調節肌紅蛋白結構及肉品色澤的化學/物理方法及其機制研究進展

柏怡文，柯志剛，周緒霞，丁玉庭*

1(浙江工業大學 食品科學與工程學院，浙江 杭州，310014)2(浙江省深藍漁業資源高效開發利用重點實驗室，浙江 杭州，310014) 3(國家遠洋水產品加工技術研發分中心(杭州)，浙江 杭州，310014)4(海洋食品精深加工關鍵技術省部共建協同創新中心， 大連工業大學，遼寧 大連，116034)

色澤是反映肉和肉制品新鮮度和品質最直觀的指標，直接影響消費者的購買意愿，其主要由肌紅蛋白(myoglobin, Mb)中鐵離子的氧化還原狀態決定。Mb由1條多肽鏈和1個輔基血紅素組成，在牛肉、豬瘦肉等肌細胞中大量存在，起著儲存和分配氧的功能，一般有脫氧肌紅蛋白(deoxymyoglobin, DeoMb, MbFe2+)、氧合肌紅蛋白(oxymyoglobin, OxyMb，MbFe2+O2)和高鐵肌紅蛋白(metmyoglobin, MetMb，MbFe3+)3種形式，分別呈紫紅色、鮮紅色和棕褐色[1]。在新鮮肉中，Mb主要以OxyMb形式存在，其中鐵呈+2價并與O2配位結合而呈鮮紅色。隨著放置時間的延長，Mb中的鐵逐漸被氧化成+3價而轉變為MetMb，肉的顏色也隨之變為棕褐色。由于Mb中鐵的易氧化性，致使肉品在貯藏及加工過程中極易發生明顯的顏色變化，從而造成其商品價值的降低。

除了可與O2配位結合以外，Mb也可與NO、CO結合生成亞硝基肌紅蛋白(nitrosylmyoglobin，MbNO)和碳氧肌紅蛋白(carboxymyoglobin，MbCO)，二者均呈鮮紅色。因此，在肉制品加工過程中，在國家相關標準和法律法規許可范圍內采用一定化學或物理方法選擇性改變Mb結構以改善肉的色澤，這對提高產品的商業價值和競爭力有重要作用。目前常用的肉品發色方法的原理都是通過將Mb轉變為MbNO或MbCO。本文對已有的能夠改變Mb結構從而改變肉品色澤的化學、物理方法的原理、應用及不足進行了總結并對其未來發展方向進行了分析，以期為相關研究和產業應用提供參考。

1 化學方法

1.1 亞硝酸鹽

亞硝酸鹽作為最常用的發色劑，其應用可以追溯到古代：過去人們使用鹵水、海水等腌制肉品以便長期保存，被腌制后的肉品具有鮮艷的紅色，其機制正是由于鹵水、海水中的亞硝酸鹽與Mb反應生成了MbNO[2]。亞硝酸鹽發色的原理是其在鮮肉的酸性條件下(主要是乳酸造成)生成亞硝酸[反應式(1)]，后者極不穩定，易分解生成NO[反應式(2)]，后者可與Mb結合生成MbNO[反應式(3)][3]。

(1)

HNO2+H++e-→NO+H2O

(2)

Mb Fe2++NO→MbFe2+-NO

(3)

雖然目前亞硝酸鹽仍被廣泛應用于腌肉制品加工，但其也有明顯的不足之處。首先，亞硝酸鹽與胃酸反應會生成N2O3，后者可與人體蛋白質代謝產物仲胺類化合物結合生成具有致癌性的N-亞硝胺[反應式(4)][4]，這是亞硝酸鹽作為食品添加劑的最大問題。另外，亞硝酸鹽具有強氧化性，過量食用會導致血液中的亞鐵血紅蛋白氧化為高鐵血紅蛋白，誘發高鐵血紅蛋白血癥[5]，造成人體組織中毒、呼吸中樞麻痹等與缺氧有關的癥狀，甚至引起窒息和死亡。此外，大量攝入亞硝酸鹽也會干擾碘代謝，降低甲狀腺對碘的吸收，導致甲狀腺腫大[6]。由于上述原因，亞硝酸鹽在肉制品加工中的應用受到嚴格限制。聯合國糧農組織和世界衛生組織規定每日允許攝食量≤0.2 mg/kg(體重，以亞硝酸鈉計)，我國相關國家標準(GB 2760—2014《食品安全國家標準 食品添加劑使用標準》)也規定腌臘肉制品中亞硝酸鹽最大添加量為 0.15 g/kg，最大殘留量為30 mg/kg(以亞硝酸鈉計)。

除腌肉制品以外，還有研究顯示亞硝酸鹽對新鮮魚體也有明顯的發色作用。王晶[7]將羅非魚置于含0.5～2.0 g/kg亞硝酸鉀的溶液中暫養一定時間(0.5～2.0 h)后發現，魚片的a*值明顯增大。亞硝酸鹽活體發色的原理是其通過血液循環傳輸到魚肌肉組織中并與肌紅蛋白結合生成MbNO。用亞硝酸鉀溶液處理魚片也得到了類似的結果，且魚片中亞硝酸鹽含量均未超出國家標準。

雖然亞硝酸鹽具有一定的潛在危害，但由于其對肉制品色澤、質地、風味等的改善作用，及其較強的抑制微生物增殖的能力，目前尚未有能完全替代亞硝酸鹽的方法。提高亞硝酸鹽使用安全性以及尋找亞硝酸鹽替代物仍是重要研究內容。

1.2 植物提取物

近年來，植物源發色劑受到了越來越多研究人員的關注，它具有來源廣泛、發色效果好、綠色健康、富含多種天然活性成分和色素等優點，并具有一定的抑菌和改善肉制品風味的作用。已有研究顯示，芹菜、甜菜、菠菜和生姜等多種植物提取物都具有改變Mb結構并實現發色的作用，其原理為這些植物都富含硝酸鹽，后者在具有硝酸鹽還原能力的微生物(如菌瓦式微球菌、肉葡萄球菌和木糖葡萄球菌等)的作用下被還原成亞硝酸鹽[8]，進而實現發色。因此，植物源發色劑在使用前都需要經微生物發酵處理，將其中的硝酸鹽轉變為亞硝酸鹽。

芹菜粉因硝酸鹽含量高、植物色素含量低、風味溫和等優點，是一種常用的植物源發色劑。為避免使用前發酵帶來的繁瑣，有研究人員將芹菜汁液經發酵、濃縮等處理后得到亞硝酸鹽含量為10～15 g/kg的濃縮液，后者可直接商業化應用[9]。此外，研究發現相比于亞硝酸鹽，植物源發色劑能有效減小腌肉制品中亞硝酸鹽殘留量，其可能的原因是植物源發色劑含有多種抗氧化劑(還原劑)，后者能促進亞硝酸鹽分解為NO[10]。常見的植物源發色劑及其應用如表1所示。

表1 常見植物源發色劑及其應用Table 1 Common botanical colorants and their applications

雖然植物源發色劑有諸多優點，但也存在如下不足：(1)植物提取物一般都有獨特的風味和顏色，會一定程度上改變肉制品原有的風味。為防止對肉制品風味產生不良影響，一般植物源發色劑的添加量都較低，如芹菜濃縮物的添加量通常控制在0.2%～0.4%[19]；(2)發酵后的植物源發色劑雖然含有較高濃度的亞硝酸鹽，但其在肉制品加工中的推薦使用量并不能完全抑制腐敗微生物的增殖，因而需要額外的減菌處理；(3)植物提取物中硝酸鹽含量受收獲條件、地域、植物自身特性等多種因素的影響，同時硝酸鹽的還原程度也受發酵時間、溫度和pH等影響，因此最終所得的植物源發色劑中亞硝酸鹽含量難以控制；(4)植物源發色劑還可能會引起部分人群發生過敏現象。為避免此問題，研究人員開發了一系列不含過敏原的發色劑，例如使用噴霧干燥技術從不含過敏原的瑞士甜菜中提取的甜菜發色劑[20]。因此，如何實現植物源發色劑的規范化生產和應用是該技術實現廣泛實際應用所需突破的瓶頸問題。

1.3 NO

近年來，有部分研究人員嘗試利用NO溶液和NO氣體發色肉制品。溶液發色是指將NO氣體通入到含有一定濃度還原劑的脫氧的水中一定時間以制備飽和發色液，將待發色樣品置于發色液中一段時間以實現發色。氣體發色通常是將發色樣品置于經惰性氣體稀釋的NO氣體中并保存一定時間。已有研究表明，NO發色速度快，效果穩定，且亞硝酸鹽殘留量(約20 mg/kg)低于國家對加工肉制品亞硝酸鹽含量的限量標準(30 mg/kg)。此外，魚肉中的研究還顯示NO可有效延緩樣品的pH變化、抑制揮發性鹽基氮的生成和減小滴水損失等，這表明NO可延緩魚體腐敗、保持魚肉品質。關于NO發色的研究如表2所示。

表2 NO在肉制品發色中的應用Table 2 Applications of NO in coloring of meat products

雖然NO作為發色劑具有一定的應有前景，但也有明顯的不足。NO具有較強的刺激性和一定的毒性，這是限制該方法應用的主要原因。另外，NO易與空氣中的O2接觸而生成NO2，進而生成亞硝酸根[反應式(5)～(6)][24]，最終可能會生成亞硝胺等致癌物。因此，如何提高NO發色工藝的安全性以及抑制有毒有害副產物的生成是實現該方法實際應用的重要研究內容。

NO+O2→NO2

(5)

NO+NO2+H2O→HNO2

(6)

1.4 CO

除了O2和NO，CO也可與Mb輔基血紅素中的鐵配位結合生成呈鮮紅色的MbCO。由于Mb與CO的親和力遠大于其與O2的親和力，且生成的MbCO極其穩定，因此CO發色的肉制品可長時間保持鮮紅色[25]。CO發色的常用形式有氣調、浸泡和活體發色3種。氣調發色是指將肉品暴露在經CO2、N2、空氣等稀釋的CO氣體(0.1%～5.0%)中一定時間，浸泡發色是將CO溶解于堿性液體中制成發色液，利用后者對樣品進行浸泡處理。活體發色主要用于水產品，將CO通入水中并經高壓高速旋轉剪切后形成微米級氣泡，發色對象通過呼吸作用吸入CO，后者經血液循環而與Mb結合生成MbCO，此種方法的發色時間短且發色均勻。已有的關于CO發色的研究如表3所示。

表3 CO在肉品發色中的應用Table 3 Applications of CO in coloring of meat products

由于MbCO的高穩定性，CO發色后樣品能長時間保持鮮紅色，因此可能會掩蓋腐敗。另外，由于CO對健康可能造成的危害，因此目前CO發色已被多國禁止。針對前者，有研究人員建議使用低濃度CO氣調發色，這樣既能達到在貨架期內良好的發色效果，又不會掩蓋貨架期后肉品的腐敗變質[30]。針對CO可能帶來的健康危害，多位研究人員的工作顯示發色所需的CO濃度不足以影響血液中碳氧血紅蛋白濃度，因此不足以對人體造成健康風險[31]。因此，CO發色仍具有應用前景，但也需對其工藝和其在體內的演變進行更深入研究。

2 物理方法

2.1 冷等離子體(cold plasma, CP)

等離子體是指氣體在加熱或強電磁場作用下被部分或完全電離成電子、正負離子、基態或激發態原子或分子等多種粒子的混合體系，是物質存在的第四態。根據其溫度的不同，等離子體可分為高溫等離子體和低溫等離子體，后者又可分為熱等離子體和CP[32]。作為一種新興的食品非熱加工方法，CP具有環境友好、應用范圍廣等優點，目前在殺菌、延長食品貨架期方面已有較多研究。

除了上述應用以外，近期還有研究顯示CP處理可以通過改變肉品中Mb結構而實現發色。CP發色的原理為N2和O2在等離子體處理過程中被電離生成N、O等，后二者可與O2、N2等反應生成多種氮氧化合物[反應式(7)～(11)][33-34]。生成的NO可與Mb結合生成MbNO，從而實現發色。

e+O2→O-+O

(7)

e+N2→N+N(2D)+e

(8)

O+N2→NO+N

(9)

N+O2→NO+O

(10)

NO+O3→NO2+O2

(11)

目前關于CP的研究總結如表4所示。

表4 CP處理用于肉品發色的研究 Table4 Studyon the direct CP treatment in the coloring of meat products

CP作為一種新型發色方法，具有清潔環保、發色效果好等優點，在一定條件下可替代亞硝酸鹽而用于肉品加工，但其也存在以下不足：(1)CP直接處理過程中除了生成NO以外，還會生成多種活性氧基團，后者可能會引起食品中蛋白質、脂質等營養成分的氧化，導致肉制品褐變及營養成分的變化。(2)CP處理需要高壓電源、等離子體發生裝置、控制裝置等，因此投入相對較高，且高壓可能會帶來一定的安全隱患。(3)其發色機制也還未完全明確。因此，該技術的實際應用還需要更深入細致的研究。

2.2 等離子體活化水(plasma activated water, PAW)

PAW指等離子體處理后的水。已有多項研究顯示PAW可誘導肉制品中Mb形態的變化，從而實現發色。并且，PAW處理的肉制品在感官特性等方面都接近于直接添加亞硝酸鹽。PAW發色原理為等離子體處理下生成的NO、NO2等多種氮氧化物溶解于水生成亞硝酸根、硝酸根等[反應式(12)～(15)]，后者被還原生成了NO。并且，PAW呈弱酸性，其中的亞硝酸鹽會與H+反應并生成亞硝酸[反應式(16)]，更有利于發色[39]。PAW發色相關研究總結于表5。

(12)

(13)

(14)

(15)

(16)

作為一種新型發色方法，PAW具有發色效果顯著、氧化弱等優點，有效避免了等離子體產生的多種活性氧/活性氮基團引起的氧化損傷。但PAW的實際應用還需對等離子體處理條件，發色工藝等進行更深入的研究。等離子體工作氣體(如空氣、氮氣、氧氣、氬氣等)及作用方式(如介質阻擋放電，等離子體射流等)都對PAW中各種成分及其含量有顯著影響。例如，INGUGLIA等[45]分別對水進行了空氣和氮氣離子體射流處理，結果顯示，2種條件下處理10 min后所得PAW中亞硝酸含量分別為90～184 mg/kg、3～17 mg/kg。目前關于PAW發色的研究還集中在效應研究階段，對其發色工藝及其可能的負面作用都還鮮有涉及。因此，需要根據樣品不同對PAW制備及發色條件、對樣品各成分的影響等進行更深入細致的研究。

表5 PAW在肉制品發色中的應用Table 5 Applications of PAW in coloring of meat products

3 物理化學耦合發色

除上述化學和物理方法外，還有研究顯示使用物理、化學耦合方法能更有效改變Mb結構而實現發色。類似于PAW，冷等離子體處理能夠顯著增加植物提取物中亞硝酸根和硝酸根等發色基團的含量，后二者在植物中各種還原劑的作用下被還原生成NO，從而實現發色。本文將物理化學耦合發色的相關研究總結于表6。對影響該方法的因素、可能生成的副產物及其影響等都還需進一步深入研究。

表6 物理化學耦合技術在肉品發色中的研究Table 6 Study on the physical and chemical coupling methods in coloring of meat products

4 結語

目前已有的通過改變Mb結構而發色的化學、物理方法中，直接添加亞硝酸鹽仍最常用，其不僅能改善肉品色澤，還具有抑菌、改善風味等作用，但其安全性是最受關注的問題。因此，提高亞硝酸鹽的使用安全性以及尋找亞硝酸鹽有效替代物一直都是肉制品生產和研究的重要內容。植物源發色劑作為一種新型天然發色劑，具有來源廣泛、發色效果佳等優點，但也存在對產品風味產生一定負面影響、抑菌能力弱、發色效果受多種因素制約等不足，降低其對產品風味等的影響和標準化生產與應用是其未來應用的重要研究內容。NO和CO氣體發色均具有發色快、效果好且穩定等優點，但前者具有極強的刺激性，后者具有極大的安全隱患，且CO發色的產品所具有的長期穩定紅色還有掩蓋腐敗變質的弊端。因此，提高氣體發色工藝的安全性和發色后肉制品的食用安全性等都需要深入研究。CP作為一種新型非熱加工方法，其本身及PAW都具有發色作用，是亞硝酸鹽的一種可能替代方案，但也具有對被發色樣品造成氧化等負面影響。優化CP發色的工藝參數和減弱其對發色樣品的負面影響是該技術實際應用所需解決的瓶頸問題。物理化學耦合方法作為新型肉品發色方法，其優勢及可能的不足都需進一步的研究。本文內容可為相關研究和產業應用提供參考。