或中間兩位數據的平均值）；表示我國居民豇豆的日平均攝入量（表3）；表示我國不同年齡、性別組人群的平均體重（表3）；表示每日允許攝入量（GB 2763—2021）。

式中，表示最高殘留量；表示大份餐，指某類食物1 餐的最大消費量，一般以日消費量的97.5 百分位點值為準，表示以可食部分計的單個產品的質量，參考WHO 全球環境污染物監測規劃/食品污染監測與評估項目（GEMs/Food）的數據（https：//cdn.who.int/media/docs/default-source/foodsafety/gems-food/iesti_calculation21_dataoverview.xlsx?sfvrsn=ec9f2eb1_7），取最大值為0.388 2 kg·d，為0.019 4 kg·d；為變異因子，表示一批產品中不同個體或同一個體中不同部位的殘留變異，一般取3；表示我國不同年齡、性別組人群的平均體重（表3）；表示急性參考劑量（聯合國糧農組織與世界衛生組織聯席會議報告https：//www.fao.org/fileadmin/templates/agphome/documents/Pests_Pesticides/JMPR/JMPR05report.pdf；聯合國糧農組織與世界衛生組織聯席會議報告，https：//www.fao.org/fileadmin/templates/agphome/documents/Pests_Pesticides/JMPR/JMPRreport2006.pdf）。

表3 我國不同年齡、性別組人群的平均體重及豇豆日平均攝入量（吳永寧和李筱薇，2015）

風險程度判定標準（吳永寧和李筱薇，2015）：＜ 50%時無風險，50%～100%時攝入安全但有潛在風險，＞ 100%時存在風險，＞ 150%時存在較大風險，＞ 200%時存在很大風險。

2 結果與分析

2.1 色譜條件優化

比較不同的流動相：A 相為乙腈、B 相為1.0 mmol·L乙酸銨水溶液；A 相為乙腈、B 相為超純水和A 相為甲醇、B 相為1.0 mmol·L乙酸銨水溶液對化合物出峰情況的影響。結果表明：以A相為乙腈、B 相為超純水時，2-氨基苯并咪唑、三聚氰胺和涕滅威亞砜不出峰；以A 相為乙腈、B 相為1.0 mmol·L乙酸銨水溶液時，滅蠅胺、氟蟲腈硫醚、氟甲腈的峰分離度不好；以A 相為甲醇、B 相為1.0 mmol·L乙酸銨水溶液時，在MRM 模式下，5 種農藥及其代謝物混合基質標準溶液（50 μg·L）的定量、定性離子對的色譜圖如圖1～5所示，各化合物的峰形尖銳、分離度高，識別度強。

圖1 滅蠅胺及其代謝物三聚氰胺的標準色譜圖

圖2 多菌靈及其代謝物2-氨基苯并咪唑的標準色譜圖

圖3 克百威及其代謝物3-羥基克百威的標準色譜圖

圖4 氟蟲腈及其代謝物氟甲腈、氟蟲腈砜、氟蟲腈硫醚的標準色譜圖

圖5 涕滅威及其代謝物涕滅威砜和涕滅威亞砜的標準色譜圖

2.2 基質效應和方法驗證

按1.3.4 所述配制范圍在1～100 μg·L內7個濃度梯度的混合基質標準溶液。在1.3.2 的檢測條件下，儀器計算的線性方程見表4。結果表明，在1～100 μg·L范圍內，線性相關系數均大于0.999，峰面積與進樣濃度的線性關系良好。豇豆中滅蠅胺等5 種農藥及其代謝物的基質效應見表4。結果表明，滅蠅胺及其代謝物三聚氰胺，多菌靈及其代謝物2-氨基苯并咪唑均表現為基質抑制效應，干擾程度較低。氟蟲腈及其代謝物氟甲腈、氟蟲腈砜和氟蟲腈硫醚，克百威及其代謝物3-羥基克百威，涕滅威及其代謝物涕滅威亞砜和涕滅威砜則表現為基質增強效應，除代謝物氟蟲腈硫醚、3-羥基克百威和涕滅威砜受中等程度基質干擾外，其他均為較低基質干擾。這些干擾不僅與農藥本身結構和儀器離子源結構有關系，也與基質的性質有關。消除基質效應所帶來的干擾的方法主要包括同位素內標法、使用分析保護試劑、基質匹配標準溶液和標準添加法等，本試驗采用基質匹配標準溶液來消除部分基質帶來的影響。

在10、25 μg·kg和50 μg·kg的3 個添加濃度下，豇豆中5 種農藥及其代謝物的平均回收率在80.3%～103.1%范圍內；相對標準偏差（RSD）范圍為1.7%～9.2%，可以滿足定量分析要求（表4）。5 種農藥及其代謝物的回收率符合NY/T 788—2004《農藥殘留試驗準則》中檢測方法開發要求：0.01 mg·kg≤添加濃度≤ 0.1 mg·kg時，平均回收率范圍在70%～110%之間，相對標準偏差（RSD）≤ 20%。

表4 驗證試驗結果（n=5）

通過實際添加回收試驗最終確定豇豆中涕滅威及其代謝物涕滅威砜和涕滅威亞砜的定量限為0.010 mg·kg，其他4 種農藥及其代謝物的定量限為0.005 mg·kg，平均回收率范圍為72.3%～86.3%，相對標準偏差（RSD）范圍為6.8%～12.5%。5 種農藥及其代謝物的平均回收率符合《農藥殘留試驗準則》中檢測方法開發要求：0.001 mg·kg＜添加濃度≤ 0.01 mg·kg時，則60% ＜平均回收率≤ 120%，相對標準偏差（RSD）≤ 30%，本方法的定量限都滿足我國、歐盟和日本豇豆中5 種農藥的最大殘留限量（MRL）檢測的要求（表5）

表5 國際規定的5 種農藥在豇豆（或豆類）中的最大殘留限量值（MRL） mg·kg-1

2.3 實際樣品檢測

利用該方法測定了海南省2020 年11 月至2021 年2 月共計238 份樣品中5 種農藥及其代謝物的殘留量，陽性樣品率為51.7%，其中單獨檢出多菌靈16 例，單獨檢出滅蠅胺68 例，檢出多菌靈和滅蠅胺混合36 例，滅蠅胺和代謝物三聚氰胺混合1 例，多菌靈、滅蠅胺和代謝物三聚氰胺混合1 例。滅蠅胺的檢出率為44.5%，檢出濃度范圍為0.011～1.221 mg·kg；依據我國現有GB 2763—2021 標準，豇豆上滅蠅胺的MRL 值為0.5 mg·kg，判定豇豆樣品中滅蠅胺的超標率為6.3%；滅蠅胺代謝物三聚氰胺的檢出率為0.8%，檢出濃度范圍為0.001～0.009 mg·kg。多菌靈的檢出率為22.3%，檢出濃度范圍為0.009～0.286 mg·kg；鑒于我國目前尚未制定多菌靈在豇豆中的MRL 標準，因此無法計算超標率；參考較為嚴格的歐盟MRL 標準（0.2 mg·kg），則豇豆樣品中多菌靈殘留超標率為2.1%。

2.4 膳食攝入風險評估

基于實際樣品檢測的農藥殘留中位值計算得到的豇豆中滅蠅胺、多菌靈殘留量對不同人群慢性膳食攝入風險范圍為0.057 6%～0.131 4%（表6），遠小于100%，說明海南省豇豆中農藥殘留對慢性膳食攝入風險的貢獻極小。不同年齡段人群的%ADI值大小符合2～7 歲＞ 8～12 歲＞ 13 歲以上的規律，這是由于2～7 歲、8～12 歲的兒童體重低及攝入量少造成的；除去2～7 歲、8～12 歲兩個年齡段，對相同性別不同年齡段人群的%ADI 值進行比較發現，20～50 歲人群的%ADI 值最高，這是由于此年齡段的攝入量與體重比值最高引起的；不同性別、相同年齡段人群的%ADI 值大小符合女性＞男性這一規律，這是由于女性的體重輕于男性導致的。

表6 滅蠅胺、多菌靈在我國不同年齡、性別組人群中的慢性膳食攝入風險

基于實際樣品檢測的農藥殘留最大值計算得到的豇豆中滅蠅胺、多菌靈殘留量對不同人群急性膳食攝入風險范圍為0.375 8%～29.126 6%（表7），小于100%，說明海南省豇豆中農藥殘留對急性膳食攝入風險處于風險可接受范圍內。由于不同年齡、性別組人群中的%ARfD 值與人群的體重成反比，因此2～7 歲年齡段的%ARfD 值最高。

表7 滅蠅胺、多菌靈在我國不同年齡、性別組人群中的急性膳食攝入風險

3 討論與結論

本試驗建立了豇豆中5 種農藥及其代謝物快速檢測的方法—QuEChERS 法結合超高效液相色譜-串聯質譜法。該方法可有效排除基質干擾，定量限可以滿足我國、歐盟和日本等國豇豆中5 種農藥最大殘留限量的檢測要求。利用該方法對海南省238 份豇豆樣品進行檢測，陽性樣品率為51.7%，檢出農藥為多菌靈和滅蠅胺及其代謝物三聚氰胺。利用2020 年11 月至2021 年2 月海南省豇豆主產區豇豆的農藥殘留量檢測數據以及我國居民不同年齡段的豇豆膳食數據對豇豆中滅蠅胺和多菌靈農藥殘留進行風險評估的研究，結果表明慢性膳食攝入風險很低（%ADI ＜1%），急性膳食攝入風險低（%ARfD ＜30%），表明我國各類人群的滅蠅胺和多菌靈膳食攝入風險是可接受的。2～7 歲兒童的膳食攝入風險明顯高于其他年齡段，主要是由于此年齡段的體重較輕引起的。此外，Huan 等（2015）研究表明，漂燙（5 min）是豇豆最安全的家庭加工方式，其次是爆炒（3 min），說明在吃蔬菜前對蔬菜進行加熱可以降低農藥膳食攝入風險。早在1999 年JMPR 就正式開始對食品中農藥殘留進行慢性膳食攝入評估，2015 年我國農業農村部開始實施《食品中農藥殘留風險評估指南》（2308 號公告）（馬晨 等，2021）。目前我國的膳食數據尚不完善，本試驗的膳食數據參考自《第四次中國總膳食研究》（吳永寧和李筱薇，2015），這項研究是2007 年我國總膳食的全面總結，其中豇豆消費量是根據已有豇豆消費數據（遼寧省、上海市、湖北省和福建省）計算所得，尚缺乏海南省數據，因此可能會隨著消費水平的提升而有所變化。本試驗基于JMPR 推薦的風險評估方法對豇豆上農藥殘留的膳食攝入風險進行了評估，但本試驗獲取的農藥殘留數據量是有限的，且我國膳食數據不完善，膳食攝入風險評估方法也還存在不確定因素，同時也未考慮農藥多殘留的聯合暴露風險，因此還需一步完善和研究。

在中國農藥信息網（http：//www.chinapesticide.org.cn/hysj/index.jhtml）查詢滅蠅胺和多菌靈的登記信息，發現滅蠅胺和多菌靈均未在豇豆上登記，其中滅蠅胺有登記用于防治菜豆的美洲斑潛蠅，而多菌靈可防治大豆根腐病。實際情況是這兩種農藥檢出率較高，說明其有一定的需求，故建議種植戶在豇豆上合理使用這兩種農藥，并建議相關部門對這兩種農藥在豇豆上是否符合農藥登記進行評估。我國國家標準對豇豆上多菌靈的最大殘留限量無明確規定，建議相關部門制定適合我國國情、科學合理、保障公眾健康的限量標準，為風險防控和政府監管提供重要依據。