霞多麗葡萄營養系果實中酚類和香氣物質研究

劉政海，董志剛，李曉梅，譚敏，楊镕兆，賀晉瑜，趙旗峰

(山西農業大學果樹研究所,山西省葡萄與葡萄酒工程技術研究中心,山西 太原, 030031)

葡萄(Vitisvinifera)為多年生藤蔓植物，在我國有著悠久的葡萄種植歷史[1]，近幾年，我國從國外引進大量優良釀酒品種，但所有的品種，尤其是具有古老起源的品種會出現品種退化的現象，無性系選種是指在無性繁殖的果樹群體中，為了維持、提升品種原先具有的優良形狀對優良植株進行選取、繁育的工作[2]。PAGLARANI等[3]從35株葡萄中根據產量、串重、果實重、含糖量等指標，鑒定出最具發展潛力的14株營養系。以湖南省懷化縣的商品葡萄園4個紅色無性系和2個白色無性系為例，研究發現高山4號和白葡萄1號無性系中C6和C9揮發物含量最高[4]。釀酒葡萄品質主要取決于葡萄品種及相應的生態條件[5]。營養系選種是品種選育的有效方法，與常規育種方法相比具有成本低、見效快等優點[2]。酚類物質是葡萄酒最重要的風味物質之一，且具有生物活性功能[6]。果實的酚類物質組成和含量受生長條件、品種和果實成熟度等多種因素影響，但品種的基因型對其影響超越任何環境因素[7]。任瑞華等[8]以雷司令和小芒森為材料，發現高果皮百分比、較小果粒及果實糖含量高有益于葡萄果實酚類物質的積存。香氣是衡量葡萄果實和葡萄酒感官品質的重要指標，葡萄果實可揮發性狀態的香氣主要包括醛、芳香化合物、萜、酯類等，共同作用下形成葡萄酒最終的香氣。

霞多麗(Chardonnay)別名雪當利、莎當妮等，歐亞種，原產于法國勃艮第，是世界著名的釀造白葡萄酒的優良品種。在許多國家都有栽培，自1979年從法國引進中國，近幾年霞多麗在山西、山東、河北、內蒙古、新疆等省栽培面積逐漸增加，栽培適宜當地生態氣候條件的營養系決定著當地葡萄酒的品質和風格，國內外關于霞多麗葡萄酒品質的研究較多[9-10]，對霞多麗不同營養系的成熟果實香氣以及果實不同部位在生長發育階段的酚類物質研究甚少。本試驗以霞多麗4個營養系果實為試驗材料，對各個營養系的成熟果實的香氣物質的種類、含量、香氣活性值以及不同生長發育階段的酚類物質含量進行比較分析，以期選育出適宜黃土高原地區栽培的最優霞多麗葡萄營養系，為釀酒葡萄育種材料選擇提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料

以霞多麗4個營養系霞多麗76、霞多麗95、霞多麗96、霞多麗277為材料，引種于中法莊園，定植于2010年，以株行距0.8 m×2.5 m種植于山西農業大學果樹研究所釀酒葡萄采穗圃[N37.34°，E112.49°，海拔(846±5) m]，常規栽培管理，該地區屬溫帶大陸性季風氣候，年均溫10.6 ℃，160～180 d的無霜期，均為傾斜式單龍蔓“廠”字形立架栽培。霞多麗葡萄果實分別于盛花后40 d(2020年7月3日)、60 d(2020年7月23日)、80 d(2020年8月12日)、100 d(2020年9月1日)、110 d(達到生產成熟)進行采樣。

氫氧化鈉、正丁醇、碳酸鈉、氯化鉀、甲醇、醋酸鈉、氯化鋁、乙醇、亞硝酸鈉等，均為分析純；4-甲基-2-戊醇、乙醇、單寧酸、兒茶素，均為色譜純。

1.2 儀器與設備

50/30 μm固相微萃取(solid phase micro extraction, SPME)萃取頭(PDMS/CARDVB)，北京華爾博科技有限責任公司；7890-5975B氣相色譜-質譜聯用儀(gas chromatograph-mass spectrometer，GC-MS)、HP-INNOWAX毛細管柱，美國安捷倫公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 果實性狀調查

參照《葡萄種質資源描述規范和數據標準》對4個營養系成熟果實基本品質性狀的鑒定。

1.3.2 酚類物質含量的測定

采用Folin酚法測定總酚、單寧含量，用單寧酸等價表示(mg/g FW)；總類黃酮含量測定采用氯化鋁比色法，根據兒茶素(0～100 mg/L)標準曲線計算總類黃酮含量；采用香草醛-鹽酸法測定黃烷醇，結果以兒茶素等價表示(mg/g FW)[11]。

1.3.3 果實揮發性香氣物質的測定

1.3.3.1 揮發性香氣物質提取

將葡萄果實放進研缽內并且加入液氮，用研磨杵輕微敲碎葡萄使葡萄果實各部分分離，除去種子、果蒂，取50 g果肉并且往里面加1 g交聯聚乙烯吡咯烷酮，在液氮作用下，通過冷凍研磨機將果肉磨成粉末狀，將其裝入50 mL離心管中，靜置在4 ℃冰箱內12 h，每個重復裝2管，離心轉速為10 000 r/min條件下進行15 min，離心2次得到澄清葡萄汁液。

1.3.3.2 SPME及氣相色譜-質譜聯用儀(gas chromatograph- mass spectrometer，GC-MS)條件

在樣品瓶中放入澄清葡萄汁液5 mL，加入1 g NaCl、磁力轉子和10 μL(4-甲基-2-戊醇)內標后，蓋上樣品蓋子并且立刻將其放到磁力攪拌加熱臺上，在40 ℃ 條件下保持30 min后，將活化好的SPME萃取頭插入樣品瓶上部，在40 ℃下吸附30 min后，立即將萃取頭插入GC進樣口，在250 ℃溫度下解析8 min。

GC-MS條件：毛細管柱為60 mm×0.25 mm×0.25 μm，高純氦氣為其載氣，流速為1 mL/min，手動進樣不分流；程序升溫為50 ℃下1 min后，以3 ℃/min的速度升溫到220 ℃并保持5 min；質譜接口溫度為 280 ℃，離子源溫度為230 ℃，電離的方式為EI，電離能為70 eV，掃描范圍為20～350 u。

1.3.3.3 香氣物質定性和定量

香氣物質定性：根據GC-MS分離得到的質譜全離子掃描圖譜，將與標樣一樣的香氣物質進行定性。對于沒有標樣的香氣物質，將其與己有文獻相似圖譜進行比對，還可使用計算機檢索NIST 11標準庫進行半定性。

香氣物質定量：根據葡萄的揮發性香氣濃度高低，用目標香氣的標準品制備香氣物質標準曲線，根據標準曲線對果實中相應香氣物質進行定量，如果香氣物質沒有標樣，可以根據與香氣化合物碳原子數接近的或者化學結構接近的標樣進行半定量。

1.4 統計分析

利用Excel 2019、SAS 9.2進行數據分析與繪圖。

2 結果與分析

2.1 霞多麗葡萄營養系果實基本品質比較

霞多麗葡萄4個營養系成熟果實基本品質如表1所示，霞多麗95平均穗重、果穗長寬均顯著高于霞多麗76(P<0.05)；4個營養系果梗長無顯著差異。霞多麗277可溶性固形物分別比霞多麗76、霞多麗95、霞多麗96高15.73%(P<0.05)、10.81%(P<0.05)、14.12%(P<0.05)；霞多麗76固酸比、果形指數顯著高于其他3個營養系；霞多麗277皮肉比為0.23，顯著高于其他3個營養系；霞多麗葡萄4個營養系百粒重為2.45～3.00 g，其中霞多麗76的種子百粒重顯著高于霞多麗95和霞多麗277(P<0.05)；霞多麗96的pH值顯著低于其他3個營養系。

表1 霞多麗葡萄4個營養系果實基本品質Table 1 Basic quality of Chardonnay grape fruit from four clones

2.2 霞多麗葡萄營養系果實酚類物質比較

2.2.1 霞多麗葡萄營養系果皮和果肉中單寧含量比較

霞多麗4個營養系盛花后不同時期果皮中單寧含量如圖1-A所示。單寧含量從盛花后40 d至果實成熟期呈先下降又上升的趨勢，盛花后40 d時，霞多麗96果皮中單寧含量為14.23 mg/g，顯著高于其他3個營養系；霞多麗96果皮中單寧含量在5個發育期含量均較高，在果實成熟期霞多麗96果皮中單寧含量顯著高于霞多麗76和霞多麗95。

霞多麗4個營養系果肉中單寧含量如圖1-B所示。4個營養系果肉中單寧含量呈先下降后上升的趨勢，在盛花后40 d時，霞多麗277果肉中單寧含量為5.41 mg/g，顯著高于其他3個營養系，霞多麗277在盛花后60、80 d時下降幅度較大，但在果實完全成熟時霞多麗277果肉中單寧含量顯著高于霞多麗76和95。霞多麗95在盛花后100 d，果肉單寧含量為2.24 mg/g，分別比霞多麗76、霞多麗96、霞多麗277高33.89%(P<0.05)、204.70%(P<0.05)、48.21%(P<0.05)。霞多麗96果肉中單寧在盛花后60 d、盛花后80 d、果實成熟期含量分別為5.39、2.62、3.21 mg/g，顯著高于其他3個營養系。

2.2.2 霞多麗葡萄營養系果皮和果肉中總類黃酮含量含量比較

如圖2-A所示，為霞多麗葡萄營養系盛花后不同時期果皮中總類黃酮含量，其中從盛花后40 d起果皮中總類黃酮含量逐漸下降而后又上升的趨勢。霞多麗4個營養系果皮中總類黃酮含量在各時期差異基本一致，其中霞多麗96果皮中總類黃酮含量在盛花后40 d、盛花后60 d、盛花后80 d、盛花后100 d和果實成熟期的含量均顯著高于其他3個營養系。

由圖2-B中霞多麗4個營養系果肉中總類黃酮含量可知，總類黃酮含量從盛花后40 d至果實成熟期總體呈下降趨勢。其中霞多麗96果肉中總類黃酮含量在盛花后60 d以及盛花80 d含量分別為0.18、0.13 mg/g，均顯著高于其他3個營養系。在盛花后40 d和果實成熟期，霞多麗277果肉中總類黃酮含量分別為0.26、0.09 mg/g，均顯著高于其他3個營養系。

2.2.3 霞多麗葡萄營養系果皮和果肉中黃烷醇含量比較

霞多麗4個營養系盛花后不同時期果皮中黃烷醇含量如圖3-A所示，在霞多麗葡萄在成熟的過程中黃烷醇含量先下降后上升，在盛花后60 d，霞多麗96果皮中黃烷醇含量為11.09 mg/g，顯著高于霞多麗95和霞多麗277。霞多麗96果皮中黃烷醇含量在盛花后40、80、100 d及果實成熟期顯著高于其他3個營養系。

A-果皮；B-果肉圖1 霞多麗葡萄營養系盛花后不同時期果皮和 果肉中單寧含量Fig.1 Skins and flesh tannin content in clones of Chardonnay grape at different periods注：不同字母表示差異顯著(P<0.05)(下同)

A-果皮；B-果肉圖2 霞多麗葡萄營養系盛花后不同時期果皮和 果肉中總類黃酮含量Fig.2 Skins and flesh total flavonoids content in clones of Chardonnay grape at different periods

霞多麗4個營養系不同時期果肉中黃烷醇含量如圖3-B所示，霞多麗4個營養系在盛花后40 d時，果肉中黃烷醇含量較高，在盛花后80～100 d時果肉中黃烷醇含量降到最低，在果實成熟期，霞多麗277果肉中黃烷醇含量為0.26 mg/g，分別比霞多麗76、霞多麗95、霞多麗96高73.83%(P<0.05)、171.47%(P<0.05)、35.38%(P<0.05)。

A-果皮；B-果肉圖3 霞多麗葡萄營養系不同時期果皮、果肉中黃烷醇含量Fig.3 Skins and flesh flavanols content in clones of Chardonnay grape at different periods

2.3 霞多麗葡萄營養系果實中香氣比較

2.3.1 霞多麗葡萄營養系成熟果實中香氣物質種類

霞多麗葡萄營養系成熟期果實中香氣種類數如表2所示，霞多麗4個營養系共檢測到96種香氣化合物，其中在霞多麗76果實中檢測到香氣種類最多，為95種。酯類物質主要是呈現果香味，具有使葡萄酒中各種香氣物質的平衡、融洽、協調的狀態的功能，酯類香氣物質在4個營養系果實中香氣種類最多，其中霞多麗76果實中酯類香氣種類最多為35種。萜烯類和降異戊二烯類大多具有怡人的果香、花香，是葡萄酒中品種香的主要組分，其對葡萄酒的香氣有著很大的奉獻，霞多麗76果實中萜烯及降異戊二烯類物質物質有17種。

表2 霞多麗葡萄營養系成熟期果實中香氣種類數Table 2 Number of aroma species in grape clones of Chardonnay at mature stage

2.3.2 霞多麗營養系成熟期果實不同香型香氣活力值(ordor active values，OAVs)比較

圖4所示為霞多麗4個營養系果實中各香氣類別的OAVs，OAV是香氣成分含量與嗅覺閾值的比值，霞多麗76水果香OAVs為10.72，分別比霞多麗95、霞多麗96和霞多麗277高78.71%(P<0.05)、74.04%(P<0.05)、76.56%(P<0.05)。霞多麗76果實中花香值OAVs為28.39，顯著高于其他3個營養系果實中花香OAVs(P<0.05)。霞多麗4個營養系果實中植物香和脂肪香差異不顯著，4個營養系植物香OAVs值均在26以上，而4個營養系脂肪香OAVs均低于2。

A-果皮；B-果肉圖4 霞多麗營養系成熟期果實中不同香氣類型香氣活力值Fig.4 Odor active values of different aroma types in Chardonnay clones at mature stage

3 討論

釀酒葡萄果實的基本品質、酚類物質、香氣物質等指標決定釀造葡萄酒的好壞。魏烈權等[12]通過測定葡萄果實中可溶性糖含量、可滴定酸含量、總酚含量、單寧含量等9項常規指標評價嘉峪關10個釀酒葡萄品種，測出黑比諾、佳美、美樂這3個品種在嘉峪關地區品質優于其他品種。譚偉等[13]研究發現白色品種小白玫瑰455在果實中種果皮的單寧含量高于果肉的單寧含量，這與霞多麗4個營養系在果皮中酚類物質高于果肉中酚類物質含量結論相符。不同發育時期，果實中單寧含量差異明顯[14]，霞多麗4個營養系果皮和果肉中單寧含量呈先下降后升高的趨勢，在后期形成更多的縮合單寧，霞多麗96和霞多麗277在果實完全成熟時單寧含量最高，含有不同聚體的單寧分子多，使得釀造的葡萄酒苦澀感更豐富。釀酒葡萄果實中酚類物質含量受品種、環境等因素影響，品種是其影響果實中酚類物質的主要內在因素[15]。張娟等[6]以多種紅色釀酒品種為試材分析了酚類物質含量，發現不同品種間果實中酚類物質含量差異顯著，其中葡萄皮中總酚含量為12～125 mg/100g，果肉中總酚含量為1.24～3.24 mg/100g。本研究表明霞多麗4個營養系果實酚類物質含量存在顯著差異。代紅軍等[16]研究水楊酸對赤霞珠葡萄白藜蘆醇、總類黃酮含量影響，研究表明，赤霞珠葡萄果皮中總類黃酮含量在幼果期和完熟期較高。本研究中霞多麗4個營養系果皮中總類黃酮含量在盛花后40 d和果實成熟期含量較高結論相似。胡麗等[17]在歐亞種和山歐雜種中檢測到12種黃酮醇物質，在雙豐葡萄中只檢測到4種黃酮醇物質，不同品種品系間黃酮醇種類和含量有明顯差異，霞多麗96果皮中和霞多麗277果肉中總類黃酮含量顯著最高，可能存在黃酮種類高于其他2個營養系。溫鵬飛等[18]以赤霞珠為試材研究土壤干旱對釀酒葡萄果肉中黃烷醇類多酚含量的影響，研究發現在果實發育過程中果肉中黃烷醇類多酚的積累模式并未受土壤干旱的影響而改變，并且在果實發育過程中黃烷醇類多酚的積累為幼果期含量最高，隨著果實的發育而逐漸下降，在果實成熟期時略有回升。這與本實驗霞多麗葡萄4個營養系在盛花后果肉中黃烷醇含量逐漸下降又有回升的研究結果基本一致。

同一產地釀酒葡萄品種不同，香氣組成的種類、含量及比例均存在明顯差異。秦歡等[19]以重慶3個白葡萄品種成熟果實研究材料，研究發現不同品種白葡萄果實香氣成分及含量、種類差異明顯。ROCHA等[20]以4種白葡萄品種為試材通過檢測分析，發現不同品種間關于香氣物質的濃度和種類有顯著差異。香氣物質的濃度和種類不同使得霞多麗4個營養系同一類香氣OAV不同，從而導致其香氣特征的差異。以意大利釀酒葡萄品種果實為材料，分析果實酚類物質含量和揮發性香氣成分，研究發現7個品種果實干果香、脂肪味/奶油味、烘烤味、橡木味和香料味OAV均低于1[21]，這與本實驗中霞多麗4個營養系脂肪香含量較低研究結果相似。

在果實成熟期，霞多麗96在果皮中單寧、總類黃酮、黃烷醇的含量優于其他營養系。霞多麗96果肉中單寧優于其他營養系。在霞多麗葡萄4個營養系中共測得96種揮發性香氣物質種類，其中霞多麗76醇類物質種類最多，且是檢測到的香氣種類最為豐富的營養系。霞多麗76營養系的水果香、花香OAVs均顯著高于其他3個營養系。在黃土高區產區，霞多麗96和霞多麗277可作為高酚類物質含量的霞多麗營養系，霞多麗76可作為具有豐富香氣物質種類和含量的營養系進行栽培。