烘烤條件對核桃發酵乳流變特性及風味的影響

伏威銘，焦博，張雨，陳奕穎，李嗣生，李薇，楊潔，王強*

1(新疆大學 生命科學與技術學院，新疆 烏魯木齊，830046)2(中國農業科學院農產品加工研究所，農業農村部農產品加工重點 實驗室，北京，100193)3(中國農業科學院生物技術研究所，北京，100081)

植物基發酵乳一般是由發酵堅果、豆類、谷物和果蔬的水提取物、粉末懸浮液或均質漿液制成，在質地、感官以及長期貯存微生物的能力等方面類似于傳統發酵乳。目前植物基發酵乳面臨的挑戰主要是酸奶凝膠質地脆弱以及產品風味不佳[1]。盡管使用穩定劑和香精能在一定程度上解決這些問題，但穩定劑和香精的存在會使消費者降低購買欲望。通過工藝技術提升凝膠強度和風味是目前植物基發酵乳產業亟需解決的問題。

有研究表明核桃蛋白的等電點為4.8[2]，能夠在酸性環境下凝膠化，且核桃無豆腥味等不良風味，具備制作植物基發酵乳的潛力與優勢。核桃營養價值極高，脂肪含量高達52%～70%，其中大部分為油酸、亞油酸和亞麻酸等不飽和脂肪酸，還含有約24%的蛋白質和12%～16%的碳水化合物[3]。目前已在核桃中檢測出包括酚酸、類黃酮、水解和縮合單寧等大約120種酚類化合物[4]，經常食用核桃除了益智健腦、抗衰老外，還可改善人體肝臟及全身的脂質平衡，有助于避免和治療心臟病、2型糖尿病等慢性疾病。盡管目前核桃類飲品中接受度最高的是核桃露，但作為哈佛醫學院推薦食用的12種“超級食品”，核桃和酸奶的“跨界融合”，必然會引起消費者的關注和期待。

烘烤是植物原料常用的熱處理方式，核桃、花生等堅果在烘烤后可獲得誘人的風味和色澤，LIU等[5]發現(E，E)-2,4-癸二烯醛、1-辛烯-3-醇和吡嗪類物質是烤核桃的特征風味物質，賦予其強烈的烘烤香和焦糖香，減少了青草味和生味等令人不悅的氣味。然而核桃在烘烤后會對植物基發酵乳的風味產生何種影響還不得而知。此外，強烈的烘烤條件還會改變蛋白質結構和分子間(內)相互作用力，雷勇剛等[6]研究發現，大豆在120 ℃下烘烤30～60 min后制乳發酵，所得發酵乳的流變特性和物理性質均有所下降，但風味顯著提升。核桃經烘烤處理后是否會對其發酵乳的物理性質產生不利影響，還需進一步探討。本研究旨在探尋烘烤處理對植物基核桃發酵乳流變特性和風味的影響，并篩選出適宜的烘烤條件，在保證發酵乳凝膠強度的前提下，使其風味獲得極大提升。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

市售脫衣核桃仁，購于陜西長勝農產品有限公司；市售直投式發酵劑，科漢森有限公司；蔗糖、葡萄糖，均為食品級，北京萃鋒科技有限公司；2-辛醇、甲醇，均為分析純級，美國Sigma-Aldrich公司。

1.2 儀器與設備

R025烤箱，杭州老板電器股份有限公司；九陽料理機，九陽股份有限公司；AH-100D納米均質機，ATS工業系統有限公司；恒溫恒濕培養箱，北京陸?？萍加邢薰?；TA.XT plus質構儀，英國SMS公司；DHR-2型流變儀，美國TA公司；分光測色儀，杭州彩譜科技有限公司；DFS高分辨率氣質聯用儀，美國賽默飛公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 核桃烘烤處理

脫衣核桃仁經分選、除雜后，稱取500 g于烤盤中，放入烤箱分別以60、90、120、150 ℃烘烤15 min，得到不同烘烤溫度的脫衣核桃仁，并以未烘烤核桃仁為對照。

1.3.2 核桃發酵乳的制備

烘烤和未烘烤的脫衣核桃仁經榨油機壓榨，得到蛋白含量為(34.93±0.15)%、脂肪含量為(37.15±0.66)%、灰分含量為(4.62±0.03)%的部分脫脂核桃粉。將部分脫脂核桃粉以料水比1∶8(g∶mL)浸泡在去離子水中，并加入蔗糖(0.6 g/L)和葡萄糖(0.2 g/L)，經料理機磨漿后得到核桃漿。核桃漿經均質機500 bar 均質后得到核桃乳，在80 ℃、15 min滅菌后，按直投式發酵劑說明書用量(0.2 g/kg)進行接種，混勻后在(40±1) ℃下發酵9 h，再經4 ℃后熟24 h后得到核桃發酵乳。分別以RC表示未烘烤原料制作的核桃發酵乳，以R60、R90、R120、R150表示60、90、120、150 ℃烘烤原料制作的核桃發酵乳。

1.3.3 流變學測定

1.3.3.1 表觀黏度

參考王強研究團隊的方法，并加以修改[7]。將完成后熟的核桃發酵乳順時針攪打5次，再逆時針攪打5次，使用配備了鋁制平板(直徑40 mm，1 mm間隙)的DHR-2流變儀測定其表觀黏度?？刂茰囟群愣ㄔ?25±1) ℃，剪切速率范圍為0.1～100 rad/s，以線性取點的方式采集數據，每個樣品進行3次重復。

使用Herschel-Bulkley模型對所得數據進行擬合，模型可由公式(1)表示：

τ=τ0+kγn

(1)

式中：τ為剪切應力，Pa；τ0為屈服應力，Pa；k為稠度系數，Pa·sn；γ為剪切速率，s-1；n為流動特性指數。

1.3.3.2 頻率掃描

正式實驗前，所有樣品在恒定頻率1 Hz下進行應變掃描，以確定線性黏彈區。隨后控制溫度恒定在(25±1) ℃，設置應變振幅為0.1%(線性黏彈區內)，在0.1～10 Hz下進行頻率掃描，確定不同酸奶的黏彈特性。每個樣品進行2次重復。

1.3.4 質構特性測定

參考YANG等[8]的方法，并加以修改。使用配備了A/BE探頭的質構儀對所有樣品進行分析，測試條件如下：測前速度1 mm/s，測試速度1 mm/s，測后速度10 mm/s，測試應變為30%，觸發力為10 g。采用硬度、稠度和黏聚性對發酵乳的質構特性進行評價。每個樣品進行3次重復。

1.3.5 色度測定

使用分光測色儀對不同核桃發酵乳的色澤進行測定，在測色儀上直接讀取L*、a*和b*，每個樣品進行3次重復。

1.3.6 核桃發酵乳揮發性風味物質頂空固相微萃取-氣相色譜-質譜聯用檢測

固相微萃取條件參考GURKAN等[9]的方法，并加以修改。樣品前處理方法：稱取2 g核桃發酵乳于 25 mL 頂空瓶中，加入5 μL內標(2-辛醇，819 μg/mL，溶于甲醇)?；靹蚝笤?0 ℃下平衡10 min，插入活化后的DVB/CAR WR/PDMS SPME Arrow萃取頭，在50 ℃下萃取30 min，萃取完成后于GC進樣口解吸5 min。

GC條件參考LAKHLIFI等[10]的方法，并加以修改。選用TG-SMS石英毛細管(60 m×0.25 mm×0.25 μm)，采用SSL分流進樣，分流比10∶1，進樣口溫度250 ℃，載氣為氦氣，流量為1.2 mL/min。升溫程序：起始溫度為40 ℃保持2.5 min，以7 ℃/min升至70 ℃，然后以2 ℃/mL升至120 ℃，保持1 min，最后以20 ℃升至280 ℃并保持5 min。

質譜條件參考劉原野等[11]的方法，并加以修改。采用EI離子化方式，離子源溫度為280 ℃，電子能量為70 eV；掃描范圍為35～500m/z。

揮發性風味物質的定性與定量：使用TraceFinder 5.1軟件將化合物的解卷積質譜圖與現有的商業標準譜圖庫(NIST2017)中進行檢索匹配，根據化合物保留時間計算其保留指數，通過其計算值與數據庫中保留時間指數(retention index，RI)相比較，對化合物進行定性。以已知濃度的2-辛醇為內標，以揮發性物質與內標的峰面積比進行定量分析。

1.3.7 揮發性風味物質評價

參考廖林等[12]的方法，根據1.3.6獲得的核桃發酵乳中各揮發性風味物質的含量，查閱相應物質在水中的氣味閾值，并計算其香氣活性值(odorant activity value，OAV),如公式(2)所示：

(2)

式中：Ci為揮發性風味物質含量，μk/kg；Ti為該物質的氣味閾值，mg/kg。當0.1≤OAV≤1時，表明該風味物質只對總體風味起修飾作用；當OAV≥1時，表明該風味物質為特征風味物質，對總體風味貢獻較大。

1.3.8 感官評價

邀請8名感官評價人員(由4名男性和4名女性組成)對發酵核桃乳進行感官評價，核桃發酵乳的感官評價標準在參考RHB 104—2020《發酵乳感官評鑒細則》的基礎上進行適當調整，詳見表1。

表1 核桃發酵乳的感官評價標準Table 1 The standard of sensory evaluation of walnut fermented milk

1.4 數據處理

使用SPSS Statistics 19對數據進行單因素方差分析(ANOVA)，使用The Unscrambler X 10.4對數據進行主成分分析，其他數據采用Microsoft Excel 2016進行處理。

2 結果與分析

2.1 不同烘烤條件對核桃發酵乳流變學的影響

2.1.1 表觀黏度

根據前期預實驗，發現將核桃原料先烘烤后脫脂的工藝更適合核桃發酵乳產品開發，因此本研究所探討的問題均基于此工藝展開。表觀黏度是影響發酵乳口感的重要指標。如圖1所示，所有樣品的表觀黏度均隨剪切速率的增加而減小，說明核桃發酵乳的蛋白網絡結構和油滴可隨剪切速率的增加發生重排，是一種具有剪切稀化現象的假塑性流體[13]。但不同烘烤溫度處理核桃后所得的發酵乳，其表觀黏度具有一定差異。由圖1可知，核桃經烘烤后可提升發酵乳的表觀黏度，且當烘烤溫度為90 ℃時，可獲得最大的表觀黏度。此外，當剪切速率>35 rad/s時，所有樣品的表觀黏度出現輕微的剪切變稠，這可能是發酵乳中存在較大的聚集體，阻塞在平行板間隙中所致[14]。

采用Herschel-Bulkley模型對核桃發酵乳的流變結果進行擬合，結果如表2所示。所有樣品的相關系數R2均>0.995，說明該模型可以很好的擬合核桃發酵乳的流動曲線。τ0與樣品抵抗剪切作用的能力相關，而k與樣品的黏度相關。由表2可知，當烘烤溫度逐漸升高時，核桃發酵乳的τ0和k逐漸增大，在90 ℃時獲得最大值，并顯著大于其他各組(P<0.05)，表明此時核桃發酵乳黏度最大，且具有良好的抗剪切作用；當烘烤溫度繼續升高，τ0和k逐漸降低，且R150組和RC組間無顯著性差異(P>0.05)。王強研究團隊的研究表明，核桃蛋白的變性溫度為(99.48±0.20) ℃，因此在100 ℃以下的低溫烘烤過程中，核桃蛋白的變性程度較低，但蛋白質運動逐漸活躍，從而加劇了蛋白之間的相互作用，使得黏度增加[15-16]。當超過核桃蛋白的變性溫度后，其表面的疏水區域和內部的疏水鍵大量暴露，核桃蛋白在疏水力的作用下形成聚集體并逐漸變大，最后形成沉淀。有研究表明，這種聚集體的形成不僅會降低乳液發酵后的凝膠強度和表觀黏度，同時也會使發酵乳的顆粒感明顯增強[6]。

圖1 不同烘烤條件下核桃發酵乳的表觀黏度Fig.1 Apparent viscosity of walnut fermented milk with different roasting conditions

表2 不同烘烤條件下核桃發酵乳的流變參數Table 2 Rheological parameters of walnut fermented milk with different roasting conditions

2.1.2 頻率掃描

由圖2可知，在0.1～10 Hz的頻率范圍內，所有樣品均表現出頻率依賴性，表明不同烘烤條件下的核桃發酵乳均形成了不穩定的弱凝膠，且樣品的儲能模量(G′)>損耗模量(G″),彈性成分占優勢，具有類固體特征[17]。此外，當掃描頻率>6 Hz時，所有樣品的G′增長速率變大，可能是由于此時發酵乳中的液滴相互接近，形成了更強的網絡結構，因此其類固體特性更加明顯。

圖2 不同烘烤條件下核桃發酵乳的頻率掃描曲線Fig.2 Frequency scanning curve of walnut fermented milk with different roasting treatment

此外，烘烤處理也改變了發酵乳凝膠的動態剪切特性，隨著烘烤溫度增加至90 ℃，樣品在同一掃描頻率下的G′和G″逐漸增大，說明較低溫度(≤90 ℃)的烘烤有助于增強發酵乳凝膠結構。核桃作為一種富含糖、蛋白和油脂的原料，在烘烤過程中往往伴隨著美拉德反應的發生，有研究表明美拉德反應可使蛋白質發生共價交聯，增加蛋白質長鏈疏水性基團的含量，增強疏水相互作用，從而提升凝膠黏彈性[18]。除美拉德反應外，蛋白質凝膠強度的改變也可能與蛋白變性程度相關，LI等[19]發現隨著蛋白質變性程度的增加，大豆蛋白的游離巰基和二級結構含量減少，三級結構展開，其凝膠強度在網絡結構的重排和氫鍵的形成過程中逐漸增強，但當變性程度過高時(變性程度>86.11%)，由于蛋白質的聚集比去折疊更慢，導致其凝膠結構更加粗糙和不均勻，因此在較高的變性程度下，凝膠強度反而下降。在本實驗中，R90組的頻率掃描曲線均高于其他各組，表明核桃經90 ℃烘烤15 min后制作的發酵乳獲得了最強的凝膠結構。R120組和R150組的頻率掃描曲線又逐漸降低可能是由于較為劇烈的烘烤使核桃蛋白的變性程度加深，從而形成蛋白聚集體，在制乳后也更易形成不溶性沉淀，這些沉淀不利于蛋白分子間相互作用形成膠體分子團，因而在微生物發酵產酸后，形成的水合蛋白質網絡及凝膠結構也較弱[20]。RC組和R60組的G′在掃描頻率較高時增幅更為明顯，可能是由于90 ℃以上的烘烤降低了發酵乳凝膠的頻率敏感性(圖2)。

2.2 不同烘烤條件對核桃發酵乳質構特性和色度的影響

由表3可知，隨著烘烤溫度升高，核桃發酵乳的硬度、稠度和黏聚性的絕對值逐漸增大，當烘烤溫度為90 ℃時，其質構特性值達到最大值，且顯著高于其他各組(P<0.05)。之后，隨烘烤溫度的升高，核桃發酵乳的質構特性值逐漸降低，但始終高于RC組。結合頻率掃描(圖2)的結果可知，R90組的凝膠結構更均勻、強度更大，并賦予了發酵乳更強的質構特性。

表3 不同烘烤條件下核桃發酵乳的質構特性Table 3 Textural properties of walnut fermented milk with different roasting conditions

由表4可知，隨著烘烤溫度升高，核桃發酵乳的L*值呈現出先增大后減小的趨勢，并在R90組獲得最大值，且各組間存在顯著性差異(P<0.05)。這可能與此時核桃發酵乳的凝膠結構更加致密、均勻，從而使光線在發酵乳膠體表面形成了更多反射有關，這一結果與HERNANDEZ等[21]的結論一致。此外，過高的烘烤溫度會導致美拉德褐變產物劇增，這些著色物質也會使核桃原料顏色加深[22]進而影響核桃發酵乳的色澤。因此隨著烘烤溫度持續升高，核桃發酵乳的a*值和b*值顯著增大(P<0.05)，肉眼觀查到發酵乳顏色逐漸變黃變暗。

表4 不同烘烤條件下核桃發酵乳的色度Table 4 Chromaticity of walnut fermented milk with different roasting conditions

2.3 不同烘烤條件對核桃發酵乳風味物質含量的影響

由附表1(https://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1802.TS.20220318.1718.006.html)可知，從5種不同烘烤條件的核桃發酵乳中共鑒定出81種風味化合物，其中烷烴類11種，醛類22種，醚類1種，酯類5種，酮類11種，芳香類10種，醇類8種，酸類4種，呋喃類2種，吡嗪類7種。所有核桃發酵乳中的醛類物質種類最多、含量最高，其次是酮類物質。研究表明，醛類物質具有水果香和油脂香，是核桃油的主要呈香化合物[23]；其中異戊醛僅存在于高溫烘烤的核桃發酵乳中(R120組和R150組)，且大多數的醛類物質，如苯乙醛、(E,E)-2,4-壬二烯醛、3-糠醛和(E,E)-2,4-庚二烯醛等均會隨著烘烤溫度的升高，含量顯著增加(P<0.05)，說明90～150 ℃的烘烤有助于核桃發酵乳油脂香氣的提升。而酮類物質具有黃油味和果香味，是發酵乳的主要呈香化合物，其中2,3-戊二酮和3-羥基-2-丁酮具有令人愉悅的黃油味和乳脂味，其含量也隨烘烤溫度的升高而顯著增加(P<0.05)，表現出與酮類物質相似的趨勢。

醇類物質是所有核桃發酵乳中含量第三高的化合物，其產生主要與脂肪氧化還原有關[24]，烘烤對脂肪氧化具有一定的促進作用，因此如異丁醇、正己醇、1-辛烯-3-醇和異戊烯醇等醇類化合物含量均隨烘烤溫度由90 ℃升高至150 ℃而顯著增加(P<0.05)，并賦予核桃發酵乳酒香味、果香味和蘑菇味等宜人的風味。呋喃類物質和吡嗪類物質通常由美拉德反應產生，并伴有堅果味和巧克力味，在本實驗中，其主要存在于烘烤條件較為劇烈的樣品(R150)中。

由于本實驗中所檢測到的大部分烴類物質、醚類物質、酯類物質、芳香類物質和酸類物質的含量較低，閾值較高；因此這些化合物對不同烘烤條件下核桃發酵乳的風味貢獻度較低(OAV值0～1)，主要起風味修飾作用。

綜上所述，核桃發酵乳中的主要風味物質，如醛類、酮類、醇類、呋喃類和吡嗪類物質的含量均會隨烘烤溫度的升高而增加，表明烘烤有助于核桃發酵乳風味的提升，且當烘烤溫度高于90 ℃時這種提升更為明顯。

2.4 不同烘烤條件下核桃發酵乳揮發性風味物質的主成分分析

OAV≥1的揮發性風味物質可對總體風味起到較大的貢獻，且OAV越大，該物質的貢獻越大。由附表1可知，在不同核桃發酵乳中共鑒定出16種OAV ≥1的風味主體物質，其中(E)-2-辛烯醛、(E)-2-壬醛、(E,E)-2,4-壬二烯醛、(E,E)-2,4-癸二烯醛、正己醛、2,4-壬二烯醛、2,3-戊二酮、3-羥基-2-丁酮、正己醇、1-辛烯-3-醇、2-正戊基呋喃存在于所有處理組中；正戊醛是R90組和R120組特有的OAV ≥1的物質；而異戊醛、苯乙醛、2,6-二乙基吡嗪和2,3-二乙基-5-甲基吡嗪是R150組獨有的OAV ≥1的物質，以上4種風味化合物具有獨特的焦糖香氣，這與R150組在劇烈烘烤條件下發生的美拉德反應密切相關。

對16種OAV≥1的主體風味物質進行主成分分析，結果如圖3所示。其中主成分-1和主成分-2的方差貢獻率分別為70%和28%，累積貢獻率為98%(>85%)，即這兩個主成分能夠反映主體風味物質的整體信息。結合圖3-a和圖3-b可知，核桃經不同烘烤條件處理后得到的發酵乳風味存在較大差異。R90組和R120組位于x軸上方，其風味與(E)-2-辛烯醛、正戊醛和正己醛有較強的相關性，此時的核桃發酵乳油脂味、發酵味和清新的果香味較為明顯；R150組位于第三象限，其風味與異戊醛、苯乙醛、(E,E)-2,4-癸二烯醛、2,6-二乙基吡嗪和2,3-二乙基-5-甲基吡嗪密切相關，此時的核桃發酵乳具有典型的黃油味、烘烤香和類似巧克力的香味；RC組和R60組與這16種主體風味物質的相關性不強，因此這兩組核桃發酵乳的特征風味不如其他3組明顯。綜上所述，烘烤條件可對核桃發酵乳的特征風味產生影響，在不同烘烤條件下產生的風味物質能夠得到良好的分離。

2.5 不同烘烤條件對核桃發酵乳感官品質的影響

由表5可知，烘烤條件可顯著改變核桃發酵乳的感官品質(P<0.05)。就色澤而言，未烘烤的核桃發酵乳顏色呈灰白色，而120 ℃以上的烘烤則賦予核桃發酵乳黃褐色，上述烘烤條件均不能使核桃發酵乳在視覺上引起消費者的購買欲望。就風味而言，120 ℃以上的烘烤能賦予核桃發酵乳明顯的油脂香氣和烘烤香氣，使其在風味方面獲得消費者的青睞，然而這種過強的烘烤條件也會使核桃發酵乳的滋味具有明顯苦味和糊味，對其感官品質造成負面影響。相較之下，R90組的核桃發酵乳在色澤、滋味和組織狀態等方面均能使消費者獲得更好的感官體驗。感官評價的結果表明，核桃原料經90 ℃ 烘烤15 min后制乳發酵，可極大的提升核桃發酵乳的感官品質。

a-得分圖；b-載荷圖 1-異戊醛；2-苯乙醛、3-(E)-2-辛烯醛；4-(E)-2-壬醛； 5-(E,E)-2,4-壬二烯醛；6-(E,E)-2,4-癸二烯醛；7-2,3-戊二酮； 8-3-羥基-2-丁酮；9-正己醛；10-正己醇；11-1-辛烯-3-醇； 12-2-正戊基呋喃；13-2,6-二乙基吡嗪；14-2,3-二乙基-5-甲基吡嗪； 15-2,4-壬二烯醛；16-正戊醛圖3 不同烘烤條件下核桃發酵乳揮發性風味物質的主成分分析Fig.3 Principal component analysis of volatile flavor compounds in walnut fermented milk with different roasting conditions

表5 不同烘烤條件對核桃發酵乳感官品質的影響Table 5 Effects of different roasting conditions on sensory quality of walnut fermented milk

3 結論

核桃經烘烤后，其發酵乳的凝膠強度隨烘烤溫度的升高呈現出先增強、后減弱的趨勢，當烘烤溫度為90 ℃時，核桃發酵乳的凝膠強度最大，表觀黏度、G′和G″均高于其他各組。這種強凝膠結構也賦予了核桃發酵乳更高的硬度、稠度、黏聚性和亮度。此外，烘烤處理也極大的提升了核桃發酵乳的風味，90 ℃和120 ℃ 的烘烤可產生更多的(E)-2-辛烯醛、正戊醛和正己醛，賦予核桃發酵乳油脂香、發酵香和果香；150 ℃ 的烘烤則提升了發酵乳中異戊醛、苯乙醛、(E,E)-2,4-癸二烯醛、2,6-二乙基吡嗪和2,3-二乙基-5-甲基吡嗪的含量，賦予其黃油香、烘烤香和類似巧克力的香氣。然而120 ℃和150 ℃的烘烤會使核桃蛋白發生劇烈變性，導致發酵乳凝膠強度減弱。結合感官評價的結果可知，90 ℃烘烤15 min是制作核桃發酵乳的最佳烘烤條件。本研究探明了烘烤處理對核桃發酵乳流變特性和風味的影響，并篩選出了最佳的烘烤條件，提高了核桃發酵乳的品質，并為其工業化生產提供了理論支持和技術指導。