豆渣水溶性膳食纖維的復(fù)合酶法提取及其應(yīng)用于可食性膜研究

皮小弟，羅瑞婷，李葉青,,*，鄒志群,3，吳思毅，黃志遠(yuǎn)

（1.廣東江門中醫(yī)藥職業(yè)學(xué)院南藥學(xué)院，廣東 江門529000；2.河源職業(yè)技術(shù)學(xué)院機電工程學(xué)院，廣東 河源517000；3.肇慶學(xué)院食品與制藥工程學(xué)院，廣東 肇慶526061）

大豆在我國食用廣泛，絕大部分用于榨油或加工成豆制品，如腐竹、豆腐、豆乳等，在生產(chǎn)過程中會產(chǎn)生大量的副產(chǎn)物——豆渣。豆渣富含蛋白質(zhì)、膳食纖維、脂肪、氨基酸、維生素等[1-2]，具有較高的利用價值。目前對豆渣的研究利用主要包括以下兩個方面：一是直接利用，以替代部分食品原料，如制作饅頭[3-4]、面包[5-6]、餅干[7]、蛋糕[8]和飲料[9]等食品；二是有效成分的提取和利用，主要是膳食纖維，包括水溶性膳食纖維（Soluble dietary fiber，SDF）和水不溶性膳食纖維。豆渣總膳食纖維約占豆渣干物質(zhì)的65%[10]，但大多為水不溶性膳食纖維，SDF含量低限制了豆渣在食品工業(yè)中的應(yīng)用[11]。SDF在水溶液中只有形成凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)才能吸附重金屬離子或膽汁酸等小分子物質(zhì)，發(fā)揮一系列生理功能[12-13]。為提高SDF的提取量，有研究采取了一系列輔助提取方法，主要有：擠壓膨化[14]、超高壓均質(zhì)[15]、超聲[16]等物理法；酸[17]、堿[18-19]處理等化學(xué)法；酶法[20]、微生物發(fā)酵法[21-23]等生物法；其他復(fù)合方法[24-27]。可食膜是指由可食性材料形成的膜，其可通過防止氣體、水汽和溶質(zhì)的遷移來保證食品的質(zhì)量，延長食品的貨架期[28]。目前，可食性膜的研究按照原料來源一般可分為以下幾類：以碳水化合物類為基礎(chǔ)的可食性膜[29-33]、以蛋白質(zhì)類為基礎(chǔ)的可食性膜[34-36]、以類脂類為基礎(chǔ)的可食性膜和復(fù)合型可食性膜[37]。也有利用豆渣制備可食性包裝紙的研究報道。昆明理工大學(xué)[38]授權(quán)了一種用豆腐渣制備膳食纖維可食用包裝紙的發(fā)明專利；任媛媛等[39]探討了豆渣可食用包裝紙制備的最佳配方，但在豆渣可食性膜的研究上鮮有報道。本文以豆渣為原料，對其進行干燥后采用復(fù)合酶法進行酶解，明顯提高了豆渣中SDF的提取率。在提取的基礎(chǔ)上進行豆渣可食性膜性能的初步研究，得到一種光滑且性質(zhì)穩(wěn)定的豆渣可食性膜。利用豆渣中的SDF生產(chǎn)可食性膜，進而用其生產(chǎn)包裝紙，不僅可以提高廢棄物的利用率，還能減少對環(huán)境的污染[40]，開發(fā)前景十分廣闊。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

1.1.1 材料與試劑

豆渣：河源市美芳源食品有限公司。

纖維素酶（1 000 U/g）、堿性蛋白酶（20 000 U/g），青島蔚藍(lán)生物股份有限公司；碳酸氫鈉、無水乙醇，國藥集團化學(xué)試劑有限公司；羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）、海藻酸鈉、甘油，西安惠邦生物工程有限公司。以上試劑均分析純。

1.1.2 儀器與設(shè)備

DHG-9243A鼓風(fēng)干燥箱，上海精其儀器有限公司；HL-PHJ-30單相微型膨化機，山東鴻朗機械設(shè)備有限公司；XY-SYG-16恒溫水浴鍋，上海昕儀儀器儀表有限公司；L420臺式低速自動平衡離心機，湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司；FD-1B-50真空冷凍干燥機，上海豫明儀器有限公司；搖擺式粉碎機，永康市榮舒五金機械有限公司；HS-12磁力攪拌器，群安實驗儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 豆渣的處理

將豆渣于鐵盤上攤成薄層，置于65℃鼓風(fēng)干燥箱中干燥烘制，每1 h翻面1次，直至豆渣不能捏成團。烘制過的豆渣經(jīng)過膨化機處理，粉碎，得到處理好的豆渣樣品。

1.2.2 豆渣SDF提取工藝流程

稱取一定質(zhì)量的豆渣樣品（精確到0.000 1 g）→按比例加入蒸餾水→添加纖維素酶（按蒸餾水添加量的體積計）→磁力攪拌酶解（45℃）→加熱滅酶（100℃，10 min）→調(diào)pH值→添加堿性蛋白酶（豆渣樣品質(zhì)量的1%）→60℃磁力攪拌酶解30 min→加熱滅酶（100℃，10 min）→過濾→濾液中加入無水乙醇（濾液體積的4倍），沉淀過夜→離心（4 000 r/min，15 min）→對沉淀進行真空冷凍干燥→豆渣SDF干品

1.2.3 豆渣SDF提取工藝的優(yōu)化

1.2.3.1 單因素試驗設(shè)計

按照“1.2.2”所示方法提取豆渣SDF，研究豆渣與蒸餾水之比（料液比）、纖維素酶添加量、酶解時間、蛋白酶酶解體系pH值對SDF提取率的影響。

固定纖維素酶添加量為1%，酶解時間為2.0 h，蛋白酶酶解體系pH值為9，研究料液比分別為1∶15、1∶20、1∶25、1∶30（g∶mL）時豆渣SDF的提取率；固定料液比為其優(yōu)化值，酶解時間為2.0 h，蛋白酶酶解體系pH值為9，研究纖維素酶添加量分別為1%、2%、3%、4%時豆渣SDF的提取率；固定料液比、纖維素酶添加量為其優(yōu)化值，蛋白酶酶解體系pH值為9，研究酶解時間分別為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h時豆渣SDF的提取率；固定料液比、纖維素酶添加量、酶解時間為其優(yōu)化值，研究蛋白酶酶解體系pH值分別為8、9、10、11時豆渣SDF的提取率。

1.2.3.2 正交試驗設(shè)計

在單因素試驗基礎(chǔ)上，選擇料液比、纖維素酶添加量、蛋白酶酶解體系pH值為主要影響因素，以SDF提取率為考察指標(biāo)，采用L9(34)正交試驗，對豆渣SDF提取工藝進行優(yōu)化。正交試驗因素水平見表1。

表1 豆渣SDF提取工藝優(yōu)化正交試驗因素水平表Table 1 Orthogonal factor level table for soybean residue SDF extraction optimization

1.2.4 豆渣SDF可食性膜的制備

將按照最優(yōu)工藝制備得到的豆渣SDF干品，以料液比1∶10（g∶mL）的比例加入蒸餾水，得到豆渣SDF水溶液；在SDF水溶液中加入一定量的CMC-Na、海藻酸鈉，磁力攪拌混合均勻；再加入甘油，磁力攪拌混合均勻；用玻璃棒將混合溶液涂于表面光滑并已預(yù)熱的玻璃上，65℃干燥至恒重；然后將膜置于20℃、相對濕度90%的恒溫恒濕培養(yǎng)箱中15 min，得到成品。

1.2.5 豆渣SDF可食性膜制備條件的優(yōu)化

1.2.5.1 單因素試驗設(shè)計

按照“1.2.4”的方法制備豆渣SDF可食性膜，研究CMC-Na、海藻酸鈉、甘油添加量對豆渣SDF可食性膜性能的影響。

稱取1 g豆渣SDF干品制成水溶液，固定CMCNa添加量為1 g，海藻酸鈉添加量為1 g，研究甘油添加量分別為1.5、3.0、4.5、6.0 mL時對豆渣SDF可食性膜水溶性和透水性的影響；固定甘油添加量為其優(yōu)化值，CMC-Na添加量為1 g的條件下，研究海藻酸鈉添加量分別為0.5、1.0、1.5、2.0 g時對豆渣SDF可食性膜水溶性和透水性的影響；固定甘油添加量、海藻酸鈉添加量為其優(yōu)化值，研究CMC-Na添加量分別為0.5、1.0、1.5、2.0 g時對豆渣SDF可食性膜水溶性和透水性的影響。

1.2.5.2 正交試驗設(shè)計

在單因素試驗結(jié)果基礎(chǔ)上，選擇CMC-Na、海藻酸鈉、甘油添加量為主要影響因素，以豆渣SDF可食性膜水溶解速度和水滴漏時間為考察指標(biāo)，采用L9(34)正交試驗，對豆渣SDF可食性膜制備工藝進行優(yōu)化。正交試驗因素水平見表2。

表2 SDF可食性膜制備條件優(yōu)化正交試驗因素水平表Table 2 Orthogonal factor level table for preparation conditions optimization of SDF edible film

1.2.6 測定項目與方法

1.2.6.1 豆渣SDF提取率

計算公式為：

式中：m0為豆渣樣品質(zhì)量，g；m1為由豆渣樣品提取的SDF質(zhì)量，g。

1.2.6.2 膜水溶性測定

參照李佩燚等[41]的方法，稍作修改。稱取一定量的豆渣SDF可食性膜（精確到0.000 1 g）放入30℃、100 mL蒸餾水中，快速攪拌至溶液中無碎片為止，按下式計算豆渣SDF可食性膜水溶解速度。膜水溶性以水溶解速度表示，水溶解速度越大，表示膜水溶性越好。

式中：m2為豆渣SDF可食性膜質(zhì)量，g；t1為豆渣SDF可食性膜水溶解時間，s。

1.2.6.3 膜透水性測定

參照李佩燚等[41]的方法，稍作修改。將豆渣SDF可食性膜覆蓋于燒杯口上，在紙膜上用膠頭滴管滴加水2滴后開始計時，到紙膜下有第一滴水滴下終止，所記錄的時間為豆渣SDF可食性膜水滴漏時間（單位為s），以水滴漏時間判斷膜透水性，水滴漏時間越短，膜透水性越好，阻水能力越差。

1.2.7 數(shù)據(jù)處理

采用WPS Office軟件進行數(shù)據(jù)分析并作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 豆渣SDF提取單因素試驗結(jié)果

由圖1可知，料液比對豆渣SDF的提取率有較大的影響，這主要是因為料液比會影響豆渣提取水溶液的黏度和濃度，當(dāng)料液比為1∶15（g∶mL）時，溶液黏度較大，影響豆渣SDF的溶出，而酶解作用無法達(dá)到最佳狀態(tài)，提取率較低；當(dāng)蒸餾水添加比例逐漸升高時，由于水溶液體積增大，與豆渣SDF所形成的濃度差變大，豆渣SDF的溶解擴散速度加快，同時酶的催化作用加強，豆渣SDF提取率明顯升高。當(dāng)豆渣SDF的溶出達(dá)到平衡時，豆渣中SDF溶出較徹底，此后由于水解產(chǎn)物單糖的產(chǎn)生使得豆渣SDF提取率開始降低。當(dāng)料液比為1∶20（g∶mL）時，SDF提取率達(dá)到峰值，表明在該料液比條件下酶解效果最好，豆渣SDF提取率最高。

圖1 料液比對豆渣SDF提取率的影響Fig.1 Effect of solid-liquid ratio on SDF extraction rate

由圖2可知，隨著纖維素酶添加量的增加，豆渣SDF提取率也隨之升高，呈現(xiàn)出先快速上升后趨于平緩的趨勢。當(dāng)纖維素酶添加量過大時，豆渣SDF會被酶解為單糖，同時由于酶活性的降低，致使SDF提取率呈小幅度下降并趨向于平穩(wěn)。故選擇纖維素酶添加量2%為最適添加量。

圖2 纖維素酶添加量對豆渣SDF提取率的影響Fig.2 Effect of cellulase addition on SDF extraction rate

一般情況下，在一定時間內(nèi)豆渣酶解時間越長，酶解效果越好，豆渣SDF提取率也就越高。由圖3可知，當(dāng)酶解時間達(dá)到2 h時，豆渣SDF提取率最高，之后開始下降，主要原因可能是酶解過度，豆渣SDF轉(zhuǎn)變成了單糖等可溶性糖。因此選擇最佳酶解時間為2 h。

圖3 纖維素酶酶解時間對豆渣SDF提取率的影響Fig.3 Effect of cellulase hydrolysis time on SDF extraction rate

本試驗使用的是堿性蛋白酶，故需將其酶解體系調(diào)成堿性狀態(tài)，pH值的改變會影響酶活性中心的構(gòu)象，從而影響酶對底物分子的結(jié)合和催化，只有在最佳pH值條件下才最適宜酶和豆渣SDF的相互結(jié)合，使酶充分發(fā)揮催化作用，進而使豆渣SDF提取率達(dá)到最高，但pH值過大會使酶變性失活，導(dǎo)致酶的催化效果降低。由圖4可知，當(dāng)?shù)鞍酌该附怏w系pH值為9時，堿性蛋白酶對豆渣催化作用達(dá)到最好，豆渣SDF提取率達(dá)到最高。

圖4 蛋白酶酶解體系pH值對豆渣SDF提取率的影響Fig.4 Effect of protease enzymolysis pH on SDF extraction rate

2.2 豆渣SDF提取正交試驗結(jié)果

豆渣SDF提取工藝正交試驗結(jié)果見表3。

表3 豆渣SDF提取工藝優(yōu)化正交試驗結(jié)果Table 3 Orthogonal experimental results of SDF extraction

由表3可以看出，各因素對豆渣SDF提取率大小的影響順序為：料液比（A）＞蛋白酶酶解體系pH值（C）＞纖維素酶添加量（B），最佳組合為A3B3C2，即料液比1∶30（g∶mL），纖維素酶添加量3%，蛋白酶酶解體系pH值為9，該組合和正交試驗表中的最佳組合相同，提取率為23.74%。

2.3 豆渣SDF可食性膜制備單因素試驗結(jié)果

由圖5可以看出，甘油添加量對豆渣SDF可食性膜的水溶性和透水性的影響大小不同。隨著甘油添加量的增加，膜的水溶解速度變化不大，即膜水溶性變化不大，呈稍減小的趨勢，說明其在水中溶解的速度僅略有降低。隨著甘油添加量的增加，膜的水滴漏時間明顯減少，表明其阻水能力明顯降低。膜的透水性強弱體現(xiàn)了其保水阻水能力的強弱，一般情況下水滴漏時間較長為好。綜合數(shù)據(jù)分析可得，試驗條件下，為制備阻水能力較好的豆渣SDF可食性膜，甘油添加量選擇1.5 mL為宜。

圖5 甘油添加量與豆渣SDF可食性膜性能的關(guān)系Fig.5 Relationship between glycerol addition and properties of SDF edible membrane

由圖6可以看出，隨著海藻酸鈉添加量的增加，膜的水溶解速度逐漸變小，但變化幅度不大，而水滴漏時間明顯增加，這是由于海藻酸鈉不但對膜液能起到穩(wěn)定、乳化的作用，而且還對膜起到輔助構(gòu)架的作用。海藻酸鈉添加量為1.5 g時，豆渣SDF可食性膜的阻水性能較好。綜合比較，選擇1.5 g作為海藻酸鈉最適添加量。

圖6 海藻酸鈉添加量與豆渣SDF可食性膜性能的關(guān)系Fig.6 Relationship between sodium alginate dosage and properties of SDF edible membrane

由圖7可以看出，隨著CMC-Na添加量的增加，膜的水溶解速度初期降低較快，中、后期變化較小；水滴漏時間呈明顯增加的趨勢。這是因為在一定濕度下，CMC-Na的黏度和高分子量可以賦予膜較高的強度和韌性，使得膜的水溶性變差，保水性增強。綜合考慮，選擇CMC-Na添加量2.0 g為最適添加量。

圖7 CMC-Na添加量與SDF可食膜性能的關(guān)系Fig.7 Relationship between CMC-Na addition and SDF edible film performance

2.4 豆渣SDF可食膜制備工藝正交試驗優(yōu)化結(jié)果

豆渣SDF可食膜制備工藝正交試驗優(yōu)化結(jié)果結(jié)果見表4。

表4 SDF可食膜制備條件正交優(yōu)化試驗結(jié)果Table 4 Orthogonal test results of SDF edible film preparation conditions optimization

由表4可知，影響豆渣SDF可食性膜水溶性大小的因素排序為：A（甘油添加量）＞B（CMC-Na添加量）=C（海藻酸鈉添加量）；影響豆渣SDF可食性膜透水性大小的因素排序為：C（海藻酸鈉添加量）＞B（CMC-Na添加量）＞A（甘油添加量）。由使用條件來看，可食性膜需要有一定的水溶性，但其阻水性能更為重要，因此確定試驗條件下成膜最佳因素組合為A2B2C3，即：CMC-Na添加量1.0 g，海藻酸鈉添加量1.5 g，甘油添加量4.5 mL。該組合和正交試驗表中的最佳組合相同，利用該組合制備的豆渣SDF可食性膜，水滴漏時間為12 060 s。

3 結(jié)論

本試驗首先研究豆渣SDF提取的最佳工藝，然后在此基礎(chǔ)上對豆渣SDF可食性膜成膜條件進行了優(yōu)化。結(jié)果表明，豆渣SDF提取的最佳工藝為：料液比1∶30（g∶mL），纖維素酶添加量3%，酶解時間2 h，蛋白酶酶解體系pH值為9；豆渣SDF可食性膜成膜最佳條件為：1.0 g豆渣SDF添加海藻酸鈉1.5 g，CMC-Na 1.0 g，甘油4.5 mL。在優(yōu)化條件下制備的豆渣SDF可食性膜光滑、性質(zhì)穩(wěn)定，水溶解速度為0.098 mg/s，水滴漏時間為12 060 s。本試驗為豆渣SDF可食性膜的研制提供了一定的參考依據(jù)。今后將對豆渣SDF的組成結(jié)構(gòu)以及成膜性能做進一步的研究。