黃腐酸對酒精所致胃潰瘍小鼠胃蛋白活力的影響

陳崇蓮 戴偉鋒 秦 誼 李寶才 張 敉

昆明理工大學生命科學與技術學院 昆明 650500

胃黏膜損傷（Gastric mucosal damage）是一系列外源性或內源性攻擊因子進入胃內刺激胃黏膜所導致的炎癥反應，胃黏膜屏障功能被攻擊因子侵襲及胃腺體結構受到破壞時可誘發黏膜損傷。胃黏膜受損時，胃發生一定病變如胃炎、胃潰瘍，當治療不充分時，胃炎及胃潰瘍往往發展為胃癌。其中藥物刺激[1～4]、幽門螺旋桿菌感染[5～7]、應激創傷[8，9]、抽煙酗酒[10，11]等往往是胃黏膜損傷的主要誘因。據世界衛生組織報告顯示：消化系統疾病致死人群中，因飲酒所致的占21.3%。而全球飲酒者的比例在上升[12，13]。人們飲酒后，酒精首先與胃黏膜接觸，對胃黏膜病理生理的影響十分顯著[14]。大量文獻研究表明，攝入濃度為14%的乙醇即可破壞胃黏膜屏障，使其形態與功能發生改變[15，16]。酒精對胃黏膜損傷明確，黏膜呈非特異性病變，目前已普遍用作動物實驗模型，用于藥理研究，藥效評估，探討胃黏膜急性損傷的病理生理機制[17]。

黃腐酸（FA）是腐植酸（HA）[18]中分子量較低，含氧官能團較多，水溶性最好的部分，因此也被稱為“藥用黃腐酸”[19]。現代藥理作用研究表明：黃腐酸具有止瀉[20，21]、抗氧化[22，23]、抗炎[24，25]、抗潰瘍[26～29]等活性。我國河南鞏義制藥廠（現更名為江蘇平光信誼中藥有限公司）率先從煤炭中提取出黃腐酸并制成了口服液，用于治療胃寒、胃痛、胃及十二指腸出血。

為進一步探索黃腐酸對胃黏膜損傷的保護機制，本文基于黃腐酸功效，運用酒精所致小鼠胃黏膜損傷模型，從產自黑龍江寶清（BQ）、云南彌勒（ML）和建水（JS）3 地褐煤中提取制備黃腐酸，并分析3 地煤樣及黃腐酸的理化性質，測定黃腐酸對胃黏膜損傷中小鼠胃蛋白酶活力的影響，以期為探索黃腐酸保護胃黏膜機制提供研究數據。

1 材料與方法

1.1 材料與實驗動物

1.1.1 材料

根據文獻報道方法[30]，從產自黑龍江寶清、云南彌勒和建水的褐煤中提取制備了黃腐酸樣品，編號分別為BQ-FA、ML-FA 和JS-FA。

1.1.2 實驗動物

清潔級昆明小鼠，雄性，體重22±2 g，購自昆明醫科大學實驗動物中心。所有動物飼養于25 ℃環境中，白天晝夜12 h 交替，給予充足的食物，適應1 周后開始實驗，所有動物實驗均嚴格遵守動物實驗倫理委員會制定的操作原則。

1.2 試劑與儀器

酒精（分析純）、PBS 磷酸緩沖液、超純水、胃蛋白酶試劑盒（南京建成生物工程研究所）、枸櫞酸鉍鉀膠囊（湖南華納大藥廠股份有限公司）、BCA 蛋白濃度測定試劑盒（上海碧云天生物技術研究所）、鑷子、灌胃針、燒杯、電子天平、離心機、酶標儀、移液槍及槍頭、EP 管。

1.3 實驗溶液的配制

枸櫞酸鉍鉀的配制：本實驗規格每粒含枸櫞酸鉍鉀0.3 g（相當于鉍100 mg）。故取開膠囊殼，將膠囊溶于10 mL 純水中，得到濃度為10 mg/mL的溶液。

黃腐酸樣品的配制：準確稱取BQ-FA、MLFA、JS-FA 樣品400.00 mg，溶于10.00 mL 純水中，得到40 mg/mL 的母液。

采用灌胃給藥方式，給藥前稱重小鼠，按小鼠體重給藥，所有藥品灌胃時濃度按1 mL/100 g體重，均為給藥當天配制。

1.4 實驗方法

1.4.1 煤樣及黃腐酸理化性質分析

參照文獻報道方法[30]對煤樣和所提取的黃腐酸進行理化性質分析。

1.4.2 黃腐酸的精制

取型號為001×7 的陽離子樹脂，用去離子水進行浸泡，使其膨脹，待充分膨脹之后，去離子水清洗干凈，把水分濾干，用無水乙醇浸泡大約8 h，濾干乙醇，再用去離子水清洗樹脂中殘留的無水乙醇，直至去離子水無黃色。用樹脂體積2 ～3 倍的氫氧化鈉和鹽酸多次交替浸泡去離子水清洗，直至樹脂呈中性為止，確保樹脂中不含有氯離子。然后稱取黃腐酸溶解在去離子水里，將溶液的pH 值調節到5，待溶液充分溶解之后，將其放置到4 ℃的冰箱靜置過夜，約12 h，取出溶液，離心，保留黃腐酸上清液，將上清液循環上樣，旋蒸濃縮至黏稠狀，將其轉移至瓷盤中，再將其放入到冷凍干燥器中冷凍干燥，得到精制黃腐酸。寶清、彌勒、建水3 地的黃腐酸精制方法一致。

1.4.3 胃蛋白酶活力測定

48 只小鼠正常喂食適應1 周，隨機分為6 組，每組8 只，分別為空白對照組（未用酒精處理，正常組）、模型組（灌胃酒精0.5 mL/100 g）、陽性藥組（灌胃枸櫞酸鉍鉀）、實驗組（灌胃BQ-FA、ML-FA 和JS-FA）。采用灌胃方式，每日9 時進行，陽性藥組每日給予100 mg/kg 枸櫞酸鉍鉀，連續1 周；實驗組每日分別給予劑量為400 mg/kg 的3 種黃腐酸樣品，連續1 周；空白對照組和模型組每日分別給予同等劑量的生理鹽水，連續1 周。末次給藥前禁食不禁水12 h；第7 天，同上述灌胃后禁水，1 h 后，除空白對照組予0.5 mL/100 g 生理鹽水外，其余各組小鼠均給予劑量為0.5 mL/100 g的酒精；1 h 后，將所有試驗小鼠脫頸處死，剝離胃組織，沿胃大彎將其剖開，用預冷PBS 磷酸緩沖液清洗胃內容物，放-80 ℃備用。

1.5 BCA（Bicinchoninic acid）法蛋白定量

1.5.1 組織樣本前處理

取各組小鼠胃組織，胃組織表面的水分用濾紙吸干。稱取各個組織的相同部分，與PBS 磷酸緩沖液一起勻漿，組織重量（g）：生理鹽水（mL）為1 ∶9，放入3 mm 研磨珠2 顆，4 mm 研磨珠1 顆于研磨儀中4 ℃下研磨40 s 2 次，使組織徹底勻漿化，制成10%的組織勻漿，轉移至離心管中，于2500 rpm，4 ℃下離心10 min，取上清液備用。

1.5.2 標準曲線的建立和樣品蛋白濃度的測定

蛋白標準品的準備：BCA 蛋白濃度測定試劑盒中取出蛋白標準品稀釋液完全溶解蛋白標準品，取蛋白標準品10 μL，用蛋白標準品稀釋液稀釋至100 μL，使終濃度為0.5 mg/mL。

BCA 工作液配制：根據樣品數量，按BCA 蛋白濃度測定試劑盒說明書，取50 體積BCA 試劑A加1 體積BCA 試劑B（50 ∶1）配制適量BCA 工作液，充分混勻。

蛋白濃度測定步驟如下：

a.將標準品按0、2、4、8、12、16 μL 加到96 孔板的標準孔中，加標準品稀釋液補足到20 μL，相當于標準品濃度分別為0、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4 mg/mL。

b.加10 μL 小鼠胃組織樣品到96 孔板的樣品孔中，再加10 μL PBS 磷酸緩沖液補足20 μL。

c.各孔加入200 μL BCA 工作液，37 ℃放置30 min。

d.用酶標儀在562 nm 測定，記錄OD 值。

e.根據標準曲線和樣品體積計算出樣品的蛋白濃度。

1.6 小鼠胃組織中胃蛋白酶活力檢測

本實驗采用胃蛋白酶活力試劑盒檢測小鼠胃組織中胃蛋白酶活力，具體操作如下：

（1）從-80 ℃冰箱取出小鼠胃組織，解凍平衡至室溫。

（2）從4 ℃冰箱取出胃蛋白酶試劑盒平衡至室溫。

（3）準確稱取胃組織重量，按胃組織重量（g）∶6 號勻漿介質（胃蛋白酶活力試劑盒所帶試劑）體積（mL）=1 ∶9 的比例，放入3 mm 研磨珠2 顆，4 mm 研磨珠1 顆，4 ℃下于研磨儀中研磨40 s 2 次，使組織徹底勻漿化，制成10%的組織勻漿，轉移至離心管中，于2500 rpm，4 ℃下離心10 min，取上清液預試后按以下操作測定胃蛋白酶活力。

（4）設置測定管和對照管，酶促反應按表1步驟操作。

表1 酶促反應操作步驟Tab.1 Operation steps of enzymatic reaction mL

將酶促反應所加試劑充分混勻，37 ℃水浴10 min，3500 rpm，離心10 min，取上清液0.3 mL進行顯色反應，操作步驟見表2。

表2 顯色反應操作步驟Tab.2 Operation steps of color reaction mL

將顯色反應中所加試劑充分混勻，37 ℃水浴20 min，波長660 nm，光徑1 cm，蒸餾水調零，測定各管吸光度OD 值。

胃蛋白酶活力的計算公式如下：

組織中胃蛋白酶活力（U/mg prot）=（測定OD值-對照OD 值）/（標準OD 值-空白OD 值）×標準品濃度（50 μg/mL）/反應時間（10 min）×（反應液總體積/ 取樣量）/ 待測樣本蛋白濃度（mg prot/mL）。

1.7 數據分析

使用SPSS 23.0 統計軟件進行數據處理，各組數據以x±s 的形式表示，采用單因素方差分析比較各組間的統計學差異，組間比較用方差分析（LSD 法）。統計圖使用Graphpad prism 8.0 軟件制作，P＜0.05 時認為差異具有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 煤樣及黃腐酸理化性質分析

寶清、彌勒和建水褐煤及其所制備黃腐酸的理化性質如表3、表4 所示。由統計學分析結果可知，3 地褐煤水分、碳含量、黃腐酸得率無顯著性差異（P＞0.05）；而各地褐煤中灰分、總腐植酸含量、游離腐植酸含量、黃腐酸中灰分、精制后黃腐酸灰分存在顯著性差異（P＞0.05）；值得注意的是，3 地黃腐酸精制后的灰分含量比精制前下降明顯。

表3 煤樣理化性質分析Tab.3 Analysis of physicochemical properties of coal samples %

表4 黃腐酸理化性質分析Tab.4 Analysis of physicochemical properties of fulvic acid

2.2 胃組織中蛋白含量的測定

根據上海碧云天生物技術研究所的BCA 蛋白定量試劑盒說明書中的操作步驟，得到蛋白含量標準曲線（圖1）方程為：Y=0.6320X+0.1354（R2=0.9927）。根據標準曲線計算得各組10%胃組織勻漿的蛋白含量（表5）。

圖1 蛋白含量標準曲線Fig.1 Standard curve of protein content

表5 各組小鼠10%胃組織勻漿蛋白含量（n=8）Tab.5 The protein content of 10% gastric homogenate of mice in each group (n=8) mg/mL

2.3 胃組織中胃蛋白酶活力的測定

根據試劑盒說明，測定了各組胃組織勻漿中的胃蛋白酶活力。由圖2 可知，與空白對照組對比，模型組胃蛋白酶活力顯著升高，陽性藥組和各實驗組均有下降趨勢，且有顯著性差異（P＜0.05），推測黃腐酸發揮保護胃黏膜的作用可能與抑制胃蛋白酶活性有關。JS-FA 組與模型組相比，有下降趨勢，但無顯著性差異，這可能是因為提取的褐煤產地不同造成的黃腐酸成分和藥效有一定差異。

圖2 小鼠胃蛋白酶活力測定結果（n=6）Fig.2 Determination results of pepsin activity in mice (n=6)

3 討論

胃黏膜損傷是侵襲因素與胃黏膜防御能力之間失去平衡導致的結果[31]。臨床上常以胃蛋白酶活力水平，作為胃粘膜損傷的評價指標，一般胃蛋白酶活力偏高，則提示胃黏膜發生了損傷。如前文所述，飲酒是引起胃黏膜損傷最常見的原因[13]。本實驗選取了胃蛋白酶活力作為觀察指標，研究酒精誘導型胃黏膜損傷小鼠胃蛋白酶活性的影響。實驗結果表明，BQ-FA、JS-FA、ML-FA 均可使酒精所致的胃潰瘍小鼠胃蛋白酶活性降低，推斷這可能是黃腐酸保護胃黏膜功能的作用機制之一。受試樣品中，BQ-FA 組和ML-FA 組效果較好（P＜0.05）；而JS-FA 組與模型組相比，雖有一定效果但并無顯著性差異（P＞0.05），這可能是提取黃腐酸所用褐煤產地、成煤植物不同，導致黃腐酸呈現的藥理活性并不完全相同。本實驗說明黃腐酸對酒精型胃黏膜損傷的保護作用可能與降低胃蛋白酶活力有關。黃腐酸能降低酒精誘導而升高的胃蛋白酶活力的作用機制可能與枸櫞酸鉍鉀相似，即黃腐酸能夠在胃黏膜損傷表面或肉芽組織處形成一種堅固的保護性薄膜與胃蛋白酶發生螯合，使胃蛋白酶失活，隔絕酒精對胃黏膜的侵蝕作用，阻斷酒精對胃黏膜的損傷。這種作用機制也可能與黃腐酸的膠體性質息息相關，有待進一步研究。