超高效液相色譜-串聯四級桿質譜聯用法測定14種蔬菜中滅蠅胺的殘留

俞所銀，閆晴，梁佳

1(上海市質量技術監督檢驗技術研究院，上海，200233)2(浙江海洋大學 食品與藥學學院，浙江 舟山，316022) 3(浙江省海產品健康危害因素關鍵技術研究重點實驗室，浙江 舟山，316021)

滅蠅胺(cyromazine)是一種用于防治多種葉菜類蔬菜、茄果類、豆類的美州斑潛蠅、豆桿黑潛蠅、蔥斑潛葉蠅等的低毒殺蟲劑。其對人體皮膚和眼睛具有刺激作用[1]；對動物胎兒可造成骨骼發育遲緩、存活率下降等問題[2]；在農作物生長過程中和動物體內都會降解代謝成三聚氰胺，經胃酸作用轉化為三聚氰酸，三聚氰酸與未轉化的三聚氰胺形成結晶，會導致公鼠膀胱腫瘤[3-6]。因此，國際組織和許多國家都已經制定了相應最大殘留限量標準。GB/T 2763—2019《安全國家標準食品中農藥最大殘留限量》規定了滅蠅胺在黃瓜、豇豆、菜豆、食莢豌豆、扁豆、蠶豆、豌豆中最大殘留量分別為1、0.5、0.5、0.5、0.5、0.5、0.5 mg/kg，但對韭菜、青菜、茄子、菠菜、包菜、雞毛菜、青椒、紅椒、番茄、大白菜、小青菜、芹菜等尚未明確規定。

現行有效的NY/T 1725—2009 《蔬菜中滅蠅胺殘留量的測定》檢測行業標準規定了黃瓜、番茄、菜豆、甘藍、大白菜、芹菜、蘿卜等蔬菜中檢出限0.02 mg/kg。但日常檢測發現受基質影響(韭菜樣最為明顯)，在滅蠅胺出峰時間處有干擾峰，分離度差，且優化梯度后會有其他蔬菜基質干擾，加標樣分析也往往因基質效應而掩蓋，對非法添加微過量的樣品造成誤判，對蔬菜類質量安全監管帶來困難，對百姓飲食安全和身體健康也造成了潛在的風險。相關文獻報道過高效液相色譜法[7]、液相色譜-質譜法[8-11]、量子點熒光探針法[12]和超高效液相色譜-質譜聯用同位素內標法[13]對滅蠅胺殘留的檢測，此類方法存在適用基質單一、基質影響嚴重、操作繁瑣、保留時間過短和回收率低的不足。

故本文采用“乙腈提取/氮吹”前處理方法、基質曲線和超高效液相色譜-串聯四級桿質譜聯用法(ultra-high performance liquid chromatography-triple quadrupole mass spectrometry, UPLC-QQQMS)測定了韭菜、豇豆、黃瓜、青菜、茄子、菠菜、包菜、雞毛菜、青椒、紅椒、番茄、大白菜、小青菜、芹菜共14種日常送檢滅蠅胺殘留的新鮮蔬菜。改善了滅蠅胺在C18色譜柱上出峰早、基質效應影響判斷、方法適用范圍窄、操作繁瑣的問題，旨在為滅蠅胺在新鮮蔬菜上的風險評估、批量快速檢測上提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器、試劑與材料

韭菜、豇豆、黃瓜、青菜、茄子、菠菜、包菜、雞毛菜、青椒、紅椒、番茄、大白菜、小青菜、芹菜共14種新鮮蔬菜樣品均為日常抽檢樣品。

乙腈(色譜純)，美國Fisher公司；甲酸(色譜純)，美國ACS化學試劑；乙酸銨、氯化鈉(分析純)，國藥集團化學試劑有限公司。滅蠅胺標準品(純度≥99.9 %，100 μg/mL)，天津阿爾塔有限公司。

6500 Q-TRAP 三重四級桿串聯質譜儀，美國AB公司；Agilent 1290 超高壓液相色譜儀，美國Agilent公司；5804 高速離心機，德國Eppendorf公司；SK8210LHC 型超聲波清洗儀，上海科導超聲儀器有限公司；G560E 渦旋振蕩器，美國Scientific Industries；Milli Q 超純水器，美國Millipore公司；KD 200 氮氣吹掃儀，杭州奧盛公司；0.22 μm Filter Unit濾膜，天津博納艾杰爾科技有限公司；分析天平(感量0.1 mg)，上海梅特勒-托利多儀器公司。

1.2 標準溶液配制和標準曲線

準確移取滅蠅胺標準品，用乙腈溶解配制成質量濃度為1 μg/mL的標準儲備液。用乙腈逐級稀釋標準液，得到0.000 5、0.001、0.002、0.004、0.005、0.001 0、0.020、0.050和0.100 μg/mL的一系列純溶劑標準工作溶液。

1.3 樣品處理方法

按GB/T 8855抽取的新鮮蔬菜樣品取可食部分切碎、混勻、密封、作為試樣，表明標記，置于0～4 ℃冷藏保存待檢。另一部分-20 ℃冰箱保存備樣。

分別稱取10 g(精確至0.000 1 g)樣品于50 mL具塞玻璃管中，加入20 mL乙腈，渦旋1 min后超聲提取20 min；加5 g NaCl渦旋1 min后9 500 r/min離心2 min，取5 mL上清液40 ℃氮吹干，加入1 mL乙腈溶解，0.22 μm Filter Unit濾膜過濾，UPLC-QQQMS分析。

(1)乙腈提取：分別稱取10 g(精確至0.000 1 g)樣品于50 mL具塞玻璃管中，加入1 μg/mL、0.4 mL滅蠅胺標準儲備液(即40 ng/g)，加入20 mL乙腈，渦旋1 min后超聲提取20 min；加5 g NaCl渦旋1 min后9 500 r/min離心2 min，上清液0.22 μm Filter Unit濾膜過濾，UPLC-QQQMS分析。

(2)乙腈提取/氮吹：分別稱取10 g(精確至0.000 1 g)樣品于50 mL具塞玻璃管中，加入1 μg/mL、0.4 mL滅蠅胺標準儲備液(即40 ng/g)，加入20 mL乙腈，渦旋1 min后超聲提取20 min；加5 g NaCl渦旋1 min后9 500 r/min離心2 min，取5 mL 上清液40 ℃氮吹干，加入1 mL乙腈溶解，0.22 μm Filter Unit濾膜過濾，UPLC-QQQMS分析。

(3)QuEChERs鹽包：分別稱取10 g(精確至0.000 1 g)樣品于50 mL具塞玻璃管中，加入1 μg/mL、0.4 mL滅蠅胺標準儲備液(即40 ng/g)，加入20 mL乙腈，渦旋1 min后超聲提取20 min；加入QuEChERs鹽包[無水硫酸鎂與無水乙酸鈉的混合包(質量比4∶1，7.5 g)]，渦旋1 min后9 500 r/min離心2 min，取5 mL上清液40 ℃氮吹干，加入1 mL乙腈溶解，0.22 μm Filter Unit濾膜過濾，UPLC-QQQMS分析。

(4)QuEChERs法：分別稱取10 g(精確至0.000 1 g)樣品于50 mL具塞玻璃管中，加入1 μg/mL、0.4 mL滅蠅胺標準儲備液(即40 ng/g)，加入20 mL乙腈，渦旋1 min后超聲提取20 min；加入QuEChERs鹽包[無水硫酸鎂與無水乙酸鈉的混合包(質量比4∶1，7.5 g)]，渦旋1 min后9 500 r/min離心2 min，取上清液10 mL于固相萃取凈化管(無水硫酸鎂900 mg，N-丙基乙二胺300 mg，十八烷基硅烷鍵合硅膠300 mg，硅膠300 mg，石墨化碳黑90 mg)中，渦旋使充分混勻，3 000 r/min離心2 min，取上清液5 mL上清液40 ℃氮吹干，加入1 mL乙腈溶解，0.22 μm Filter Unit濾膜過濾，UPLC-QQQMS分析。

(5)SCX固相萃取柱：分別稱取10 g(精確至0.000 1 g)樣品于50 mL具塞玻璃管中，加入1 μg/mL、0.4 mL滅蠅胺標準儲備液(即40 ng/g)，加入20 mL乙腈，渦旋1 min后超聲提取20 min；加5 g NaCl渦旋1 min后9 500 r/min離心2 min，取5 mL上清液40 ℃氮吹干，加入0.1 mol/L鹽酸溶液定容至2 mL；轉入SCX強陽離子交換萃取柱中(甲醇、水各5 mL預淋活化)，2 mL 0.1 mol/L鹽酸溶液潤洗殘渣轉入SCX柱。依次水、甲醇5 mL淋洗，棄液抽干小柱，用7.5 mL氨水-甲醇(體積比5∶95)洗脫，收集洗脫液，40 ℃氮吹干，加入1 mL乙腈溶解，0.22 μm Filter Unit濾膜過濾，UPLC-QQQMS分析。

(6)CARB/SCX/PSA固相萃取柱：前處理步驟同(5)。

(7)MCX固相萃取柱：前處理步驟同(5)。

1.4 色譜條件

色譜柱：ACQUITY UPLC BEH HILIC(2.1 mm×150 mm×1.7 μm)；流動相：A相：含0.1%甲酸的5 mmol/L乙酸銨溶液，B相：乙腈；等度洗脫：0～5 min，80%A；柱溫為35 ℃，流速0.25 mL/min，進樣體積為0.5 μL。

1.5 質譜條件

采用電噴霧離子源正離子模式(electron spray ionization, ESI+)；多反應監測(multiple reaction monitoring, MRM)模式；霧化氣壓力0.276 MPa；輔助加熱器壓力0.138 MPa；氣簾氣壓力0.172 MPa；電噴霧電壓4 000 V；離子源溫度350 ℃。以離子對(母離子和2個子離子)的信息比較進行定性分析，以響應值最高的子離子為定量離子，滅蠅胺在MRM模式下質譜采集參數見表1。

表1 滅蠅胺質譜參數Table 1 Chromatogram parameters of cyromazine

2 結果與分析

2.1 質譜條件優化

將質量濃度為0.1 μg/mL的滅蠅胺標準液，不接液相色譜，使用手動針泵進樣方式直接連接質譜，根據滅蠅胺結構選擇ESI+下全掃描，確定目標物的分子離子，然后將分子離子作為母離子，在一定的碰撞能量和碰撞氣體，再次全掃描二級離子選取豐度相對較大、干擾相對較小的2個子離子分別作為定量、定性離子，并優化去簇電壓、碰撞能量值，質譜參數見表1，質譜圖見圖1。

a-定量離子MYA1；b-定量離子MYA2圖1 滅蠅胺標準品色譜圖Fig.1 The chromatogram of cyromazine注：MYA1、MYA2均為0.1 μg/mL，乙腈配制

2.2 色譜條件優化

2.2.1 色譜柱的選擇

根據滅蠅胺結構：三聚氰胺與1個三元碳環相連，正負電荷中心不重合，偶極矩非0，屬于極性較大的化合物，因此在反相色譜柱上很難被保留。使用C18反相色譜柱分析發現保留時間為1.0 min左右，幾乎沒什么保留，可以加入離子對試劑解決，但離子對試劑難以去除且容易污染色譜柱。正相色譜柱對極性化合物有較好的保留，能得到對稱的峰形，但正相色譜采用非極性流動相(如正己烷)，不利于離子化，響應低不易被檢測，而GB/T 20769—2008中450種農藥絕大數是極性或弱極性的化合物。因此，本實驗比較了Agilent SB-C18(2.1 mm×50 mm×1.7 μm)、UPLC-T3(2.1 mm×100 mm×1.8 μm)、ACQUITY UPLC BEH HILIC(2.1 mm×150 mm×1.7 μm)、氨基柱對滅蠅胺的分析。在酸性或高比例水相的流動相下(≥40%)氨基柱壽命短、因此氨基柱不適用。結果發現，在相同的質譜條件下，C18、T3柱上的滅蠅胺在0.80～0.90 min較早出峰，與有機溶劑峰或雜質峰易重合；HILIC色譜柱上滅蠅胺保留時間為2.00 min，分析時間短、峰形對稱良好，見圖1。因此確定了ACQUITY UPLC BEH HILIC作為分離色譜柱。

2.2.2 流動相的選擇

考察乙腈-甲酸水、甲醇-甲酸水、乙腈-甲酸/乙酸銨、甲醇-甲酸/乙酸銨溶液作為流動相對滅蠅胺的色譜峰和響應值的影響。結果發現，甲酸/乙酸銨比甲酸水的響應高出1.5倍，乙腈-甲酸/乙酸銨質譜響應和峰型上優于甲醇-甲酸/乙酸銨，因而選擇“乙腈-甲酸/乙酸銨”為流動相溶。進一步考察乙酸銨濃度差異，比較了含0.1%甲酸的水溶液、含0.1%甲酸的5、10、20 mmol/L乙酸銨溶液。結果發現，5、10、20 mmol/L乙酸銨溶液下滅蠅胺保留時間均在2.38 min，見圖2，選擇5 mmol/L低溶度的乙酸銨溶液有利于延長色譜柱、儀器使用壽命。而含0.1%甲酸的5 mmol/L乙酸銨溶液獲得更好的峰形，這主要是在ESI+模式下電離時提供更多的H+，使離子化效率提高，從而提高分離效果和改善峰形。

a-定量離子MYA1；b-定性離子MYA2圖2 韭菜基質中加標滅蠅胺的MRM色譜圖Fig.2 MRM chromatograms of cyromazine spiked in garlic chives matrix注：MYA1、MYA2均為2.0 μg/mL，韭菜基質加標樣

2.2.3 洗脫梯度的選擇

鑒于主要是對蔬菜中滅蠅胺殘留的定量分析，因此將先前優化的8 min/單針的梯度洗脫：0.25 mL/min，0～1 min、20%A，1～3 min、20%A～80%A，3～5 min、80%A，5～5.1 min、80%A～20%A，5.1～8 min、20%A；改為6 min/單針的等度洗脫：0～5 min、80%A，縮短了分析時間且得到了較好的保留。

2.3 樣品前處理方法的選擇和優化

對比已報道文獻中對使用過的固相萃取凈化發現，石墨碳黑粉、石墨/NH2串接柱均會吸附滅蠅胺，導致回收率下降；C18、NH2固相萃取柱色素、雜質吸附效果一般，進樣分析發現在目標物峰附近有雜質干擾；MCX固相萃取柱效果相對較好，回收率在65.4%～108.8%均有報道[12-13]。因此本文選擇干擾較強的韭菜為基質，加標樣進行比較：(1)乙腈提取、(2)乙腈/氮吹、(3)QuEChERs鹽包、(4)QuEChERs法、(5)SCX、(6)CARB/SCX/PSA和(7)MCX 固相萃取柱法，結果發現，QuEChERs鹽包因與干擾峰無法完全分離，導致平均加標回收率偏高；“乙腈提取/氮吹”、“MCX固相萃取柱法”平均加標回收率接近值，但“乙腈提取/氮吹”法的前處理操作更便捷；“乙腈提取/氮吹”法因濃縮后樣品的化合物響應強度遠遠大于目標物附近的雜質響應，目標物定量更準確，并且因濃縮后樣品的pH變化引起化合物峰面積更大且峰型對稱，結合檢測效率與成本，選擇“乙腈提取/氮吹”法為最佳前處理方法，數據見表2。

表2 不同前處理法韭菜中滅蠅胺的回收率(n=3)Table 2 Recoveries of cyromazine in garlic chives by different pretreatment methods (n=3)

2.4 方法學驗證

2.4.1 基質效應影響

選取14種陰性新鮮蔬菜作為空白樣品，按照“1.3”方法前處理，得到14種空白基質提取液。用乙腈逐級稀釋，得到0.000 5、0.001、0.002、0.005、0.020、0.050、0.100 μg/mL的一系列基質標準工作溶液。按“2.1”～“2.3”優化好的條件分析。外標法繪制基質標準曲線[其中，待測物質量濃度為橫坐標(X，mg/L)，對應定量離子對的峰面積為縱坐標(Y)]。樣品的基質效應(matrix effect，ME)=基質標準曲線斜率/溶劑繪制的標準曲線斜率，當ME值越接近1時，表明樣品的基質效應越小[14];ME<1，基質抑制作用；ME>1基質增強作用。如表3所示，14種新鮮蔬菜基質均對滅蠅胺有明顯的抑制效應，且不同基質間存在明顯的區別，與郝國輝等[8]、徐煒楓[14]的研究結果一致。為了減小樣品的基質效應，提高方法分析的準確度，本文以空白樣品提取液配制的基質標準工作曲線，外標法定量進行試驗。

2.4.2 方法的線性范圍、檢出限和定量限

準確吸取質量濃度為1 μg/mL的滅蠅胺標準液，用14種空白基質溶液稀釋成0.000 5、0.001、0.002、0.005、0.020、0.050、0.100 μg/mL的一系列基質標準工作溶液；按本試驗優化的條件分析，以定量離子峰面積為縱坐標，滅蠅胺含量(μg/kg)進行線性回歸。結果表明，14種新鮮蔬菜中滅蠅胺在0.000 5～0.100 μg/mL內具有良好的線性關系，以信噪比S/N=3、S/N=10分別計算出檢出限、定量限，見表3。

表3 14種新鮮蔬菜中滅蠅胺的基質效應和線性方程、檢出限和定量限Table 3 Matrix effects, linear equations, limits of detection and limits of quantification of cyromazine in 14 kinds of fresh vegetables

2.4.3 方法的準確度和精密度

稱取14種(n=3)對應陰性蔬菜樣品，按GB/T 27404—2008《實驗室質量控制規范食品理化檢測》[15]的方法技術要求，分別添加2.0、4.0、20.0 μg/kg(定量限的1倍、2倍和10倍)[16]，按“1.3”方法前處理，連續測定6次，結果表明,方法的回收率80%～113%，精密度0.56%～7.21%，見表4。

2.5 實際樣品測定

采用已建立的方法對上海市、揚州市、蘇州市姑蘇區抽查新鮮蔬菜60份進行滅蠅胺檢測，其中38份樣品被檢測出，殘留量為0.8～40 μg/kg，其余均未被檢出；而對比現行有效NY/T 1725—2009《蔬菜中滅蠅胺殘留量的測定》標準,樣品中均未檢出滅蠅胺，且基質曲線回歸方程也無法測出，這主要由儀器靈敏度差異決定。6500 Q-TRAP ESI+掃描、MRM模式下1pg利血平，信噪比≥160 000∶1，50 fg和1 pg 利血平分別連續進樣10次，峰面積變異系數<2%，靈敏度高于液相色譜法數量級以上，因此優點樣品前處理更簡便、抗干擾強，實驗表明UPLC-QQQMS在測定蔬菜中滅蠅胺低含量殘留方法方面具有明顯優勢。

表4 14種新鮮蔬菜中滅蠅胺殘留量的回收率 和精密度(n=6)Table 4 Recoveries and relative standard deviations (RSDs) of cyromazine in 14 kinds of fresh vegetables(n=6)

3 結論

本試驗通過“乙腈提取/氮吹”前處理方法、基質曲線結合UPLC-QQQMS測定了韭菜、豇豆、黃瓜、青菜、茄子、菠菜、包菜、雞毛菜、青椒、紅椒、番茄、大白菜、小青菜、芹菜共14種日常送檢滅蠅胺殘留的新鮮蔬菜。該方法前處理簡單、操作便捷、檢測快速，方法重現性好、準確度高且精密度好，同時解決了現行NY/T 1725—2009 《蔬菜中滅蠅胺殘留量的測定》行業標準中基質影響造成HPLC分析方法的缺陷；為滅蠅胺在蔬菜上的風險評估、批量快速檢測提供參考。