基于高通量測序技術的貴州不同類型細菌型豆豉菌群多樣性分析

王娜，陳萬軒，張偉萍，張劍霜

(貴州師范大學 生命科學學院，貴州 貴陽，550025)

豆豉是一類以大豆為原料，經過浸泡、蒸煮后，在微生物作用下分解原料中的各種成分，產生的具有特殊風味的發酵制品[1]，是我國特色食品之一，多產于四川、湖南、江西、貴州等地區，由于微生物種類的不同，豆豉可分為曲霉型豆豉[2]、毛霉型豆豉[3]、根霉型豆豉[4]和細菌型豆豉[5]。湖南、江西等地主要生產毛霉型豆豉與根霉型豆豉，貴州則以生產細菌型豆豉為主，一些貴州家庭通常將煮熟的大豆冷卻至30 ℃左右，在密閉空間里讓其自然發酵，待成熟至黃豆表面發白具有黏稠度的絲狀物，再加入蔥、姜、食鹽及其他香辛料繼續發酵成為一種特殊風味的豆制品[6-8]。

《中國藥典》記載豆豉具有解表、除煩、宣郁、解毒等功效。除此之外，研究表明豆豉中分離出的大豆異黃酮[9]、豆豉溶栓酶[10]、豆豉低聚糖[11]等化學成分，具有降解蛋白、抗凝血、溶解血栓、助消化等多種藥用功能。發酵過程中，豆豉在微生物分泌的蛋白酶、葡萄糖苷酶等的作用下，生產多肽、氨基酸、黃酮以及皂苷等多種活性物質，以此來發揮多種保健功能。陳怡等[12]對細菌型、毛霉型和曲霉型豆豉的抗氧化活性研究表明不同微生物發酵豆豉的抗氧化能力不同，豆豉中微生物種類與其化學組成的活性密切相關。

隨著人們對微生物的認識，更多學者認識到微生物與食品不同風味的形成有重要聯系，高通量測序技術使得食品微生物多樣性研究得以發展[13-19]。聶黔麗等[20]對遵義細菌型自然發酵干豆豉菌群結構及風味品質分析表明，該細菌型豆豉的主要菌群為芽孢桿菌屬(Bacillus)，次要菌群為乳酸桿菌屬(Lactobacillus)，二者協同發酵出具有獨特香味的遵義干豆豉；鄧高文等[21]基于高通量測序技術對貴州水豆豉自然發酵前后、調味后發酵3個階段的細菌菌群結構及多樣性進行研究，并從水豆豉中鑒定出枯草芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌和蠟樣芽孢桿菌等產蛋白酶較高的菌株；董蘊等[6]利用高通量測序技術對6個細菌型豆豉細菌多樣性進行了評估，并且建立了核心細菌類群與滋味品質相關性的網絡圖，得出葡萄球菌屬(Staphylococcus)和乳酸桿菌屬與豆豉酸味的形成呈正相關。然而，貴州豆豉微生物多樣性的研究多限于單一豆豉或不同發酵階段的微生物組成，而對貴州地區水豆豉、干豆豉和濕豆豉中的細菌組成差異少有報道。因此，本研究以貴州地區豆豉為研究對象，按DB 52/524—2007《豆豉》將其分為水豆豉、干豆豉、濕豆豉，利用高通量測序技術，探究3類豆豉中的細菌群落構成及其之間的差異，擬為貴州豆豉品質的標準化及其安全管理提供了理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 豆豉準備

濕豆豉SH1～SH2，實驗室自制；SH3～SH4，貴陽市云巖區農貿市場(26°35′35″N, 106°45′20″ E)，其工藝主要包括浸泡、蒸煮和自然微生物發酵，無輔料添加；干豆豉GH1～GH3分別采集自貴陽市烏當區農貿市場(26°37′59″ N, 106°45′46″ E)、貴州省遵義市湄潭縣農貿市場(27°46′06″ N, 107°28′32″ E)、貴州省貴安新區黨武鎮農貿市場(26°23′36″ N, 106°35′52″ E)，制作工藝包括浸泡、蒸煮和微生物發酵、烘炒(晾曬)以及少許鹽分添加；WH1～WH3分別為貴陽老干媽風味食品有限責任公司、貴州遵義市紅黃祿食品有限公司、貴州鄉下妹食品有限公司所生產的商品化水豆豉，制作工藝包括浸泡、蒸煮和微生物發酵、加入涼開水繼續發酵、添加鹽分、香辛料等。取上述豆豉樣品150 g左右，裝入無菌采樣管中，貯存于-20 ℃冰箱備用。

1.1.2 儀器與設備

5415D離心機、Realplex4S熒光定量PCR儀，德國Eppendorf公司；XP cycler PCR儀，杭州博日科技有限公司；2000c Nanodrop紫外-可見分光光度計，美國Thermo公司；Gel-Doc凝膠成像系統，美國Bio-Rad Laboratories公司；Q32866 Qubit2.0熒光計，美國Life Tech公司；2100核酸分析儀，安捷倫科技有限公司；NovaSeq 6000高通量測序儀，美國Illumina公司。

1.1.3 試劑

M0531高保真酶，杭州諾揚生物技術有限公司；A63881核酸純化試劑盒，美國Beckman Coulter公司；AP-GX-250G DNA凝膠回收試劑盒，杭州愛思進生物技術有限公司；Q32851雙鏈DNA高靈敏度熒光定量試劑盒，美國Life Tech公司；KK4824文庫定量試劑盒，上海默瑞生物科技有限公司；FC-410-1003基因測序試劑盒，美國Illumina公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 DNA提取

將不同編號的豆豉樣品攪拌均勻，根據DNA提取試劑盒說明書，結合SDS裂解液凍融法進行DNA提取，置于-20 ℃貯存，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物，滿足條帶清晰則進行下一步。

1.2.2 測序方法

以豆豉總DNA為模板進行細菌16S rDNA V4區域擴增。引物采用正向引物(515F:5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3′)和反向引物(806R:5′- GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)進行擴增。條碼序列采用特定的7 bp特定序列合成到序列中。DNA模板10 μL，高保真PCR試劑25 μL，前后F/R引物各3 μL(10 μmol/L)，ddH2O 6 μL。配制好的PCR體系按照如下反應條件進行PCR擴增：預變性98 ℃ 30 s，接下來25個循環：變性98 ℃ 15 s，退火58 ℃ 15 s，延伸72 ℃ 15 s，終延伸72 ℃ 1 min。經過PCR擴增后，通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測文庫大小，使用Qubit 2.0熒光定量儀測定文庫濃度，隨后在Illumina NovaSeq 6000 pair-end 2×150 bp平臺進行雙端測序。

1.2.3 下機數據處理

使用QIIME(v.1.8.0)軟件對下機數據進行處理，拆分和截去條碼序列和引物序列后使用Vsearch (v2.4.4)對每個樣品的序列進行拼接，得到原始數據，同時去除長度<150 bp、平均質量值<20、含有不明確堿基以及含有>8 bp的單核苷酸重復序列等低質量序列，去除嵌合體序列，得到最終的有效數據，再默認以97%相似度以上序列聚類成操作分類單元(operational taxonomic units，OTU)，使用默認參數挑選OTU的代表序列，基于SILVA128數據庫對代表序列進行物種注釋，進一步生成OTU列表，在各個分類水平上統計各樣本的群落組成，所有樣本中含量低于總序列0.001%的分類單元將被去除。

1.2.4 下機數據分析

序列數據分析主要使用QIIME和R包(v3.2.0)計算樣品的各項數據指標。使用QIIME軟件計算alpha多樣性指數，通過Chao 1、Shannon、Coverage指數來比較每個樣本的OTUs豐度、菌群多樣性以及樣本的文庫覆蓋率；Beta多樣性分析是通過QIIME軟件計算UniFrac距離度量，并繪制主成分分析圖、聚類圖比較樣本間的微生物組成關系；微生物群落組成分析是基于R包中Kruskal方法比較樣本間或組間各分類水平門、綱、目、科、屬的菌群組成結構，通過繪制維恩圖和門、屬水平分類圖進行分析。

2 結果與分析

2.1 序列豐富度及多樣性分析

通過對OTU的聚類和注釋的結果統計，得到不同分類水平上各個樣本的微生物類群組成數量，如表1所示。本次測序10個樣本共得到1 098 891條有效數據，884個OTUs。Shannon指數和Chao 1指數是衡量物種多樣性和豐富度的指數。Shannon指數越高，表示物種多樣性越大，Chao 1指數越高，表示物種豐富度越高。在10個豆豉樣品中SH的Shannon指數介于3.19～4.90，GH介于3.64～4.77，WH介于3.2～5.80。SH的Chao 1指數介于276～393，GH介于372～456，WH介于379～577。經秩和檢驗發現，隸屬于不同類型豆豉樣品中的細菌類群在Shannon指數(P>0.05)、Chao 1指數(P>0.05)均不具有顯著性差異，由此可見，貴州不同類型細菌型豆豉中的細菌多樣性和豐富度較為均一。結果表明，GH、SH和WH雖然制作工藝有所不同，但GH、WH是在SH的基礎上進一步干燥或加水后繼續發酵而成，后續加工過程中可能并未摻雜入大量其他細菌，因此3類豆豉的細菌類群較為相似。

由圖1可知在測序深度達到4 000條左右時，所有的Shannon稀釋曲線均已進入平臺期，說明細菌微生物多樣性不會隨之增加，表1中，每個樣本的有效序列數均達到100 000條，并且Coverage指數均>0.999，說明測序數據量足夠大、樣本的文庫覆蓋率廣，可以反映樣品中絕大多數的微生物物種信息。因而本研究的測序深度可以滿足后續分析要求。

表1 樣品16S rDNA測序情況及分類情況Table 1 Sequencing and classification of 16S rDNA samples

圖1 Shannon指數稀釋曲線Fig.1 Shannon index curve

2.2 樣品中共有和獨有的OTU聚類與統計

對測序獲得的有效數據進行聚類分析，以97%相似度以上的序列聚類成OTUs，并根據不同類型豆豉繪制維恩圖(圖2)。由圖2可知，SH、GH、WH中含有的OTUs分別是480、591、766，說明WH樣本中的細菌種類略多于GH和SH。SH和GH樣品中相同的OTUs有391個，SH和WH樣品中相同的OTUs有397個，GH和WH樣品中相同的OTUs有402個，說明三者微生物種群具有極大的相似性。3種豆豉樣品中共有的OTUs有337個，說明這些微生物在豆豉發酵過程中可能起著重要作用。

圖2 三種豆豉中的OTUs維恩圖Fig.2 Venn analysis of OTUs of three kinds of Douchi

2.3 細菌門水平上的分布特征

如圖3所示，10個送檢樣本共注釋了5個門類：厚壁菌門(Firmicutes)、變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、藍藻菌門(Cyanobacteria)以及極少數未被定義的其他門類。3類豆豉細菌組成在門水平上高度相似，其中厚壁菌門和變形菌門為主導菌門，對兩個菌門的相對含量進行秩和檢驗，發現在3組之間存在顯著性差異(P<0.05)，厚壁菌門在GH和WH中占絕對優勢，相對豐度分別為93.8%、80.8%，變形菌門在GH為5.4%，在WH中為18.2%，而在SH中主要菌門為變形菌門，次要菌門為厚壁菌門，相對豐度分別為53.8%、46.1%。由此可見，盡管厚壁菌門和變形菌門作為3組豆豉的主要菌門，但其相對含量有明顯差異，分析原因是GH和WH在后發酵過程中經過曬干、加水以及等方式處理，改變了菌群生長環境，使其更適合厚壁菌門細菌生長，進而改變了豆豉中的微生物菌群結構。

圖3 基于門水平3種豆豉樣本的相對豐度比較Fig.3 Comparative analysis of relative abundance of bacterial groups in three kinds of Douchi at phylum level

2.4 細菌屬水平上的分布特征

2.4.1 屬水平分類

基于屬水平上的分類學注釋結果，對3種豆豉中最具優勢的10個屬繪制分類圖，如圖4所示，GH中主要的細菌類群為芽孢桿菌屬、變形桿菌屬(Proteus)、葡萄球菌屬、普羅威斯登菌屬(Providencia)以及短芽孢桿菌屬(Brevibacillus)，豐度逐個降低；SH中依次為芽孢桿菌屬、普羅威斯登菌屬、變形桿菌屬、特斯布斯菌屬(Trabulsiella)與短芽孢桿菌屬；WH則主要由芽孢桿菌屬、四聯球菌屬(Tetragenococcus)、魏斯氏菌屬(Weissella)、不動桿菌屬(Acinetobacter)、腸球菌屬(Enterococcus)、變形桿菌屬、短芽孢桿菌屬和葡萄球菌屬組成。GH、SH和WH中均以芽孢桿菌屬為優勢菌屬，其平均相對豐度分別為93.0%、74.3%、42.3%，秩和檢驗結果顯示，3類豆豉中芽孢桿菌屬相對豐度無顯著性差異(P>0.05)，表明芽孢桿菌屬細菌類群在3種類型豆豉的制作過程中較為恒定。此外，由圖4可知，4個SH樣本以及3個WH樣本間的菌屬組成存在一定差異性，可能原因為SH1、SH2是自制食品，而SH3、SH4樣品購買自當地生鮮市場，推測不同存放環境對此類發酵產品細菌群落有一定的影響。

2.4.2 屬水平細菌聚類分析

從物種和樣品兩個層面進行聚類分析，樣本先按照彼此之間組成的相似度進行聚類，再根據不同屬的相似度進行聚類，聚類結果縱向依次排列，可以了解樣品之間的關系以及屬水平上的群落構成。如圖5所示，共展示60個屬，同類型豆豉間的菌屬組成相似。WH中芽孢桿菌屬和四聯球菌屬占比最多，屬優勢菌屬，GH中芽孢桿菌屬、變形桿菌屬居多，而在SH中芽孢桿菌屬、普羅威斯登菌屬占比最多，且除樣本WH1之外，其余9個樣本均是芽孢桿菌屬相對豐度最高，說明芽孢桿菌屬為豆豉中的主導菌屬，這與圖4結論相同。10個樣本組可分為3個聚類，WH2、WH3為一類，GH1、SH3、SH4為一類，GH2、GH3、SH1、SH2和WH1為一類，由此也說明每一類豆豉樣本間的細菌組成并不完全相同，均存在一定程度的差異，10個豆豉樣本收集至貴州各地，因此可分析豆豉制作過程中微生物的組成與環境有一定的關聯性。

圖4 基于屬水平3種豆豉樣本的相對豐度比較Fig.4 Comparative analysis of relative abundance of bacterial groups in three kinds of Douchi at genus level

圖5 細菌在屬水平上的聚類熱圖Fig.5 Clustering heatmap of bacterial groups at genus level

2.5 主成分分析與相似性分析

主成分分析方法是一種通過降維處理展現樣本特定的距離分布的方法，不同顏色代表不同類型的豆豉樣本，距離遠近反應樣本的相似性大小。相似性分析方法主要用于分析高維數據組間相似性，為數據間差異顯著性評價提供依據。由圖6可知，主成分分析PC1解釋度為23.95%，PC2解釋度為22.66%，從樣品分布上看，SH1、SH2、SH3與SH4相聚較近，說明SH樣品菌群組成相似，相對來說更加穩定，GH1和GH3分布集中，但GH2與前兩者相差較遠，說明GH菌群結構相似，但環境對GH中的細菌也有一定的影響，WH1、WH2和WH3分布零散，三者的菌群組成差異相對較大，表明WH在制作過程中，微生物種類更易受到環境影響，且WH的細菌種類十分豐富。總體上看，SH與GH距離較近，與WH距離較遠，說明SH與GH較WH更為相似。此外，相似性分析結果表明，三類豆豉間的菌群差異大于組內菌群差異(R>0)，且差異顯著(P<0.05)。

圖6 豆豉樣品的主成分分析Fig.6 Principal component analysis of Douchi samples

3 討論

微生物是影響發酵豆制品高質量生產的關鍵因素，大量研究表明細菌在豆豉形成過程中發揮重要作用。有研究者針對細菌多樣性及動態變化進行研究，來探究微生物在豆豉不同發酵階段的影響；通過對微生物多樣性與豆豉中分解的化學成分展開分析，研究了豆豉藥用、保健成分與微生物的關聯；針對微生物多樣性與代謝物之間的相關性分析，探索微生物對豆豉中的酸味、香味形成的影響等。越來越多的研究表明不同微生物協調作用，影響著豆豉產品的形態，風味與營養價值功效。

本研究中，對貴州不同地區豆豉的細菌結構展開分析，比較了3類豆豉間的細菌組成相關性與差異性。共分析注釋了5個門類，96個屬類，在門水平上，厚壁菌門和變形菌門為優勢菌門，這與鄧高文等[21]研究結果一致，表明厚壁菌門和變形菌門可能是所有豆豉制品中的兩大關鍵門類，在不同種類豆豉獨特風味的形成中發揮主要作用。屬水平上，芽孢桿菌屬是主要菌屬[22-23]，其在干豆豉中的豐度最高，占比為93.0%，在水豆豉中豐度最低，占比為42.3%，同時還鑒定到變形桿菌屬、葡萄球菌屬、普羅威斯登菌屬、魏斯氏菌屬、不動桿菌屬、短芽孢桿菌屬、葡萄球菌等相對豐度排名前十的優勢菌，這些細菌在豆豉發酵過程中均發揮了重要作用，在這之中水豆豉幾乎包含了所有排名前十的優勢菌屬，細菌群落多樣性最高，種類繁多，而干、濕豆豉菌屬種類相對較少，多樣性相對較低，并且通過主成分分析、熱力圖等對3種豆豉的關系遠近進行可視化分析，表明水豆豉關系相對較遠，干豆豉與濕豆豉關系較近。這些結論擬為貴州豆豉制品標準化及安全管理提供了參考價值。

4 結論

本研究基于高通量測序技術分析了貴州水豆豉、濕豆豉和干豆豉間細菌組成及差異，3類豆豉的細菌組成有極大的相似性，均以芽孢桿菌屬為主導菌屬。從菌落關系上看，水豆豉相較于干豆豉與濕豆豉有較高的物種多樣性及細菌群落豐富度，水豆豉細菌群落結構復雜，濕豆豉與干豆豉的微生物組成親緣關系更近。在后續研究中，我們將結合傳統分離培養、代謝組分析等方法進一步探究3種不同豆豉風味的形成原因。