扶正化結湯對二乙基亞硝胺誘導的肝細胞癌大鼠炎癥反應的影響

趙鵬杰，趙旭，高繼良

肝癌是常見的惡性消化系統腫瘤，位居我國癌癥發病率第4位[1]。炎癥因素在肝癌的發生、發展中扮演重要角色。肝癌歸屬于中醫學“積聚”、“臌脹”、“脅痛”、“黃疸”及“巖”等范疇，“凡屬肝病，勢必乘土”，可見肝病的治療中調脾至關重要[2]。杭州市蕭山區中醫院總結出抗癌經驗方扶正化結湯，具有健脾運脾及消瘀化結功效。本文擬探討扶正化結湯對二乙基亞硝胺（DEN）誘導的肝細胞癌大鼠炎癥反應的影響，報道如下。

1 資料與方法

1.1 材料研究獲得浙江中醫藥大學實驗動物管理與倫理委員會審核通過（IACUC-20200824-02）。雄性SPF級WISTAR大鼠30只，體質量150～170g，購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司，許可證號SCXK（滬）2017-0005。DEN購自美國Sigma公司，貨號：N0756-10ML。扶正化結湯顆粒劑，杭州市蕭山區中醫院中藥房提供，主要組成：黃芪15g，白花蛇舌草15g，半枝蓮30g，蜂房5g，佛手10g，雞內金10 g，貓爪草20 g，三葉青5 g，酸棗仁10 g，預知子10g，腫節風30g，茯苓15g，米仁30g。

1.2 分組造模與干預大鼠適應性喂養2周后隨機分為3組（n=10）：正常對照組、造模組及中藥治療組。各組均以普通飼料喂養。對照組予以0.9%氯化鈉注射液0.4 ml/100 g腹腔注射，1次/周，0.9%氯化鈉注射液1ml/100g灌胃，1次/d；造模組予DEN皮下注射50mg·kg-1·次-1，1次/周，0.9%氯化鈉注射液1 ml/100 g灌胃，1次/d；中藥治療組予DEN皮下注射50 mg·kg-1·次-1，1次/周，予扶正化結湯1ml/100g灌胃，1次/d，連續17周。

1.3 血清指標檢測各組大鼠血清指標檢測實驗結束后，大鼠腹主動脈采血，用日立3100全自動生化分析儀檢測大鼠血清中丙氨酸氨基轉移酶（ALT）、天門冬氨酸氨基轉移酶（AST）水平，ELISA法檢測白介素6（IL-6）、甲胎蛋白（AFP）、癌胚抗原（CEA）、糖類抗原199（CA199）及核轉錄因子B（NF-B）水平。

1.4 大鼠肝重、體質量、肝臟系數及病理學觀察采血后處死大鼠，稱體質量及肝臟質量，計算肝重/體質量（肝臟系數）。取肝臟最大葉距肝緣約1 cm的部位切取大小約1cm×1cm×0.3cm組織塊，置于4%多聚甲醛溶液中固定，用于病理學檢查。

1.5 肝組織中環氧合酶2（COX-2）及核因子B（NF-B）表達處死大鼠，取一部分肝組織快速置于液氮中，采用實時熒光定量RT-PCR法檢測肝組織中COX-2及NF-B表達。

1.6 統計方法數據采用SPSS 20.0統計軟件處理，計量資料以均數±標準差表示，多組間比較采用F檢驗，多重比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 血清指標檢測比較造模組ALT、AST、IL-6、AFP、CEA、CA199及NF-B水平均高于對照組（t≥3.10，均P＜0.05），中藥治療組上述指標均低于造模組（t≥4.92，均P＜0.05），見表1。

表1 3組間血清指標比較（=10）

2.2 大鼠總體觀察、肝重及體質量比較

大鼠飼養過程中，正常對照組大鼠毛色光亮，體型健壯，活動靈活；造模組大鼠毛色晦暗，體型較瘦，活力下降；中藥治療組經治療后，活力稍有恢復。

與正常對照組相比，造模組大鼠體質量下降（t=9.97，P＜0.01），肝重及肝指數明顯上升（t=12.47、25.23，均P＜0.01）。與造模組相比，中藥治療組大鼠體質量與造模組差異無統計學意義（t=0.68，P＞0.05），但肝重及肝指數均明顯下降（t=4.01、5.74，均P＜0.01），見表2。

2.3 病理結果病理顯示，造模組大鼠肝組織中，纖維組織增多，假小葉形成，肝細胞壞死、變性，偶見癌巢；中藥治療組大鼠的肝組織中，肝細胞壞死及纖維化減少，見封三彩圖3。

2.4 COX-2及NF-B表達比較正常對照組、造模組及中藥治療組COX-2表達量分別為1、3.29±1.62及2.29±2.03，造模組表達量高于正常對照組（t=5.30，P＜0.01），中藥治療組表達較模型組低（t=2.31，P＜0.01）。正常對照組、造模組、中藥治療組NF-B表達量分別為2.19±1.06及1.69±0.48，與正常對照組相比，造模組表達量高于正常對照組（t=6.12，P＜0.01），中藥治療組表達較模型組低（t=2.54，P＜0.05）。

3 討論

研究證實，炎癥相關的NF-B在包括肝癌在內的多種惡性腫瘤組織及細胞中表達上調并維持異常激活狀態，且和抗腫瘤治療密切相關，參與腫瘤細胞的增殖、侵襲、轉移及復發[3]。靜息狀態時，NF-B二聚體（p50，p65）與細胞質的抑制因子I B結合，以無活性的狀態存在于細胞質中；當細胞內外的各種信號通過級聯傳導，使I B激酶磷酸化I B僅導致I B降解而NF-B恢復活性的游離狀態，激活的NF-B入核與DNA結合，促進下游靶基因轉錄[4]。

COX-2相關通路可直接調控腫瘤發生發展。有報道顯示，卵巢癌細胞中高表達COX-2、分泌PGE2，與其受體結合后可上調NF-B P65的磷酸化水平，增強卵巢癌細胞的增殖能力[5]。高水平的COX-2/PGE2不僅能直接調控腫瘤細胞的惡性生物學行為，還可通過阻礙各種免疫細胞中的促炎反應并介導TME的重編程，使TME處于免疫抑制狀態[6]。COX-2還可影響巨噬細胞活化狀態。經典活化型巨噬細胞M1和替代活化型巨噬細胞M2分別具有促炎性和抗炎性，NF-B介導巨噬細胞向M1型極化[7]，恢復巨噬細胞的促炎功能，而NF-B又是COX-2的反式激活因子，可增加腫瘤細胞和巨噬細胞中COX-2的表達[8]，二者具有相同的信號分子，COX-2參與調節巨噬細胞向M1型極化。本研究結果顯示，扶正化結湯通過調控肝組織中COX-2、NF-B表達水平，對肝癌大鼠炎癥反應具有明顯的調節作用，與肝臟炎癥及壞死相關的ALT、AST、IL-6指標均顯著降低，有效降低肝組織纖維化、抑制肝細胞壞死，對肝細胞起到一定的保護作用。

綜上所述，扶正化結湯具有控制炎癥水平、抑制肝癌細胞增殖、促進肝癌細胞凋亡的作用，其機制可能與下調COX-2及NF-B的表達有關。

表2 3組大鼠體質量、肝重及肝指數比較（=10）