兒茶乙酸乙酯萃取物治療大鼠變應性鼻炎的病理形態學研究

金建波，盧浙文，呂建森，俞余，沈雅君

變應性鼻炎（AR）是一種以免疫球蛋白E（IgE）為基礎的慢性鼻咽炎癥[1]，好發于兒童和青少年，全世界發病率呈持續增長趨勢[2]。目前治療AR的傳統抗過敏藥物僅能起到暫時緩解癥狀的作用，停藥后易復發，甚至可能會引起不同程度的不良反應，如長期倍他米松滴鼻易引起庫欣綜合征，抗組胺藥易引起中樞神經反應如嗜睡，白三烯調節劑可能對情緒有害，且與自殺有關等。中藥兒茶學名孩兒茶，為豆科植物落葉小喬木兒茶的枝干煎汁濃縮而成的干燥浸膏，具有強大的抗炎作用[3]。關于兒茶治療鼻炎早在《本草權度》中就有詳細記載：鼻淵流水：孩兒茶末，吹之，良。現代學者應用兒茶粉與凡士林混合外用治療慢性鼻炎的，有效率達94%[4]。然而，中藥兒茶治療AR的具體藥理作用機制卻知之甚少，在一定程度上限制其在臨床上的使用和推廣。因此，本文擬建立AR模型，觀察兒茶乙酸乙酯萃取物對AR大鼠后鼻黏膜嗜酸性粒細胞、肥大細胞和血管通透性的病理形態學影響。報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料SPF級SD大鼠[浙江省維通利華實驗動物技術有限公司，動物生產許可證號：SCXK（浙）2019-0001]20只，體質量142～160 g。飼養環境：恒溫，溫度（22±2）℃，濕度50%～60%，光照每12小時明暗交替。按隨機數字法分為實驗組和模型組。

1.2 實驗儀器和試劑

1.2.1 實驗儀器酶標儀（CMaxPlus，MD，美國）、低溫高速離心機（Micro 17R，Thermo，美國）、超聲波清洗機（SB-5200D，寧波新芝生物科技股份有限公司，中國）。

1.2.2 實驗試劑兒茶（云南，寧波濟康藥業有限公司），卵白蛋白（ovalbumin，OVA）、氫氧化鋁（sigma，美國），伊文思藍（Evans blue，EB）[生工生物工程（上海）股份有限公司，上海]，甲酰胺、變色酸2R（國藥集團化學試劑有限公司，中國），蘇木素溶液、伊紅（醇溶）（北京索萊寶科技有限公司，北京），甲苯胺藍（上海麥克林生化科技有限公司，上海）。

1.3 兒茶提取兒茶藥材經本院中藥房中藥師鑒定為豆科植物兒茶Acacia catechu（L.f.）Willd的去皮枝干所得的干燥煎膏，用80%乙醇超聲提取，重復3次，每次30 min，乙醇提取液減壓濃縮得兒茶浸膏，然后用適量水混懸，依次用3倍體積的石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取6次，留乙酸乙酯萃取液部分，真空干燥至恒重，得兒茶乙酸乙酯萃取物粗品粉末，用于AR治療。給藥前，加純化水配制成濃度為10 mg/ml。

1.4 AR建模[5]及給藥（1）基礎致敏：用30 mg OVA作抗原，氫氧化鋁粉末3 g作佐劑，加0.9%氯化鈉注射液100 ml制成混懸液，每只大鼠腹腔注射1 ml，隔天1次，共7次。（2）鼻激發試驗：配制2%OVA 0.9%氯化鈉注射液，滴入雙側鼻腔，每側0.05 ml，1次/d，共7次。造模成功后，給予1 g/L OVA滴鼻以維持對鼻黏膜的刺激，每側鼻腔0.05 ml，隔天1次，共10次。本模型持續42 d。模型制作成功標準[6]：（1）噴嚏，一次連續3～9個為1分，10～14個為2分，≥15個為3分。（2）鼻癢，搔鼻2～3次為1分，3～5次為2分，5次以上為3分。（3）流涕，流至鼻孔為1分，超過前鼻孔為2分，流涕滿面為3分。記錄結果以疊加法計總分，總分（a+b+c）≥5分表示AR動物模型建立成功。觀察時間為每次給藥后10 min內，計算各組給藥后AR癥狀評分。造模成功后，實驗組給予兒茶乙酸乙酯萃取物灌胃100 mg·kg1·次1，2次/d，連續給藥14 d。模型組不作任何處理，自由生長。

1.5 組織取材大鼠于末次給藥后，頸椎脫臼迅速處死后斷頭并剝除上頜骨骨部皮膚，將上頜骨從顱骨中游離，取鼻中隔黏膜組織，置于4%多聚甲醛溶液中，固定24 h，常規脫水，石蠟包埋。于石蠟切片機上，做連續切片，片厚4 m，隔4張取一片，用于HE、甲苯胺藍和Chromotrope 2R染色。

1.6 EB法檢測鼻黏膜血管通透性各組大鼠于末次給藥后2 h通過尾靜脈注射2%的EB溶液（0.5ml/kg），經血液循環后可見眼周、鼻唇、四肢、睪丸等淺表皮膚呈藍色。予以10%水合氯醛（0.4ml/100g）行腹腔注射麻醉，置于平板上仰臥固定。開胸暴露大鼠心臟，切開左心室，從左心室插管到主動脈并固定導管，右心房切開引流，用0.9%氯化鈉注射液灌注沖洗血管中的EB，直至右心房無血液流出。用脊髓脫臼法迅速處死，剝除上頜骨骨部皮膚，將上頜骨從顱骨中游離出來，取鼻中隔黏膜組織，0.9%氯化鈉注射液輕輕漂洗，濾紙吸干，準確稱重50 mg置于3 ml甲酰胺中，于37℃恒溫水溫箱中孵育24 h，然后以3 000 r/min離心10 min。取藍染液200 l，置于酶標儀620 nm波長處進行比色，測出EB的濃度。根據標準曲線計算得到EB濃度，并計算單位重量鼻黏膜中所含的EB的量。血管通透性以EB漏出量表示。

1.7 HE染色利用Harris氏HE染色法進行組織染色，顯微鏡下觀察各組鼻黏膜組織病理改變。

1.8 甲苯胺藍染色法檢測鼻黏膜肥大細胞數切片置于甲苯胺藍溶液30min，水稍洗，置于1%冰醋酸溶液中分化，直至細胞核和顆粒清晰，水稍洗，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固。于光鏡下觀察肥大細胞浸潤情況。采用ImageJ圖像分析系統對鼻中隔黏膜肥大細胞進行計數，每組隨機取5個切片，光鏡下觀察3個高倍視野（×400），計算均值。

1.9 Chromotrope 2R染色法檢測嗜酸性粒細胞數切片放入Chromotrope 2R溶液中，浸染10 min，水稍洗，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固。光鏡下觀察嗜酸性粒細胞浸潤情況。采用ImageJ圖像分析系統對鼻中隔黏膜嗜酸性粒細胞進行計數，每組隨機取5個切片，光鏡下觀察3個高倍視野（×400），計算均值。

1.1 0統計分析采用SPSS 16.0統計軟件進行數據分析，計量資料以均數±標準差表示，采用方差分析，采用SNK檢驗；若符合正態分布但方差不齊，則采用Dunnett’s T3檢驗或獨立樣本t檢驗；若不符合正態分布，則采用Kruskal-WallisH檢驗。P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 行為學評價經OVA誘導后，所有大鼠均出現抓鼻、噴嚏、流涕等過敏癥狀，評分全部超過5分，提示造模成功。實驗組AR大鼠行為學評分隨時間延長逐漸下降（P＜0.05）。模型組隨時間的延長，行為學評分未見明顯下降（P＞0.05）。經兒茶乙酸乙酯萃取物口服治療后的AR大鼠行為學評分在各個時間點要小于模型組，至治療7 d后，行為學評分差異有統計學意義（均P＜0.05），見表1。

2.2 鼻黏膜血管通透性情況實驗組EB含量明顯低于模型組，差異有統計學意義（P＜0.05），見表2。

2.3 組織病理形態學觀察

2.3.1 HE染色模型組鼻黏膜可見大量上皮破壞、嗜酸性粒細胞和肥大細胞浸潤以及杯狀細胞增生明顯。實驗組可見散在嗜酸性粒細胞、肥大細胞和杯狀細胞分布，上皮破壞減少，見封三彩圖4。

2.3.2 甲苯胺藍染色肥大細胞胞質內含有肝素和組織胺等異色性物質遇到甲苯胺藍可呈異染性紫紅色，模型組可見大量的肥大細胞浸潤。與模型組比較，實驗組肥大細胞陽性數明顯減少（P＜0.05），見表3。

2.3.3 Chromotrope 2R染色鼻黏膜組織中嗜酸性粒細胞的胞質呈粉紅色，其他細胞不著色。模型組大鼠鼻黏膜組織中可見嗜酸性粒細胞增多，絕大多數嗜酸性粒細胞成堆分布，細胞呈圓形，胞質內充滿粗大、整齊、均勻、其細胞質內可見紫紅色顆粒樣物質。與模型組比較，實驗組大鼠嗜酸性粒細胞粒細胞顯著減少（P＜0.05），見表3。

表1 各組大鼠行為學評分 分

表2 兩組大鼠鼻黏膜EB含量變化g/g

表3 各組大鼠鼻黏膜嗜酸性粒細胞和肥大細胞計數 個

3 討論

既往研究認為肥大細胞是AR的重要效應細胞，在AR速發相和遲發相反應中具有重要價值[7]。當AR動物吸入變應原時，肥大細胞表面的IgE與抗原分子交聯活化肥大細胞，并誘導肥大細胞脫顆粒分泌大量組胺等貯存在肥大細胞顆粒物中的炎性介質，引起速發相反應，降低AR動物鼻黏膜上皮屏障的完整性，維持上皮屏障的滲漏[8]，使毛細血管通透性增加、腺體分泌增多等病理變化[9]，誘導出現AR的鼻反應，包括打噴嚏、瘙癢和鼻漏[10]。在參與遲發相反應的過程中，肥大細胞募集和活化嗜酸粒細胞等免疫細胞，導致炎性介質的進一步釋放，炎性反應持續和加重，鼻黏膜出現明顯組織水腫導致鼻塞。本研究結果顯示OVA激發誘導AR后，肥大細胞浸潤脫顆粒明顯，血管通透性增加，伴隨而來的AR大鼠噴嚏、抓鼻等鼻部行為學評分明顯增加，經兒茶乙酸乙酯萃取物處理后，肥大細胞浸潤減少，脫顆粒水平顯著抑制，并下調了血管通透性水平，使鼻過敏行為學癥狀明顯減輕，尤其是鼻摩擦。

嗜酸性粒細胞局部浸潤是AR重要病理學特征之一[11]，其浸潤程度與鼻部癥狀評分顯著相關[12]。本研究模型組大鼠光鏡下可見鼻黏膜嗜酸性粒細胞出現特征性的大量浸潤，鼻黏膜血管通透性增加，鼻部行為學評分顯著升高，與文獻[13]報道一致。AR大鼠經兒茶乙酸乙酯萃取物干預處理后，HE染色結果和嗜酸性粒細胞染色結果均顯出鼻黏膜嗜酸性粒細胞局部浸潤和脫顆粒現象明顯減少，血管通透性降低，AR大鼠鼻部行為學特征顯著改善，這表明兒茶乙酸乙酯萃取物可能通過減少嗜酸性粒細胞局部浸潤來改善AR鼻部癥狀。

綜上所述，兒茶乙酸乙酯萃取物對AR大鼠具有一定的治療作用，可能通過抑制肥大細胞和嗜酸性粒細胞浸潤，降低肥大細胞和嗜酸性粒細胞脫顆粒，抑制活化而發揮作用，為臨床中藥兒茶治療鼻炎提供了一定的實驗依據。中藥兒茶的主要活性成分兒茶素和表兒茶素[14]，兒茶乙酸乙酯萃取物治療AR的活性物質可能與兒茶素類化合有相關[15]，但其相關性研究仍需進一步深入。